江蘇典型稻蝦及稻蟹共作系統(tǒng)中除草劑殘留非靶向動(dòng)態(tài)篩查及污染特征

劉崇萬(wàn)，朱曉華①，徐志華，任 娣，孟 勇，劉 熠，唐建清

(1.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2.江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心，江蘇 南京 210017)

稻漁綜合種養(yǎng)是當(dāng)前我國(guó)生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)的主要模式之一，與單純的水稻種植相比，稻漁綜合種養(yǎng)模式增產(chǎn)增收效果顯著[1]。克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)和中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)是江蘇地區(qū)特色養(yǎng)殖品種，至2016年開(kāi)始推廣稻田養(yǎng)蝦、養(yǎng)蟹模式試點(diǎn)以來(lái)，成效顯著[2]。由于稻漁互促，稻田農(nóng)藥使用量可減少30%以上[1]，雖然水產(chǎn)養(yǎng)殖一般不使用除草劑，但除草劑作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)使用的主要農(nóng)藥仍然被大量使用[3-4]。除草劑通過(guò)面源徑流、本底殘留等途徑[5]，會(huì)進(jìn)入水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境并長(zhǎng)期積累，這給水產(chǎn)動(dòng)物帶來(lái)影響，如肝功能受損[6]、抗氧化能力降低[7]、干擾幼魚(yú)早期發(fā)育[4]和免疫功能下降[8]等。而且部分除草劑代謝和降解速度較慢，容易在水體及土壤中殘留[9-10]，加上除草劑種類(lèi)繁多、成分復(fù)雜，其對(duì)蝦、蟹及稻田種養(yǎng)環(huán)境造成的污染風(fēng)險(xiǎn)更加復(fù)雜[11]。有研究[12]表明，除草劑污染已成為水生生態(tài)系統(tǒng)植物種群退化和消亡的主要因素之一。

目前農(nóng)藥檢測(cè)方法主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中，液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜因具有檢出限低、準(zhǔn)確度高和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，逐漸被用于微量或痕量藥物殘留檢測(cè)。但由于不同種類(lèi)藥物的理化性質(zhì)差別較大，且上述儀器精密度相對(duì)較低，通常只能實(shí)現(xiàn)針對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似的同族或單一藥物的靶向檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多類(lèi)藥物同時(shí)非靶向篩查定性[13]。高分辨質(zhì)譜基于其超高的分辨率，在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品及短時(shí)間內(nèi)無(wú)法對(duì)分析物進(jìn)行條件優(yōu)化的情況下，通過(guò)準(zhǔn)確測(cè)定分子離子峰的精確質(zhì)量數(shù)、化合物同位素豐度比和二級(jí)碎片特征離子信息與基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索匹配，實(shí)現(xiàn)多組分未知化合物的非靶向篩查分析[14-15]。

綜合以上論述，以除草劑為研究對(duì)象，選取江蘇典型稻蝦及稻蟹養(yǎng)殖示范區(qū)，結(jié)合蝦、蟹養(yǎng)殖周期，動(dòng)態(tài)采集蝦、蟹及養(yǎng)殖環(huán)境(稻田水體及底泥)樣品，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF MS)對(duì)2種共作系統(tǒng)內(nèi)除草劑進(jìn)行動(dòng)態(tài)非靶向篩查，并對(duì)相對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)除草劑進(jìn)行外標(biāo)法定量分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期確定不同養(yǎng)殖時(shí)期2種共作系統(tǒng)中除草劑種類(lèi)和污染特征，從而為保障江蘇地區(qū)稻蝦及稻蟹產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1采樣地點(diǎn)

采樣點(diǎn)根據(jù)江蘇地區(qū)稻蝦及稻蟹養(yǎng)殖實(shí)際情況進(jìn)行選擇，每種模式各選擇3家代表性養(yǎng)殖企業(yè)，根據(jù)蝦、蟹養(yǎng)殖周期確定采樣時(shí)間及頻次，稻蝦系統(tǒng)分別于2021年3、4、5、6和7月各采集1次，稻蟹系統(tǒng)分別于2021年3、5、7、9和11月各采集1次，所有采樣工作均在每月第1個(gè)工作周集中完成。每次采樣均同時(shí)采集蝦、蟹及養(yǎng)殖環(huán)境(稻田水體及底泥)樣品。采樣點(diǎn)分布見(jiàn)表1。

