基于OPG/RANKL途徑青蒿琥酯對(duì)牙周炎大鼠牙槽骨吸收的影響及抑炎作用研究

陳晨 陳棟 陸珂 王茜

青蒿琥酯(artesunate，Art)是青蒿素的水溶性衍生物，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗炎及抗癌等多種藥理作用，且有研究證實(shí)其可阻斷破骨細(xì)胞生成、活化，從而預(yù)防大鼠骨質(zhì)疏松及抑制骨質(zhì)破壞[1]。本研究通過建立牙周炎大鼠模型，觀察Art對(duì)其牙槽骨吸收的影響及抑炎作用，并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80 只SPF級(jí)SD雄性大鼠，8 周齡，體質(zhì)量(320±20) g(北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心),[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008]。

1.2 主要試劑及儀器

Art(南京道斯夫生物科技有限公司)；標(biāo)準(zhǔn)菌混合懸液(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)；前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(上海雙贏生物科技有限公司)；兔抗大鼠骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin，OPG)、細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)一抗(LifeSpan公司，美國)。

Viva CT40 Micro-CT(SCANCO Medical AG公司，瑞士)；BX51顯微鏡(Olympus株式會(huì)社，日本)。

1.3 構(gòu)建牙周炎大鼠模型[2]

腹腔注射麻醉大鼠，撐開上、下切牙，用3.0絲線(直徑0.2 mm)結(jié)扎線分別結(jié)扎兩側(cè)上頜第1、2磨牙牙頸部，且使結(jié)扎線盡量深入牙齦溝中，同時(shí)于牙齦溝中接種4 種標(biāo)準(zhǔn)菌混合懸液(濃度109CFU/mL)。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)扎8 周后，牙齦位置紅腫、探診出血，且形成深牙周袋。

1.4 分組及干預(yù)

80 只大鼠隨機(jī)抽取15 只在牙齦溝相同位置注射等量生理鹽水，設(shè)為對(duì)照組。其余65 只建模，成功60 只，隨機(jī)分為模型組、Art低、中、高劑量組，各15 只。建模成功后，Art低、中、高劑量組腹腔注射Art生理鹽水溶液5 mL，劑量為10、30、60 mg/kg[3]。對(duì)照組、模型組腹腔注射等體積生理鹽水。1 次/d，連續(xù)4 周。

1.5 牙周指數(shù)檢測

1.6 檢測血清炎癥因子水平

末次干預(yù)后禁食12 h，麻醉取腹主動(dòng)脈血5 mL，離心取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書要求，酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PGE2、IL-6水平。

1.7 觀察牙槽骨吸收情況

取血后每組隨機(jī)挑選5 只脫頸處死，40%中性甲醛固定上槽牙、上頜骨、牙周組織及牙組織，24 h后修正標(biāo)本，保留磨牙區(qū)段頜骨、牙周組織，采用Micro-CT進(jìn)行三維CT拍攝測量釉牙骨質(zhì)界至牙槽嵴頂?shù)木嚯x(cemento-enamel junction-aleolar crest，CEJ-AC)，光鏡下觀察牙槽骨吸收情況。

1.8 HE染色觀察牙周組織病理變化

從每組剩余大鼠中隨機(jī)挑選5 只脫頸處死，取上頜骨，用40%中性甲醛溶液固定48 h，流水沖洗24 h，在10%的EDTA脫鈣液中脫鈣8 周，修整后常規(guī)包埋，切成5 μm連續(xù)薄片(順第一磨牙近遠(yuǎn)中方向)。取切片，常規(guī)HE染色，光鏡拍照觀察牙周組織病理變化。

1.9 Western blot檢測牙周組織OPG、RANKL表達(dá)

處死每組剩余的5 只大鼠，以病灶牙為中心(對(duì)照組取對(duì)應(yīng)位置)，上下各取5 mm×5 mm的牙周組織標(biāo)本，研磨器充分研磨，裂解后離心，BCA試劑盒測定、定量總蛋白。取40 μg待測樣品，與上樣緩沖液混勻，金屬浴5 min，離心取上清，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫封閉2 h，TBST清洗，加入兔抗大鼠OPG、RANKL一抗(1∶500)，4 ℃搖床孵育過夜，TBST清洗，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗，ECL發(fā)光液顯色，暗室內(nèi)曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析，以O(shè)PG、RANKL/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值表示蛋白表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PLI、SBI、PD

與對(duì)照組比較，模型組PLI、SBI、PD均升高(P<0.05)；與模型組比較，Art低劑量組PLI、SBI、PD均降低(P<0.05)，且為劑量依賴性(表 1)。

表 1 各組大鼠PLI、SBI、PD比較

2.2 血清炎癥因子水平

與對(duì)照組比較，模型組血清PGE2、IL-6水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，Art低劑量組血清PGE2、IL-6水平均降低(P<0.05)，為劑量依賴性(表 2)。

