高糖微環(huán)境下EMD對鈦表面BMSCs成骨分化的影響及其機(jī)制研究

孟茂花 夏茜 成璐 李英 陳鏡橋 王勤英 葉朝陽 董強(qiáng)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者種植體周圍炎發(fā)生的概率較高，與健康患者相比，骨結(jié)合較慢，種植體的存留率相對較低，種植術(shù)后并發(fā)癥的控制和治療較難，因此，糖尿病是口腔種植修復(fù)關(guān)注的主要基礎(chǔ)疾病之一[1]。釉基質(zhì)衍生物(enamel matrix derivatives，EMD)是從幼豬牙胚中提取的釉基質(zhì)蛋白的衍生物，主要由釉原蛋白、成釉蛋白和類生長因子物質(zhì)等共同構(gòu)成, 在口腔相關(guān)基礎(chǔ)研究和臨床治療中，體現(xiàn)出較好的組織再生效果[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，EMD可以促進(jìn)糖尿病大鼠頜骨缺損的骨組織再生[3]， EMD治療種植體周骨缺損，10 年種植體存留率為90.7%，同時在種植體骨缺損治療中獲得長期穩(wěn)定的效果[4]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可定向分化，是良好的種子細(xì)胞，經(jīng)過處理和誘導(dǎo)后，能促進(jìn)牙周組織缺損修復(fù)，在牙周組織再生中有較好的治療前景[5]。BMSCs是牙槽骨損傷修復(fù)的重要細(xì)胞，有較好的歸巢功能[6]，在種植體植入后，BMSCs通過血液募集到種植體表面，為種植體提供較好的骨結(jié)合條件。因此，在DM患者種植體周圍骨缺損修復(fù)的過程中，BMSCs在損傷部位的成骨和黏附起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路是BMSCs成骨分化的重要通路，即使在高糖微環(huán)境下也是如此[7]。

噴砂酸蝕(sandblasted and acid-etched，SLA)是鈦種植體常用的表面改性技術(shù)之一，其細(xì)微粗糙的表面促進(jìn)細(xì)胞黏附[8]。EMD可以促進(jìn)SLA鈦表面牙齦成纖維細(xì)胞[9]和成骨細(xì)胞[10]的增殖、黏附和成骨分化。因此推測EMD是否也能促進(jìn)高糖微環(huán)境下BMSCs在SLA鈦表面上的成骨和黏附的性能？目前，EMD在高糖微環(huán)境下，對SLA鈦表面BMSCs的成骨分化和黏附的作用及其機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，EMD可以促進(jìn)正常糖狀態(tài)下的BMSCs的成骨分化，并且可能是通過激活Wnt/β-catenin信號通路來實(shí)現(xiàn)的[11]。本研究體外采用5.5 mmol/L正常糖(normal glucose，NG)和25 mmol/L高糖(high glucose，HG)，通過細(xì)胞遷移、堿性磷酸酶活性、茜素紅半定量、電鏡掃描、RT-qPCR和WB的檢測方法，在SLA鈦表面上對BMSCs進(jìn)行成骨和黏附性能檢測和分析，EMD在高糖微環(huán)境下，對SLA鈦表面BMSCs的成骨和黏附的作用及其機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 資料與方法

1.1 主要試劑

10 只2 周齡SD大鼠(SPF級)；EMD(Straumann,瑞士)；DMEM (Gibcol，美國)；胎牛血清、青-鏈霉素(Biological Industeries,以色列)；成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基[賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司]；Anti-Runx2 (CST，美國)；一抗Osterix、β-catenin、Fibronecti、Integrinβ1(Abcam，英國)；Anti-Col-1(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)； XAV-939(MedChemExpress,美國)；抗體CD45、CD90、CD29、CD11b(BioLegend，美國)；Trizol、PrimeScript?RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)；SYBRTMGreenMasterMix和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific，美國)；PVDF膜(Millipore，美國)；SLA鈦片(西安泰金工業(yè))；ALP活性測定試劑盒(南京建成)；氯化十六烷基吡啶一水(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；二抗(泰安普美生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs提取及鑒定 SD大鼠脫頸處死，剝離脛骨和腓骨，PBS沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞，貼壁篩選法分離培養(yǎng)，取第3代用于后續(xù)試驗。流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行CD29、CD90、CD45、CD11b檢測。成骨誘導(dǎo)(10%FBS，1%青-鏈霉素，50 μmol/L L-抗壞血酸-2-磷酸鈉、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、100 nmol/L地塞米松)21 d，1%茜素紅染色。SD大鼠干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，21 d油紅O染色。

1.2.2 SLA鈦片培養(yǎng)細(xì)胞 用直徑10 mm，厚1 mm，SLA表面處理的鈦片，放入48 孔板，按2×105/孔，成骨誘導(dǎo)，用于后續(xù)檢測。

1.2.3 EMD試劑工作濃度配制 EMD為30 mg/mL，工作濃度為75 μg/mL，取EMD加入培養(yǎng)基中，渦旋震蕩混勻。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗 取BMSCs，3×103/孔，200 μL DMEM重懸，加入Transwell小室中。24 孔板孔內(nèi)加入800 μL培養(yǎng)基(NG，HG，HG+75 μg/mL EMD)，培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色。

