黃曲霉毒素B1對(duì)海鱸生長(zhǎng)性能、體成分、肝臟組織結(jié)構(gòu)及毒素殘留量的影響

■陳 冰 黃 文 趙紅霞 彭 凱

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東 省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

飼料霉變以及植物性蛋白原料替代魚粉導(dǎo)致水產(chǎn)飼料受霉菌毒素污染的概率增加[1]，因此霉菌毒素對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康的影響引發(fā)社會(huì)廣泛關(guān)注。水產(chǎn)飼料中常見的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌素、玉米赤霉烯酮等，其中黃曲霉毒素B1（AFB1）是已知的最強(qiáng)致癌物之一，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為一級(jí)致癌物，其毒性和致癌性極強(qiáng)，尤其對(duì)動(dòng)物肝臟的危害性較大[2]。然而，有關(guān)AFB1對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康影響的研究主要集中在畜禽，在魚或蝦等水產(chǎn)動(dòng)物上的報(bào)道較少。據(jù)報(bào)道，AFB1 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的生物學(xué)影響主要取決于飼料中AFB1的濃度以及動(dòng)物的種類、年齡、營養(yǎng)狀況和動(dòng)物的生長(zhǎng)環(huán)境[3]。不同動(dòng)物種類及生長(zhǎng)階段對(duì)AFB1 的耐受性不同，導(dǎo)致相關(guān)研究結(jié)果不一致，很難得出明確結(jié)論。AFB1 對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)的抑制作用是其毒性的主要表現(xiàn)形式之一，其負(fù)面作用還包括損傷肝臟和破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)[4]。飼料中添加AFB1 對(duì)羅非魚[5]、草魚[6]、鯉魚[7]、斑點(diǎn)叉尾鮰[8]、胡子鯰[9]、虹鱒[10]、紅姑魚[11]、凡納濱對(duì)蝦[12]及異育銀鯽[13]等水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)及肝臟健康的影響已有報(bào)道，但相關(guān)研究仍未見在鱸魚中進(jìn)行報(bào)道。

海鱸（Lateolabrax maculatus）是我國南方地區(qū)養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)肉食性魚類品種之一，其生長(zhǎng)速度快、營養(yǎng)價(jià)值高、味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者青睞。2021年，我國海鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量突破19 萬噸[14]，市場(chǎng)前景十分廣闊。相比雜食性魚類，海鱸等肉食性魚類對(duì)AFB1 的敏感性更強(qiáng)，耐受性更差[15]。AFB1 可在魚類的肝臟和肌肉中累積[16]，從而進(jìn)一步影響食品安全和人類健康。研究AFB1 對(duì)魚類生長(zhǎng)性能和肝臟健康的影響規(guī)律，有助于全面了解AFB1 對(duì)魚類的生物學(xué)作用，為合理開發(fā)藥物及科學(xué)研究提供參考。本試驗(yàn)旨在研究飼料中不同水平AFB1對(duì)海鱸生長(zhǎng)性能、體成分、肝臟組織結(jié)構(gòu)及肝臟和肌肉中AFB1殘留量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、酪蛋白和大豆?jié)饪s蛋白為蛋白源，面粉為糖源，魚油、豆油和大豆卵磷脂為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料，飼料組成及營養(yǎng)水平如表1所示。在基礎(chǔ)飼料上分別添加0（G0 組）、0.1（G0.1 組）、0.5 mg/kg（G0.5 組）和1.0 mg/kg（G1.0組）的AFB1（Sigma，USA），配制4組等氮等脂飼料。所有飼料原料過60 目標(biāo)準(zhǔn)篩，混合均勻后通過SLX-80 型雙螺桿擠壓機(jī)制成2.0 mm 顆粒飼料，55 ℃烘干后冷卻至室溫，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。飼料中AFB1 含量參照朱聰英等[17]方法測(cè)定，實(shí)測(cè)值為0、0.09、0.45 mg/kg和1.02 mg/kg飼料。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)，g/kg）