表1 采樣點(diǎn)信息Table 1 The sample sites

1.1.2采樣方法

每家養(yǎng)殖企業(yè)內(nèi)選取3塊均勻分布的稻田作為3個(gè)固定采樣點(diǎn)。蝦、蟹樣品：隨機(jī)采集適量健康個(gè)體。稻田水樣品：采樣前用稻田水沖洗采水器3～4遍，在每個(gè)采樣點(diǎn)稻田不同位置采集3份距水面表層0.1～0.3 m的水樣2 L，混勻?yàn)?個(gè)樣，過(guò)篩絹后取1.5～2.0 L裝入無(wú)菌瓶中。稻田底泥樣品：在采集水樣的位置同時(shí)采集底泥，去除底泥中秸稈等雜質(zhì)，并將每個(gè)采樣稻田的3份樣品混勻?yàn)?個(gè)樣品，取200～500 g裝入無(wú)菌袋中。所有樣品采集后低溫保存，在24 h之內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃條件下冷藏，并于2 d內(nèi)完成前處理。

1.2 儀器與試劑

1.2.1儀器材料

X500R超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)SCIEX公司)；Beckman Allegra 30R臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)；CP225D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；Turbo Vap@ LV全自動(dòng)濃縮儀(瑞典Biotage公司)；Milli-Q純水儀(美國(guó)Millipore公司)；固相萃取柱Oasis HLB 150 mg/ 6 mL(美國(guó)Waters公司)；Pulverisette刀式研磨儀(德國(guó)Fritsch公司)；0.22 μm濾膜(天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備股份有限公司)；0.45 μm玻璃纖維濾膜(南京拓盈凱生物科技有限公司)；XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)。

1.2.2試劑

所有試劑均為色譜純或分析純級(jí)別。煙嘧磺隆純品(純度w為99%)及喹草酸等20種除草劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(100 mg·L-1，天津阿爾塔科技有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；甲酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；乙腈、甲醇、乙酸(色譜純，德國(guó)Merck公司)；N-丙基乙二胺(PSA美國(guó)Sepax公司)；C18色譜柱(美國(guó)Sepax公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)及分析方法

1.3.1樣品前處理

蝦、蟹樣品：將新鮮蝦剝殼、去頭和內(nèi)臟并拔掉腸腺后，取肉、黃混勻，經(jīng)高速絞肉機(jī)充分?jǐn)嚿⒕鶆?，密封袋封好，置?18 ℃條件下保存。將新鮮蟹打開(kāi)蟹殼后，取肉、黃混勻，經(jīng)高速絞肉機(jī)充分?jǐn)嚿⒕鶆?，密封袋封好，置?18 ℃條件下保存。稱(chēng)取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入200 μL 0.1 mol·L-1EDTA-2Na溶液，10 mL乙腈，渦旋振蕩20 min，于5 ℃條件下以10 000 r·min-1(離心半徑為94 mm)離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL玻璃管中，離心管中再加入相同體積EDTA-2Na溶液和乙腈，重復(fù)提取1次。合并兩次提取上清液于40 ℃條件下氮?dú)獯抵两?，用V(甲醇)∶V(φ為0.1%甲酸溶液)=1∶1混合溶液定容至1.5 mL，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，分別加入50 mg PSA吸附劑和20 mg十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑，充分渦旋5 min，以12 000 r·min-1(離心半徑為82 mm)離心5 min，過(guò)0.22 μm孔徑濾膜，待測(cè)。

稻田水樣品：將水樣先過(guò)0.45 μm孔徑玻璃纖維濾膜，準(zhǔn)確量取濾液500 mL，加入0.2 g EDTA-2Na，過(guò)預(yù)先用3 mL甲醇和3 mL超純水活化的Oasis HLB小柱，上樣后，用10 mL超純水淋洗小柱，并抽真空15 min，再用10.0 mL甲醇洗脫，洗脫液于40 ℃條件下氮?dú)獯抵两?，用V(甲醇)∶V(φ為0.1%甲酸溶液)=1∶1混合溶液定容至1.0 mL，渦旋1 min，過(guò)0.22 μm孔徑濾膜，待測(cè)。

稻田底泥樣品：剔除樣品中小石塊及植物殘?bào)w等雜質(zhì)，置于-20 ℃條件下預(yù)凍后凍干處理，研磨過(guò)250 μm孔徑尼龍篩，置于-40 ℃條件下存放。提取和凈化方法同上述蝦、蟹樣品。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取煙嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。分別移取20種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液及煙嘧磺隆準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液500 μL，用甲醇定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。上述標(biāo)準(zhǔn)溶液均置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3儀器方法

(1)液相色譜條件

Phenomenex Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；流速為0.4 mL·min-1；流動(dòng)相：A為φ=0.1%甲酸水溶液，B為φ=0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，3% B；1～2 min，3%～15% B；2～19 min，15%～60% B；19～19.10 min，60%～95% B；19.10～22 min，95% B；22～22.10 min，95%～3% B；22.10～25 min，3% B。