1.2.5 ALP活性檢測 BMSCs在SLA鈦表面成骨誘導(dǎo)7 d，提取蛋白，BCA蛋白定量，使用ALP活性檢測試劑盒，520 nm波長，酶標(biāo)儀測定A值。

1.2.6 茜素紅半定量實(shí)驗 BMSCs在SLA鈦表面成骨誘導(dǎo)21 d，4%多聚甲醛固定，茜素紅染色，每孔加200 μL 10%氯化十六烷基吡啶37 ℃搖床孵育1 h，取100 μL加入96 孔板中，562 nm波長，酶標(biāo)儀測定A值。

1.2.7 電鏡掃描 BMSCs在SLA鈦表面成骨誘導(dǎo)28 d，2.5%戊二醛4 ℃固定過夜，酒精(50%、70%、80%、90%)逐級脫水，使用100%酒精脫水3 次，在鈦片表面噴金，掃描電鏡(SEM)拍照觀察。

1.2.8 RT-qPCR BMSCs在SLA鈦表面成骨誘導(dǎo)7 d，收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，檢測純度和濃度后進(jìn)行定量，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用SYBR Green熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測試劑盒進(jìn)行RT-qPCR，相關(guān)基因引物序列均由中國上海生工生物有限公司合成，以β-actin為內(nèi)參，檢測各組mRNA相對表達(dá)量(表 1)。

1.2.9 Western blot BMSCs在SLA鈦表面成骨誘導(dǎo)7 d，收集細(xì)胞，提取蛋白。10% SDS-PAGE電泳，0.45 μm PVDF膜，5%BSA封閉1 h，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光儀曝光，保存蛋白條帶，Image J檢測蛋白條帶的灰度值。

表 1 引物序列設(shè)計

1.2.10 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑 細(xì)胞分組：NG，HG，HG+EMD、NG+XAV-939、HG+XAV-939、HG+EMD+XAV-939)，使用10 μg/mL XAV-939[12]，成骨誘導(dǎo)7 d，WB檢測成骨和黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析并作圖，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，所有實(shí)驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定

細(xì)胞貼壁，呈纖維樣和漩渦樣生長 (圖 1A、B)。茜素紅染色可見紅色礦化結(jié)節(jié)(圖 1C)，油紅O染色可見脂滴形成(圖 1D)。干細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD29和CD90表達(dá)呈陽性，非干細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物CD45和 CD11b表達(dá)呈陰性(圖 1E)。

圖 1 BMSCs培養(yǎng)及鑒定(A～D, ×100)

2.2 EMD在高糖微環(huán)境下促進(jìn)BMSCs遷移

Transwell檢測EMD在高糖微環(huán)境下對BMSCs遷移的影響(圖 2A)，遷移細(xì)胞計數(shù)(圖 2B)，HG組低于NG組，HG+EMD組數(shù)量有明顯上升，表明在高糖微環(huán)境下BMSCs遷移受到抑制，EMD可以改善遷移抑制。

圖 2 Transwell細(xì)胞遷移

2.3 BMSCs成骨分化

使用ALP活性檢測早期成骨標(biāo)志物(圖 3A)，HG組低于NG，添加EMD后活性有明顯上升。茜素紅染色半定量(圖 3B)檢測成骨晚期礦化程度，HG組較NG組減低明顯，EMD誘導(dǎo)后，礦化程度有上升。

圖 3 成骨分化能力檢測

2.4 礦化結(jié)節(jié)表面形態(tài)

SEM觀察SLA鈦片表面BMSCs礦化結(jié)節(jié)(圖 4)，NG組的礦化結(jié)節(jié)較大，突出鈦片表面較高，礦化面積最多，NG組明顯降低，EMD作用后礦化面積增加。

圖 4 SLA鈦表面礦化結(jié)節(jié)(SEM)

2.5 WB檢測成骨和黏附蛋白

WB檢測成骨和黏附相關(guān)的蛋白的表達(dá)(圖 5A)和灰度值(圖 5B)，HG組較NG組成骨和黏附相關(guān)蛋白(Osterix、Runx2、COL-1、Integrin β1和Fibronectin)顯著降低，HG+EMD組有不同程度的增加。

2.6 RT-qPCR檢測成骨和黏附相關(guān)基因

RT-qPCR檢測Osterix、Runx2、COL-1、Integrin β1和Fibronectin基因表達(dá)(圖 5C)，HG組成骨和黏附的mRNA的表達(dá)低于NG組，HG+EMD組升高。

2.7 β-catenin基因與蛋白表達(dá)

WB和RT-qPCR檢測β-catenin的蛋白和mRNA表達(dá)(圖 6)；HG組β-catenin蛋白表達(dá)較量最少，EMD作用后增高，基因表達(dá)趨勢與蛋白相一致。

圖 6 β-catenin基因和蛋白的表達(dá)