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所水產(chǎn)研究中心循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。選擇初始體重為（2.90±0.02）g的健康海鱸幼苗480尾，隨機(jī)分為4組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)40尾，隨機(jī)分配到12個(gè)圓柱形玻璃纖維桶（直徑80 cm×高70 cm、容積350 L），分別投喂4組試驗(yàn)飼料。采取飽食投喂方式，每天投喂2 次（07：00 和19：00），每天記錄飼料投喂量、死亡情況及水質(zhì)情況，試驗(yàn)期為56 d。試驗(yàn)期間采取自然光照，水溫25.5～27.7 ℃，鹽度1‰，溶解氧濃度＞6.0 mg/L，氨氮濃度＜0.01 mg/L，亞硝酸鹽濃度＜0.02 mg/L，pH 7.5～8.0。

1.3 樣品采集與分析

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，海鱸禁食24 h后采樣。統(tǒng)計(jì)每缸中海鱸的數(shù)量和總重量，計(jì)算存活率（SR）、增重率（WGR）、特定生長(zhǎng)率（SGR）和飼料系數(shù)（FCR）。每缸隨機(jī)取6尾魚，測(cè)體重和體長(zhǎng)，解剖取內(nèi)臟，分離內(nèi)臟團(tuán)、肝臟和腸道并稱重，計(jì)算肥滿度（CF）、臟體比（VSI）和肝體比（HSI）。每缸隨機(jī)取3尾魚，測(cè)定全魚的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量。每缸隨機(jī)取3尾魚，解剖取肝臟，立刻置于10%福爾馬林固定液中保存，制備石蠟組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅法染色，于顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)。每缸隨機(jī)取3尾魚，解剖取肌肉和肝臟，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定組織中AFB1的含量[18]。

飼料和全魚體成分營養(yǎng)指標(biāo)參照國標(biāo)方法檢測(cè)，其中水分含量采用105 ℃常壓干燥法（參照GB/T 6435—2014）測(cè)定，粗蛋白含量采用凱氏定氮法（參照GB/T 6432—2018）測(cè)定，粗脂肪含量采用乙醚抽提法（參照GB/T 6432—2006）測(cè)定，粗灰分含量采用550 ℃灼燒法（參照GB/T 6438—1992）測(cè)定。

1.4 指標(biāo)計(jì)算

存活率（SR，%）=100×終末魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)攝食量（FI，g/尾）=攝食飼料總量（g）/[（初始魚尾數(shù)+終末魚尾數(shù)）/2]

增重率（WGR，%）=100×[終末體重（g）-初始體重（g）]/初始體重（g）

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=100×[ln終末體重（g）-ln初始體重（g）]/飼養(yǎng)天數(shù)

飼料系數(shù)（FCR）=攝食飼料總量（g）/[終末體重（g）-初始體重（g）]

蛋白質(zhì)效率（PER，%）=100×[末體重（g）-初體重（g）]/[攝入飼料總量（g）×飼料粗蛋白含量（%）]

肥滿度（CF，g/cm3）=100×體重（g）/[體長(zhǎng)（cm）]3

臟體比（VSI，%）=100×內(nèi)臟團(tuán)重（g）/體重（g）

肝體比（HSI，%）=100×肝臟重（g）/體重（g）

腸體比（ISI，%）=100×腸重（g）/體重（g）

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件中單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s 法均值多重比較法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性進(jìn)行分析處理。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若不滿足方差齊性，則采用Dunnett-T3檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。采用多項(xiàng)式比較分析均值的線性和二次方效應(yīng)，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料中添加AFB1對(duì)海鱸生長(zhǎng)性能的影響（見表2）

表2 AFB1對(duì)海鱸生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，飼料中添加AFB1 不影響海鱸存活率、飼料系數(shù)及蛋白質(zhì)效率（P＞0.05）。與G0組相比，G1.0組海鱸的末體重、增重率和特定生長(zhǎng)率呈線性和二次方效應(yīng)顯著下降（P＜0.05），G0.5組和G1.0組海鱸的攝食量呈線性和二次方效應(yīng)顯著下降（P＜0.05），肥滿度和腸體比呈線性效應(yīng)顯著下降（P＜0.05），G0.1、G0.5組和G1.0 組海鱸的臟體比呈線性效應(yīng)顯著下降（P＜0.05），肝體比呈線性和二次方效應(yīng)顯著下降（P＜0.05）。