(2)質(zhì)譜條件

雙噴霧(twin spray)電離源，正離子模式(ESI+)，離子源溫度為550 ℃，噴霧電壓為5 500 V，去簇電壓為65 V，霧化氣(氮?dú)?壓力為440 kPa，氣簾氣(氮?dú)?壓力為280 kPa，輔助霧化氣(氮?dú)?為440 kPa。

采用TOF_MS_IDA_TOF MS/MS復(fù)合掃描模式；TOF MS掃描范圍(m/z)為100～1 000，TOF MS/MS 范圍(m/z)為50～1 000；觸發(fā)二級(jí)掃描的響應(yīng)預(yù)值為50 cps；IDA觸發(fā)10個(gè)子離子掃描；碰撞能量為35 eV；碰撞電壓擴(kuò)展能量為±15 eV。用TOF MS全掃描發(fā)現(xiàn)所有化合物，用TOF MS/MS對(duì)發(fā)現(xiàn)的化合物進(jìn)行MS/MS數(shù)據(jù)掃描，并將數(shù)據(jù)在標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)中進(jìn)行檢索。21種除草劑質(zhì)譜信息見(jiàn)表2。

表2 21種除草劑質(zhì)譜信息Table 2 The MS parameters of 21 herbicides

1.3.4分析及數(shù)據(jù)處理方法

本是為了方便工作的專(zhuān)用號(hào)段，成了一些人眼中的“通行證”“護(hù)身符”；本是正常的公務(wù)用車(chē)，因?yàn)橛辛恕疤厥馀铺?hào)”而成了一些人手中的“特權(quán)車(chē)”。一些人開(kāi)上這樣的車(chē)，往往對(duì)紅燈、應(yīng)急車(chē)道、專(zhuān)用車(chē)道視而不見(jiàn)，對(duì)禁止駛?cè)搿⒔雇＼?chē)等標(biāo)志置若罔聞，有的甚至百無(wú)禁忌，對(duì)執(zhí)法人員也敢惡語(yǔ)相加甚至拳腳相向。這些行為損害了公共利益，傷害了公務(wù)車(chē)形象，在社會(huì)上造成惡劣影響。遼寧在全省開(kāi)展“特權(quán)車(chē)”問(wèn)題專(zhuān)項(xiàng)整治，體現(xiàn)了著力解決官僚主義問(wèn)題、消除特權(quán)思想的主動(dòng)與自覺(jué)，值得稱(chēng)道。

采用SCIEX OS軟件采集數(shù)據(jù)和處理數(shù)據(jù)。只需在軟件中輸入目標(biāo)化合物分子式，軟件即可根據(jù)目標(biāo)化合物的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布比和MS/MS搜索庫(kù)結(jié)果，在無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下完成對(duì)目標(biāo)物的非靶向篩查。采用外標(biāo)法對(duì)非靶向篩查出的化合物進(jìn)行定量分析，基于定量結(jié)果對(duì)污染物種類(lèi)、來(lái)源和污染程度等特征進(jìn)行分析。最后，采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用GraphPad Prism 5.01軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖。

1.3.5生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法

參照張石云等[16]提出的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，采用風(fēng)險(xiǎn)熵(RQ)和混合風(fēng)險(xiǎn)熵(MRQ)對(duì)江蘇典型稻蝦及稻蟹共作系統(tǒng)中除草劑環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行綜合評(píng)估。RQ計(jì)算公式為

QRi=CMEi/CPNEi。

(1)

式(1)中，QRi為物質(zhì)i的風(fēng)險(xiǎn)熵；CMEi為物質(zhì)i實(shí)際監(jiān)測(cè)濃度，μg·kg-1(蝦、蟹及稻田底泥樣品)或μg·L-1(稻田水樣品)；CPNEi為物質(zhì)i預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度，μg·kg-1(蝦、蟹及稻田底泥樣品)或μg·L-1(稻田水樣品)。PNEC(CPNE)值采用ECOSAR軟件分析獲得。

MRQ為單個(gè)除草劑RQ值之和。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，污染物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)被分為4個(gè)等級(jí)：RQ值<0.01，為無(wú)明顯風(fēng)險(xiǎn)；0.01≤RQ值<0.1，為低風(fēng)險(xiǎn)；0.1≤RQ值<1，為中等風(fēng)險(xiǎn)；RQ值≥1，為高風(fēng)險(xiǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 除草劑非靶向定性篩查結(jié)果