2.8 XAV-939處理后下游的蛋白的表達(dá)變化

WB檢測XAV-939處理后Wnt/β-catenin信號通路下游的成骨和黏附相關(guān)蛋白(圖 7A)和灰度值(圖 7B)，HG組較NG組的蛋白(Osterix、Runx2、β-catenin、Integrin β1和Fibronectin)表達(dá)降低，HG+EMD表達(dá)增加，趨勢與之前的檢測相符合。XAV-939組的蛋白均呈下降趨勢，下游的成骨和黏附相關(guān)蛋白(Osterix、Runx2、Integrin β1和Fibronectin)表達(dá)均降低(P<0.05)，表明即使在高糖微環(huán)境和XAV-939的共同作用下，EMD仍可以促進(jìn)SLA表面BMSCs的成骨和黏附。

圖 7 XAV-939處理后Wnt/β-catenin信號通路下游成骨和黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

3 討 論

目前，為牙列缺損的糖尿病患者進(jìn)行種植義齒修復(fù)，能夠獲得長期有效的臨床治療效果，已是常規(guī)的口腔修復(fù)方式之一。但是，由于高血糖可能對種植體骨結(jié)合以及術(shù)后并發(fā)癥的不利影響，與正?；颊呦啾?，糖尿病患者的種植體長期存留率及術(shù)后維護(hù)都具有挑戰(zhàn)性。如何進(jìn)一步改善和避免高血糖對口腔種植的不利影響？一直是口腔種植領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)之一。

本研究通過體外培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀測、成骨分化和成脂分化能力的鑒定，以及干細(xì)胞表面標(biāo)志物的鑒定(圖 1)，證明提取細(xì)胞為BMSCs[12]。根據(jù)本課題組前期研究，在25 mmol/L葡萄糖微環(huán)境條件下，EMD誘導(dǎo)BMSCs增殖和成骨分化的較佳濃度為75 μg/mL，故使用該濃度進(jìn)行本實(shí)驗研究[13]。BMSCs在種植體表面的遷移、黏附和成骨的能力，是種植體骨結(jié)合成功的關(guān)鍵[14]。本研究通過Transwell檢測EMD在高糖微環(huán)境中對BMSCs遷移的影響(圖 2)，結(jié)果提示，BMSCs遷移能力受到抑制，EMD能緩解高糖微環(huán)境對BMSCs遷移能力的損傷。ALP活性、茜素紅半定量(圖 3)和電鏡掃描(圖 4)結(jié)果提示，雖然SLA鈦表面可以增加BMSCs細(xì)胞外基質(zhì)的分泌以促進(jìn)成骨分化[15]，但在高糖微環(huán)境中，SLA鈦表面BMSCs的成骨能力受到抑制，EMD可部分改善BMSCs的成骨能力。

Runx2是成骨早期的重要轉(zhuǎn)錄因子，Osterix 是成骨細(xì)胞才表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，兩者在BMSCs成骨分化過程中占據(jù)重要的地位[16]。COL-1可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，在成骨分化過程中使細(xì)胞外基質(zhì)礦化，有利于種植體表面BMSCs的成骨和黏附，是Runx2和Osterix 成骨分化過程轉(zhuǎn)錄的重要下游蛋白[17]。本研究通過RT-qPCR和WB檢測成骨分化的幾個關(guān)鍵指標(biāo)(Osterix、Runx2和COL-1)mRNA和蛋白的表達(dá)(圖 5)。高糖微環(huán)境下，Osterix、Runx2和COL-1的表達(dá)都分別相應(yīng)下調(diào)，EMD作用后，均分別出現(xiàn)上調(diào)，其表達(dá)趨勢與ALP活性和茜素紅半定量結(jié)果趨勢相符合。

Integrin β1為整合素家族的重要蛋白，細(xì)胞通過整合素蛋白與生物材料相結(jié)合，F(xiàn)ibronectin為黏連蛋白，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)在種植體表面的沉積和礦化[18-19]。本研究通過RT-qPCR和WB檢測Integrin β1和Fibronectin的基因和蛋白表達(dá)(圖 5)，在高糖微環(huán)境下其表達(dá)均下調(diào)，EMD作用下促進(jìn)Integrin β1和Fibronectin表達(dá)上調(diào)。

Wnt 信號通路是由Wnt家族的配體蛋白和Frizzled家族跨膜受體蛋白結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，根據(jù)是否依賴β-catenin蛋白，分為經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑和非經(jīng)典途徑；其中，經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑通過β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，易位至細(xì)胞核后與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合，啟動轉(zhuǎn)錄下游的靶基因[20]。本研究通過RT-qPCR和WB檢測β-catenin基因和蛋白(圖 6)，其與Osterix、Runx2、COL-1、Integrin β1和Fibronectin表達(dá)趨勢一致；添加通路抑制劑XAV-939，WB結(jié)果顯示(圖 7)，下游成骨和黏附蛋白均相受到抑制，其中，HG+XAV-939組最為顯著。

綜上所述，在本實(shí)驗研究的高糖微環(huán)境中，SLA鈦表面BMSCs成骨和黏附均受到抑制，EMD作用下可改善其抑制效應(yīng)。EMD對SLA鈦表面BMSCs的成骨分化和黏附的促進(jìn)作用，可能與激活Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。