2.2 飼料中添加AFB1對(duì)海鱸全魚體成分的影響（見表3）

表3 AFB1對(duì)海鱸全魚體成分的影響（濕基，%）

由表3 可知，飼料中添加AFB1 不影響海鱸全魚的水分、粗蛋白、粗脂肪及灰分含量（P＞0.05）。

2.3 飼料中添加AFB1 對(duì)海鱸肝臟組織形態(tài)的影響（見圖1）

圖1 飼料中添加AFB1對(duì)海鱸肝臟組織形態(tài)的影響

由圖1 可知，G0 組海鱸肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，胞核結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無變性和壞死。G0.1～G1.0 組肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變性和壞死，表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡化（紅色箭頭）、肝細(xì)胞形態(tài)模糊或消失（藍(lán)色箭頭），且隨著飼料中AFB1 含量的增加，肝細(xì)胞出現(xiàn)變性和壞死的程度越嚴(yán)重。

2.4 飼料中添加AFB1 對(duì)海鱸肌肉和肝臟組織中AFB1殘留量的影響（見圖2）

由圖2 可知，G0 組海鱸肌肉和肝臟中均未檢出AFB1。與G0 組相比，G0.1～G1.0 組海鱸肌肉中AFB1含量顯著增加（P＜0.05），G0.1、G0.5 組和G1.0 組海鱸肌肉中AFB1 含量無顯著差異（P＞0.05）；隨著飼料中AFB1含量的增加，海鱸肝臟中AFB1含量增加，與G0組相比，G0.1組和G0.5組海鱸肝臟中AFB1含量顯著增加（P＜0.05），但二者之間AFB1 含量無顯著差異（P＞0.05）；G1.0組海鱸肝臟中AFB1含量顯著高于其他組（P＜0.05）。

圖2 飼料中添加AFB1對(duì)海鱸肌肉和肝臟組織中AFB1殘留量的影響

3 討論

3.1 飼料中添加AFB1對(duì)海鱸生長(zhǎng)性能的影響

AFB1 對(duì)魚類的生物學(xué)影響主要取決于AFB1 在飼料中的濃度以及魚的種類和年齡[3]。黃瑩等[16]報(bào)道，飼料中AFB1濃度越高，其對(duì)魚類的毒性作用則越強(qiáng)。相對(duì)于雜食性魚類和成年魚，肉食性魚類和幼齡魚苗對(duì)AFB1更加敏感，耐受性也更差[15]。研究表明，AFB1 對(duì)舌齒鱸（Dicentrarchus labraxL.）的半致死濃度LC50（口服，96 h）為180 μg/kg體重[3]，而其他魚類的LC50為300～900 μg/kg體重[19]。不同魚類對(duì)AFB1耐受性的差異主要取決于魚類肝臟對(duì)AFB1的代謝能力[20]。根據(jù)我國現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13078—2017規(guī)定，魚類配合飼料中AFB1 含量須小于或等于20 μg/kg。本試驗(yàn)飼料中AFB1 的添加量為0.1～1.0 mg/kg，該劑量遠(yuǎn)大于20 μg/kg，主要原因是研究高濃度AFB1 對(duì)海鱸的急性應(yīng)激作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加0.1～1.0 mg/kg AFB1 不同程度地降低了海鱸的增重率、特定生長(zhǎng)率和攝食量等生長(zhǎng)性能指標(biāo)，說明飼料中添加AFB1可抑制海鱸生長(zhǎng)。這與Deng等[5]在羅非魚、Zeng等[6]在草魚、Tasa等[7]在鯉魚、Jantrarotai等[8]在斑點(diǎn)叉尾鮰、Amjad 等[9]在胡子鯰、Arana 等[10]在虹鱒、鄭宗林等[11]在紅姑魚、王靜等[12]在凡納濱對(duì)蝦、黃瑩等[13]在異育銀鯽上的研究結(jié)果相似。AFB1對(duì)魚類生長(zhǎng)的抑制作用是其毒性的主要表現(xiàn)形式之一，其負(fù)面作用還包括損傷肝臟和破壞免疫系統(tǒng)[4]。肝臟被認(rèn)為是AFB1的主要作用器官，魚類攝入的AFB1經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450 家族成員代謝轉(zhuǎn)化為致癌物，誘發(fā)肝功能受損和代謝紊亂，從而抑制動(dòng)物生長(zhǎng)[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加AFB1 導(dǎo)致海鱸肝臟組織結(jié)構(gòu)受損，并誘發(fā)了肝細(xì)胞變性和壞死，而肝體比下降則說明AFB1影響肝臟器官發(fā)育。黃瑩等[13，16]、王靜等[12]和Zeng 等[6]也將魚類生長(zhǎng)性能的下降歸因于AFB1 對(duì)肝臟產(chǎn)生的毒害作用。