采用實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)背景扣除功能(DBS)和信息依賴(lài)關(guān)聯(lián)掃描(information dependent acquisition，IDA)數(shù)據(jù)采集模式，同時(shí)采集樣品的一級(jí)MS和二級(jí)MS/MS譜圖。根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級(jí)質(zhì)譜和保留時(shí)間等信息，按照一級(jí)母離子質(zhì)量數(shù)偏差小于5×10-6、保留時(shí)間偏差小于0.2 min、同位素匹配閾值在30%范圍內(nèi)的要求查找類(lèi)似物，按照峰面積大于1×105且配對(duì)分?jǐn)?shù)(score)大于85的要求進(jìn)行篩查。圖1為不同采樣時(shí)間除草劑檢出頻次，可反映整體上除草劑在2種系統(tǒng)內(nèi)的污染分布情況。

2.1.1稻蝦共作系統(tǒng)中除草劑非靶向篩查結(jié)果

稻蝦共作系統(tǒng)中共檢出12種除草劑，分別為喹草酸、敵草隆、綠麥隆、滅草隆、環(huán)莠隆、氰草津、哌草磷、草特靈、煙嘧磺隆、雙草醚、氰氟草酯和乙氧氟草醚。如圖1(A)所示，在養(yǎng)殖初期(2021年3月)，生物(蝦肉、黃混合物)、稻田水和底泥樣品中除草劑檢出頻次分別為8、9和13；在養(yǎng)殖中期(2021年4、5和6月)，檢出頻次逐漸下降，至大規(guī)模成蝦出塘?xí)r期(2021年6月)，除草劑檢出頻次分別為0、1和4；養(yǎng)殖末期(2021年7月)，生物及稻田水樣品中均未檢出除草劑，只有底泥中除草劑檢出頻次為5。

A為稻蝦共作系統(tǒng)；B為稻蟹共作系統(tǒng)。圖1 不同采樣時(shí)間除草劑檢出頻次Fig.1 Frequency of herbicides detected in different sampling time

2.1.2稻蟹共作系統(tǒng)中除草劑非靶向篩查結(jié)果

稻蟹共作系統(tǒng)中共檢出除草劑11種，分別為雙苯酰草胺、乙草胺、草酮、禾草丹、芐嘧磺隆、滅草隆、氰草津、2,4-滴丁酯、莠去津、除草醚和草甘膦。如圖1(B)所示，在養(yǎng)殖初期(2021年3月)，生物(蟹肉、黃混合物)、稻田水和底泥樣品中除草劑檢出頻次分別為5、4和8；在養(yǎng)殖中期，2021年5月檢出頻次較少，但2021年7月檢出頻次較多，分別達(dá)到4、5和8；成蟹收貨時(shí)期(2021年9和11月)，在生物及稻田水樣品中檢出頻次均僅為1，但在底泥中檢出頻次為則分別6和2。

2.2 非靶向篩查確證除草劑定量分析結(jié)果

將2.1.1和2.1.2節(jié)篩選出的21種除草劑進(jìn)行外標(biāo)法定量分析，各采樣點(diǎn)樣品中不同除草劑定量分析結(jié)果見(jiàn)圖2，檢出濃度可代表某一除草劑污染程度及水平?？傮w上看，2種模式下，生物、稻田水和底泥樣品中除草劑檢出值總體上呈現(xiàn)隨養(yǎng)殖周期逐漸降低的趨勢(shì)，且稻田底泥樣品中除草劑檢出值總體上高于生物和稻田水樣品。

2.2.1稻蝦共作系統(tǒng)中高響應(yīng)值除草劑外標(biāo)法定量分析結(jié)果

45個(gè)蝦樣品(蝦肉黃混合物)檢出8種除草劑，分別為喹草酸、敵草隆、氰草津、綠麥隆、哌草磷、草特靈、滅草隆和環(huán)莠隆，其中，喹草酸、敵草隆和氰草津的檢出頻率較高，檢出率達(dá)到13.3%～20.0%。喹草酸含量為未檢出(ND)～(12.1±0.17) μg·kg-1，敵草隆含量為ND～(11.5±1.10) μg·kg-1，氰草津含量為ND～(11.2±0.36) μg·kg-1，其他5種除草劑含量為ND～(11.6±1.21) μg·kg-1。45個(gè)稻田水樣品檢出9種除草劑，分別為喹草酸、敵草隆、氰草津、綠麥隆、草特靈、滅草隆、環(huán)莠隆、煙嘧磺隆和雙草醚，其中，喹草酸、敵草隆和氰草津的檢出頻率較高，檢出率達(dá)到15.6%～22.2%。喹草酸濃度為ND～(22.5±2.47) μg·L-1，敵草隆濃度為ND～(16.7±1.65) μg·L-1，氰草津濃度為ND～(22.5±3.01) μg·L-1，其他6種除草劑濃度為ND～(16.4±2.34) μg·L-1。45個(gè)稻田底泥樣品檢出9種除草劑，分別為喹草酸、敵草隆、氰草津、綠麥隆、滅草隆、環(huán)莠隆、煙嘧磺隆、雙草醚和乙氧氟草醚，其中，喹草酸、敵草隆、氰草津、綠麥隆和煙嘧磺隆的檢出頻率較高，檢出率達(dá)到20.0%～46.7%。喹草酸含量為ND～(21.6±1.91) μg·kg-1，敵草隆含量為ND～(19.7±0.97) μg·kg-1，氰草津含量為ND～(29.5±3.20) μg·kg-1，綠麥隆含量為ND～(20.1±2.99) μg·kg-1，煙嘧磺隆含量為ND～(15.8±1.05) μg·kg-1，其他4種除草劑含量為ND～(21.6±3.38) μg·kg-1。