表 2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較

2.3 CEJ-AC

與對(duì)照組比較，模型組CEJ-AC延長(P<0.05)；與模型組比較，Art低劑量組CEJ-AC縮短(P<0.05)，且表現(xiàn)為劑量依賴性(表 3、圖 1)。

2.4 牙周組織病理學(xué)改變

HE染色顯示，對(duì)照組下方牙周膜及牙齦纖維排列緊密、結(jié)構(gòu)完整，牙齦上皮緊密附著在釉牙骨質(zhì)界復(fù)層鱗狀上皮，未觀察到牙槽骨吸收；模型組齦溝內(nèi)上皮糜爛，結(jié)合上皮向牙根方向增殖，牙周袋形成，附著喪失，牙齦上皮屏障結(jié)構(gòu)損傷，可觀察到牙槽骨中骨吸收形成的陷窩，牙槽嵴頂與釉牙骨質(zhì)界之間的距離延長；Art低、中、高劑量組附著水平提高，牙槽嵴頂高度增加，牙槽骨吸收及破壞程度有所降低，且表現(xiàn)為劑量依賴性(圖 2)。

表 3 各組大鼠CEJ-AC比較

圖 1 大鼠牙槽骨Micro-CT圖

圖 2 牙周組織病理學(xué)改變(HE， ×200)

2.5 牙周組織OPG、RANKL蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組牙周組織OPG蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，RANKL蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)；與模型組比較，Art低劑量組牙周組織OPG蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，RANKL蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)，且表現(xiàn)為劑量依賴性(表 4、圖 3)。

表 4 大鼠牙周組織OPG、RANKL蛋白表達(dá)比較

圖 3 大鼠牙周組織OPG、RANKL蛋白表達(dá)

3 討 論

目前關(guān)于牙周炎的發(fā)病機(jī)制尚在探索階段，多認(rèn)為與膜型基質(zhì)金屬蛋白酶降解膠原、內(nèi)源性β葡萄糖醛酸苷酶溶酶酸性水解酶、白細(xì)胞介素介導(dǎo)炎性反應(yīng)與免疫應(yīng)答等有關(guān)[4]。有觀點(diǎn)認(rèn)為[5-6]，牙周組織損傷的原因是機(jī)體為清除病原引發(fā)的強(qiáng)烈免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的炎性損傷，通過抗炎治療以減輕牙周組織損傷及牙槽骨吸收是牙周炎治療的新思路。

本研究顯示，經(jīng)Art干預(yù)后大鼠PLI、SBI、PD、CEJ-AC及血清PGE2、IL-6水平均降低，且呈劑量依賴性，提示Art可減輕大鼠炎癥反應(yīng)，抑制牙槽骨吸收。Art衍生自中藥青蒿提取物青蒿素，最初常用于抗瘧疾治療，亦具有調(diào)節(jié)骨代謝的作用。Huang等[7]采用Art處理小鼠單核/巨噬細(xì)胞RAW 264.7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可增強(qiáng)該細(xì)胞活力，抑制TRACP陽性細(xì)胞和骨細(xì)胞陷窩形成活性，并降低破骨細(xì)胞生成相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)量。此外，Zeng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在革蘭氏陰性菌引起的慢性感染性疾病中，如骨髓炎、化膿性關(guān)節(jié)炎和牙周炎，破骨細(xì)胞的活性隨著炎癥的升高而增強(qiáng)，擾亂骨穩(wěn)態(tài)并導(dǎo)致骨質(zhì)溶解，而Art是治療革蘭氏陰性菌感染或RANKL非依賴性通路炎癥引起的骨質(zhì)流失的重要選擇。

RANKL通過結(jié)合位于破骨前體細(xì)胞膜上的RANK，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化并減少其凋亡，而OPG作為RANKL的誘餌受體，可與RANK競爭性結(jié)合，從而阻斷RANK與RANKL的相互作用，抑制破骨細(xì)胞分化，減少骨吸收[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，牙周炎大鼠模型RANKL、RANKL/OPG顯著升高，而OPG蛋白水平顯著降低，對(duì)癥干預(yù)后有所改善，且大鼠牙槽骨吸收、修復(fù)及重建隨之改善，提示OPG、RANKL參與該病發(fā)生及轉(zhuǎn)歸。本研究顯示，與對(duì)照組比較，模型組牙周組織OPG蛋白表達(dá)量降低，RANKL蛋白表達(dá)量升高，經(jīng)Art干預(yù)后OPG蛋白表達(dá)量升高，RANKL蛋白表達(dá)量降低，且呈劑量依賴性，提示增加OPG蛋白表達(dá)，減少RANKL蛋白表達(dá)可能是Art對(duì)牙周炎的治療作用機(jī)制之一。

綜上所述，Art可抑制牙周炎大鼠牙槽骨吸收，減輕炎癥反應(yīng)，可能通過增加OPG蛋白表達(dá)，減少RANKL蛋白表達(dá)發(fā)揮作用。