3.2 飼料中添加AFB1對(duì)海鱸肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

盡管AFB1 被認(rèn)為損害草魚[6,13]、鯉魚[21]、凡納濱對(duì)蝦[12]、斑節(jié)對(duì)蝦[22-23]、斑點(diǎn)叉尾鮰[8]、虹鱒[10]等水產(chǎn)動(dòng)物的肝臟組織結(jié)構(gòu)，但飼料中不同劑量的AFB1 對(duì)海鱸肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響還未見報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著飼料中AFB1含量的增加，海鱸肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變性和壞死，脂肪空泡化嚴(yán)重，說明AFB1損傷海鱸肝臟。史瑩華等[24]報(bào)道，AFB1 在肝臟中經(jīng)細(xì)胞色素P450 氧化酶代謝轉(zhuǎn)化為黃曲霉毒醇，而黃曲霉毒醇又經(jīng)過一系列生物活化步驟轉(zhuǎn)化為AFB1-8,9-環(huán)氧化合物，后者具有很強(qiáng)的親合性，極易攻擊酶蛋白分子親核上的氮、氧、硫等原子，使酶蛋白活性喪失，同時(shí)產(chǎn)生大量自由基和活性氧，得不到及時(shí)清除，肝細(xì)胞受自由基和活性氧攻擊而誘發(fā)DNA 氧化損傷，最終導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷。Allameh 等[25]研究表明，AFB1 降低肉雞肝臟脂肪代謝基因PPARα表達(dá)量，從而導(dǎo)致脂肪代謝紊亂而增加肝臟脂肪堆積。劉艷麗等[26]報(bào)道，當(dāng)肝臟受損時(shí)，肝細(xì)胞中線粒體氧化酶系統(tǒng)遭到破壞，ATP 生成量減少，細(xì)胞膜的鈉泵發(fā)生功能障礙，細(xì)胞內(nèi)鈉離子含量升高，水分進(jìn)入細(xì)胞增多，細(xì)胞腫大或形成水泡變性。

3.3 飼料中添加AFB1 對(duì)海鱸肌肉和肝臟組織中AFB1殘留量的影響

有關(guān)AFB1在畜禽動(dòng)物組織器官中積累的研究較多，但在水產(chǎn)動(dòng)物上的報(bào)道較少。黃瑩等[13]報(bào)道，當(dāng)飼料中添加5～500 μg/kg AFB1時(shí)，異育銀鯽肌肉和性腺中的AFB1 積累量低于美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）食品安全限定標(biāo)準(zhǔn)5 μg/kg，肝臟中的AFB1 積累量與飼料中的AFB1 水平呈對(duì)數(shù)關(guān)系，當(dāng)飼料中AFB1添加量大于50 μg/kg時(shí)，異育銀鯽肝臟AFB1的累積量則超過FDA 食品安全限定標(biāo)準(zhǔn)。黃瑩等[16]研究表明，草魚幼魚至少可耐受AFB1含量達(dá)5 000 μg/kg飼料，攝食AFB1 小于1 000 μg/kg 的草魚幼魚肌肉中未檢測(cè)出AFB1殘留，僅在5 000 μg/kg 試驗(yàn)組檢測(cè)出草魚肌肉中含有大約1.2 μg/kg AFB1，此含量低于FDA 食品安全限定標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中AFB1 可在海鱸肌肉和肝臟中積累，但累積量均低于FDA食品安全限定標(biāo)準(zhǔn)，隨著飼料中AFB1含量增加，海鱸肌肉中AFB1殘留量無顯著變化，而肝臟中AFB1殘留量顯著增加。這與鄭宗林等[11]在紅姑魚和Deng等[5]在羅非魚上的研究結(jié)果相似，隨著飼料中AFB1含量增加，肝臟中AFB1殘留量顯著增加，但不影響肌肉中AFB1的殘留量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，AFB1在海鱸肝臟中的積累量高于肌肉，這可能與肝臟是AFB1 的靶器官以及代謝轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所有關(guān)[24]。

4 結(jié)論

飼料中添加0.1～1.0 mg/kg AFB1 可降低海鱸生長(zhǎng)性能，導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死和脂肪空泡化現(xiàn)象。海鱸肝臟中AFB1 殘留量高于肌肉，且與飼料中AFB1添加量成正相關(guān)。