A、B和C分別為稻蝦共作系統(tǒng)DXia-HX、DXia-GXY和DXia-XY采樣點(diǎn)，D、E和F分別為稻蟹共作系統(tǒng)DXie-XH、DXie-TM和DXie-DS采樣點(diǎn)。A、B和C圖中，1為喹草酸，2為敵草隆，3為氰草津，4為綠麥隆，5為哌草磷，6為草特靈，7為滅草隆，8為環(huán)莠隆，9為煙嘧磺隆，10為雙草醚，11為氰氟草酯，12為乙氧氟草醚；D、E和F圖中，1為雙苯酰草胺，2為草酮，3為禾草丹，4為芐嘧磺隆，5為滅草隆，6為氰草津，7為2,4-滴丁酯，8為莠去津，9為乙草胺，10為除草醚，11為草甘膦。誤差線(xiàn)中上橫線(xiàn)表示平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤差，下橫線(xiàn)表示平均值-平均誤差。圖2 不同類(lèi)型樣品中除草劑殘留檢出值Fig.2 Value of herbicides detected in different samples

2.2.2稻蟹共作系統(tǒng)中高響應(yīng)值除草劑外標(biāo)法定量分析結(jié)果

45個(gè)蟹樣品(蟹肉黃混合物)檢出9種除草劑，分別為雙苯酰草胺、草酮、禾草丹、芐嘧磺隆、滅草隆、氰草津、2,4-滴丁酯、莠去津和乙草胺，但這些除草劑均只在1～2個(gè)樣品中檢出，檢出含量為ND～(15.6±0.65) μg·kg-1。45個(gè)稻田水體樣品檢出6種除草劑，分別為雙苯酰草胺、禾草丹、芐嘧磺隆、滅草隆、氰草津和2,4-滴丁酯，其中，禾草丹和滅草隆的檢出頻率較高，檢出率達(dá)到13.3%～26.7%。禾草丹濃度為ND～(11.2±1.01) μg·L-1，滅草隆濃度為ND～(11.7±2.03) μg·L-1，其他4種除草劑濃度為ND～(18.7±1.96) μg·L-1。45個(gè)稻田底泥樣品檢出9種除草劑，分別為雙苯酰草胺、草酮、禾草丹、芐嘧磺隆、滅草隆、氰草津、2,4-滴丁酯、莠去津和草甘膦，其中，雙苯酰草胺、禾草丹、芐嘧磺隆、滅草隆、2,4-滴丁酯和莠去津的檢出頻率較高，檢出率達(dá)到20.0%～33.3%。雙苯酰草胺含量為ND～(20.2±2.05) μg·kg-1，禾草丹含量為ND～(20.1±3.28) μg·kg-1，芐嘧磺隆含量為ND～(26.4±3.17) μg·kg-1，滅草隆含量為ND～(20.1±2.64) μg·kg-1，2,4-滴丁酯含量為ND～(19.5±2.43) μg·kg-1，莠去津含量為ND～(24.7±1.98) μg·kg-1，其他3種除草劑含量為ND～(25.3±2.71) μg·kg-1。

3 討論

3.1 高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)方法驗(yàn)證

在質(zhì)量濃度范圍為1.0～100.0 ng·mL-1時(shí)，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，并按檢測(cè)批次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(生物和稻田底泥樣品以提取液中相應(yīng)除草劑濃度進(jìn)行計(jì)算)。線(xiàn)性回歸分析結(jié)果顯示，21種除草劑線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998。以信噪比(S/N)為3和10時(shí)分別計(jì)算檢測(cè)方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果顯示，21種除草劑LOD均小于2 μg·kg-1，LOQ均小于5 μg·kg-1。在不同加標(biāo)水平(蝦、蟹和稻田底泥樣品為5、10和20 μg·kg-1，稻田水樣品為5、10和20 ng·mL-1)下進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量濃度水平做6個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 21種除草劑檢測(cè)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 The range of recovery rate and RSD of 21 herbicides

n=6。1)μg·kg-1為蝦、蟹和稻田底泥樣品加標(biāo)水平單位，ng·mL-1為稻田水樣品加標(biāo)水平單位。

如表3所示，21種除草劑在不同類(lèi)型樣品基質(zhì)不同批次之間的回收率相對(duì)穩(wěn)定，精密度均小于15%。以上結(jié)果表明，該研究采用的超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可同時(shí)適用于蝦、蟹以及稻田水體和底泥中除草劑類(lèi)農(nóng)藥高通量篩查和確證。典型陽(yáng)性樣品總離子流(TIC色譜圖)見(jiàn)圖3。

圖3 典型稻田水樣總離子流圖Fig.3 The total ion chromatogram of typical field water sample

目前采用高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行有毒有害物質(zhì)高通量篩查的研究較多，如許惠等[17]對(duì)涪陵地區(qū)表層水、土壤和沉積物中有機(jī)污染物進(jìn)行非靶向篩查，初步發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥、藥物和塑料添加劑等137種有機(jī)污染物，并對(duì)其中14種檢出豐度和頻率較高的物質(zhì)進(jìn)行外標(biāo)法定量分析。賴(lài)國(guó)銀等[18]建立了一種23種農(nóng)藥的快速篩查和定量檢測(cè)方法，并在廈門(mén)市周邊土壤進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用，檢測(cè)結(jié)果線(xiàn)性關(guān)系和回收率均符合要求。郭思言等[11]建立水產(chǎn)品中污染物的非定向快速篩查和測(cè)定方法，并對(duì)405個(gè)水產(chǎn)樣品進(jìn)行高通量篩查定性分析，通過(guò)初步篩查確認(rèn)樣品中存在三環(huán)唑、咖啡因和乙氧基喹啉3種污染物。上述研究結(jié)果表明，高分辨質(zhì)譜篩查方法具有快速、高通量、高靈敏度的特點(diǎn)，定量準(zhǔn)確，可用于未知化學(xué)風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)測(cè)分析。

3.2 江蘇典型稻蝦及稻蟹共作系統(tǒng)中除草劑污染特征和來(lái)源分析

稻蝦共作系統(tǒng)中，除草劑檢出頻次均呈現(xiàn)稻田底泥(39)>稻田水(22)>蝦(14)的規(guī)律，且蝦和稻田水樣品檢出除草劑的36個(gè)頻次中，2021年3、4和5月3個(gè)采樣周期檢出頻次分別為17、12和6。這說(shuō)明在稻蝦共作系統(tǒng)中，除草劑殘留主要集中于環(huán)境樣品中，尤其是底泥中，而在生物樣品中殘留較少，且殘留主要集中于養(yǎng)殖前期，其中，2021年3月為各基地蝦苗投放期，說(shuō)明各基地在未投苗前，稻田環(huán)境中就已經(jīng)存在除草劑殘留，到養(yǎng)殖中期(2021年5月)時(shí)，蝦和稻田水體中除草劑殘留逐漸減少，直至未檢出(2021年7月)，底泥中除草劑在采樣周期內(nèi)均有檢出，且沒(méi)有隨養(yǎng)殖周期呈現(xiàn)出變化規(guī)律。不同基地蝦苗來(lái)源不同，DXia-HX和DXia-XY養(yǎng)殖基地采用“繁養(yǎng)分離”模式，這種模式下蝦樣品檢出的除草劑可能來(lái)源于外源育苗系統(tǒng)；而DXia-GXY養(yǎng)殖基地采用“繁養(yǎng)一體、捕大留小”模式，這種模式下蝦苗從前1個(gè)養(yǎng)殖周期即開(kāi)始生長(zhǎng)在相應(yīng)稻田中，受養(yǎng)殖環(huán)境影響較大，檢出的除草劑來(lái)源于本身的養(yǎng)殖系統(tǒng)。養(yǎng)殖環(huán)境中除草劑檢出較多，推測(cè)可能是以下3點(diǎn)原因：(1)雖然在蝦養(yǎng)殖周期內(nèi)養(yǎng)殖基地不使用除草劑，但是在每年成蝦捕撈、轉(zhuǎn)為水稻種植后，由于稻田除草需要，可能會(huì)使用少量除草劑，但由于部分除草劑代謝和降解速度較慢，這些除草劑就會(huì)殘留在養(yǎng)殖環(huán)境中；(2)3個(gè)基地在上半年(3—7月)養(yǎng)蝦，但同時(shí)期所在地區(qū)其他大部分農(nóng)田在種植小麥以及少量農(nóng)田在種植其他豆類(lèi)、蔬菜和瓜果等農(nóng)作物，這些農(nóng)田會(huì)使用除草劑以保障農(nóng)作物正常生長(zhǎng)，而真正作用于作物上的農(nóng)藥僅占施用量的10%～30%[6,19]，其余大部分會(huì)流失到周邊環(huán)境中，從而造成水產(chǎn)品和環(huán)境中除草劑殘留風(fēng)險(xiǎn)；(3)“稻漁綜合種養(yǎng)”模式可顯著促進(jìn)稻田土壤中氮、磷和鉀等物質(zhì)積累[20-21]，有機(jī)質(zhì)不僅對(duì)除草劑具有增溶和溶解作用，而且因土壤中腐殖酸具有能與除草劑結(jié)合的特殊位點(diǎn)，其還對(duì)除草劑具有表面吸附作用[22]。除草劑(尤其是疏水性除草劑)在水體和底泥中的殘留分配與除草劑特性、施藥時(shí)間、水文和環(huán)境條件密切相關(guān)[23-25]，因此稻田底泥中除草劑檢出頻次和濃度均高于稻田水和蝦、蟹的原因尚有待進(jìn)一步深入研究。

稻蟹共作系統(tǒng)中，同樣呈現(xiàn)環(huán)境樣品中除草劑檢出較多的規(guī)律，尤其是稻田底泥中除草劑直到成蟹收獲期(2021年9和11月)仍有檢出，而此時(shí)除草劑在蟹和稻田水中幾乎沒(méi)有檢出，只有DXie-XH養(yǎng)殖基地在2021年9月采樣周期中有1例蟹樣品檢出乙草胺。但不同于稻蝦共作系統(tǒng)的是，在2021年7月采樣周期發(fā)現(xiàn)在3個(gè)稻蟹種養(yǎng)基地，蟹、稻田水和底泥中除草劑檢出頻次突然增加，分析其原因，成蟹稻田養(yǎng)殖周期涵蓋整個(gè)水稻種植周期，2021年7月正值水稻種植初期，雖然稻蟹種養(yǎng)基地為了避免除草劑等農(nóng)藥對(duì)蟹生長(zhǎng)及品質(zhì)的影響而不使用除草劑，但筆者實(shí)地調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)基地所在地區(qū)其他稻田仍會(huì)施用除草劑以實(shí)現(xiàn)水稻種植前期的田間管理，而由于基地并沒(méi)有在物理上隔開(kāi)稻蟹綜合種養(yǎng)區(qū)域與水稻單獨(dú)種植區(qū)域的進(jìn)排水系統(tǒng)或設(shè)置防飄散系統(tǒng)，未被作物吸收的除草劑可能會(huì)通過(guò)徑流、淋溶、揮發(fā)等途徑進(jìn)入稻蟹綜合種養(yǎng)系統(tǒng)。

3.3 江蘇地區(qū)稻蝦及稻蟹共作系統(tǒng)中除草劑污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)測(cè)

各除草劑生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果見(jiàn)圖4。定性定量結(jié)果顯示，稻蝦共作系統(tǒng)中主要檢出除草劑為喹草酸、敵草隆、氰草津、綠麥隆和煙嘧磺隆，稻蟹共作系統(tǒng)中主要為雙苯酰草胺、禾草丹、芐嘧磺隆、滅草隆、2,4-滴丁酯和莠去津。由圖4可知，生物樣品中，蝦樣品中綠麥隆和煙嘧磺隆以及蟹樣品中滅草隆和2,4-滴丁酯無(wú)明顯生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(RQ值<0.01)，其他除草劑均為低生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(0.011)外，其他除草劑均為中生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(0.11)。需要說(shuō)明的是，該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果是在一定條件下的相對(duì)概念，在后續(xù)研究中擬采用目前通用的定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系預(yù)測(cè)軟件，如T.E.S.T、TOPKAT等，再選取代表性化合物進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與預(yù)測(cè)。

1—生物樣品(蝦、蟹)；2—稻田水樣品；3—稻田底泥樣品。圖4 除草劑風(fēng)險(xiǎn)熵評(píng)估值Fig.4 RQ of the herbicides

稻蝦及稻蟹共作系統(tǒng)中不同種類(lèi)樣品除草劑污染程度由高到低均依次為稻田底泥、稻田水和生物樣品，且底泥中殘留除草劑幾乎均處于高生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。莠去津在水體中的半衰期達(dá)到10～15 d，能在水體中停留較長(zhǎng)時(shí)間[26]；另外，在稻蟹底泥中檢出1例草甘膦殘留，草甘膦具有明顯致癌風(fēng)險(xiǎn)[16]。目前稻漁綜合種養(yǎng)農(nóng)藥殘留研究主要集中于殺蟲(chóng)劑，除草劑殘留研究較少，張石云等[16]對(duì)云南哈尼梯田稻魚(yú)共作系統(tǒng)除草劑殘留情況研究發(fā)現(xiàn)梯田內(nèi)施用和殘留的除草劑對(duì)周邊水域環(huán)境存在潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，筆者研究結(jié)果與之基本一致。

我國(guó)目前已制定的水產(chǎn)品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(maximum residue limit，MRL)共有5種12項(xiàng)[27]，但均為殺蟲(chóng)劑類(lèi)農(nóng)藥。美國(guó)、日本和歐盟等國(guó)家和組織已制定相關(guān)除草劑類(lèi)農(nóng)藥MRL，如筆者研究檢出的芐嘧磺隆，美國(guó)規(guī)定其在龍蝦中MRL為50 μg·kg-1，歐盟、日本標(biāo)準(zhǔn)則為“一律限量”(0.01 mg·kg-1)，在養(yǎng)殖前期，部分批次產(chǎn)品芐嘧磺隆檢出濃度超過(guò)該限量，但收獲期蝦、蟹成品均符合該規(guī)定。受目前我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用藥水平制約，“一律限量”的制定可能會(huì)對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品出口貿(mào)易產(chǎn)生消極影響，因此我國(guó)目前尚未采用該限量標(biāo)準(zhǔn)。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《關(guān)于政協(xié)十三屆全國(guó)委員會(huì)第三次會(huì)議第4905號(hào)(農(nóng)業(yè)水利類(lèi)375號(hào))提案答復(fù)的函》中提及“進(jìn)一步完善農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)體系，推進(jìn)‘一律限量’標(biāo)準(zhǔn)制定”。2021年9月3日正式實(shí)施的GB 2763—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[28]中對(duì)稻谷中常見(jiàn)除草劑殘留限量做出明確規(guī)定?；谝陨险撌?，不能簡(jiǎn)單以歐盟、日本的“一律限量”標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)我國(guó)水產(chǎn)品，同時(shí)，需要關(guān)注除草劑在稻谷中殘留情況。目前關(guān)于除草劑在水體-底泥兩相間的遷移研究較多[29-31]，但除草劑對(duì)蝦、蟹等水產(chǎn)品與稻谷的雙重質(zhì)量安全隱患風(fēng)險(xiǎn)還不明確，后續(xù)有必要針對(duì)除草劑在稻田環(huán)境-水產(chǎn)品-水稻整個(gè)種養(yǎng)大環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化及其機(jī)制進(jìn)行更為深入的研究，為我國(guó)“一律限量”標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

4 結(jié)論

采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF MS)對(duì)江蘇典型稻蝦及稻蟹養(yǎng)殖示范區(qū)內(nèi)生物(蝦、蟹)及環(huán)境(稻田水、底泥)樣品中除草劑開(kāi)展整個(gè)養(yǎng)殖周期內(nèi)動(dòng)態(tài)非靶向篩查，稻蝦共作系統(tǒng)中篩查發(fā)現(xiàn)12種相對(duì)豐度及檢出率較高的除草劑，稻蟹共作系統(tǒng)為11種；并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行除草劑外標(biāo)法定量分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

(1)稻蝦共作系統(tǒng)中主要除草劑為喹草酸、敵草隆、氰草津、綠麥隆和煙嘧磺隆，稻蟹共作系統(tǒng)為雙苯酰草胺、禾草丹、芐嘧磺隆、滅草隆、2,4-滴丁酯和莠去津。

(2)除草劑殘留主要集中于環(huán)境樣品，尤其是底泥中，在蝦、蟹中殘留較少，且殘留主要集中于養(yǎng)殖前期，成品收獲期除草劑檢出頻次及濃度均較低。

(3)除草劑在蝦、蟹中總體上處于中生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(0.11)，尤其是稻田底泥中檢出的11種除草劑，有10種處于高生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)(RQ值>1)。

(4)江蘇典型稻蝦及稻蟹共作系統(tǒng)除草劑在各類(lèi)樣品中污染程度為稻田底泥>稻田水體>蝦和蟹，稻田底泥中殘留除草劑對(duì)周邊環(huán)境存在潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，收獲期蝦、蟹的除草劑殘留風(fēng)險(xiǎn)較小。