過表達circRNA_LARP4對鼻咽癌細胞的腫瘤干細胞樣特性和線粒體膜電位的影響*

尹永波， 李學(xué)申， 邱金霞， 籍玉青， 崔 靜

邢臺市人民醫(yī)院，河北醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1耳鼻喉科 2放射科，邢臺 054000

鼻咽癌是指起源于鼻咽上皮組織，發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)部的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計，中國鼻咽癌發(fā)病率占全球總鼻咽癌發(fā)病率的80%以上，且發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢[1-2]。鼻咽癌的發(fā)病因素主要有遺傳因素、病毒感染及環(huán)境因素等，其具體發(fā)病的分子機制有待進一步研究[3-4]。目前，臨床上針對鼻咽癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放化療、藥物治療等，但治療效果不佳，且副作用明顯[5-8]。因此，探尋鼻咽癌新的治療靶點至關(guān)重要[9-10]。研究表明，環(huán)狀RNA(cricRNA)與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，circRNA_LARP4(circ_LARP4)是circRNA中的一員，據(jù)報道，circ_LARP4在多種腫瘤細胞中發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用，其可通過靶向FOXO3A抑制前列腺癌的細胞遷移和侵襲[11]，通過調(diào)節(jié)SMAD7的表達抑制非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移[12]，作為miR-1323的海綿分子通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT通路抑制食管鱗狀細胞癌的發(fā)生[13]，還可以作為miR-513b-5p的海綿分子調(diào)節(jié)LARP4的表達進而抑制卵巢癌細胞增殖和遷移[14]。但circ_LARP4在鼻咽癌中的研究鮮見報道，因此，本研究通過細胞轉(zhuǎn)染circ_LARP4，觀察過表達circ_LARP4對鼻咽癌CNE2和5-8F細胞增殖、腫瘤干細胞特性和線粒體損傷的影響，從細胞水平上初步探尋鼻咽癌的治療靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

1.1.1 試劑及儀器 10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液、胰酶、LipofectamineTM3000、pcDNA-circRNA_LARP4均購自美國Invitrogen公司，miR-135b-5p、miR-195-5p及對照miRNA類似物購自上海吉瑪基因。Trizol試劑、RIPA裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒、RT-PCR試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，Ki67兔單克隆抗體(ab197547)、p21小鼠單克隆抗體(ab86696)、OCT4兔多克隆抗體(ab19857)、Nanog小鼠單克隆抗體(ab173368)、ABCG2小鼠單克隆抗體(ab130244)、Bax小鼠單克隆抗體(ab3191)、Bcl-2兔多克隆抗體(ab194583)及辣根過氧化物(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗均購自美國Abcam公司。

1.1.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 鼻咽癌CNE1、HONE-1、CNE2和5-8F細胞及正常鼻咽上皮細胞系NP67均由中國科學(xué)院上海細胞庫提供。用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長密度達80%且生長狀態(tài)良好時以胰酶消化傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的鼻咽癌CNE2和5-8F細胞，接種于6孔板中，并進行分組。①將鼻咽癌CNE2和5-8F細胞分為Control組(空白對照組)、Vector組和circ_LARP4組。培養(yǎng)24 h后根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000空載Vector組細胞作陰性對照，circ_LARP4組細胞轉(zhuǎn)染LARP4過表達載體，48 h后進行后續(xù)檢測。②將鼻咽癌CNE2和5-8F細胞分為Vector組、circ_LARP4組、circ_LARP4+miR-135b-5p組、circ_LARP4+miR-195-5p組。培養(yǎng)24 h后根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書用Lipofectamine 3000空載Vector組細胞作陰性對照，circ_LARP4組細胞轉(zhuǎn)染LARP4過表達載體，circ_LARP4+miR-135b-5p組同時轉(zhuǎn)染LARP4過表達載體和miR-135b-5p mimic，circ_LARP4+miR-195-5p組同時轉(zhuǎn)染LARP4過表達載體和miR-195-5p mimic，轉(zhuǎn)染48 h后通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，進行后續(xù)實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 qRT-PCR檢測circ_LARP4、miR-135b-5p和miR-195-5p的過表達效率 取生長狀態(tài)良好的鼻咽癌CNE2和5-8F細胞，用Trizol提取試劑盒提取總RNA并測定RNA濃度及純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按RT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，待逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(16℃ 30 min，37℃ 50 min，70℃ 15 min)完成后放入PCR儀中進行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃、30 s，94℃、10 s，60℃、45 s，共45個循環(huán)。以目的基因和內(nèi)參比值表示RNA相對表達水平，采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。引物由上海生工生物工程有限公司合成：circ_LARP4上游引物5′-GGGCAGGCTCCCTTTCCCAAT-3′，下游引物5′-GCATTGGGAAAGGGAGCCTFC-3′；miR-135b-5p上游引物5′-CAGTGCAGGGTCC-GAGGTAT-3′，下游引物5′-CGTCGTATGGCT-TTTTATTCC-3′；miR-195-5p上游引物5′-GCG-TAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，下游引物5′-CTGTCGTCGTAGAGCCAGGGAA-3′；U6上游引物5′-CGAGCACAGAATCGCTTCA-3′，下游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATAT-3′；GAPDH上游引物5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游引物5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。

1.2.2 克隆形成實驗檢測克隆形成率 取各組生長狀態(tài)良好的鼻咽癌CNE2和5-8F細胞，經(jīng)胰酶消化處理后，將每組各100個細胞接種至6孔板中，待6孔板出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時，棄培養(yǎng)液并用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定細胞10 min，再加入適量的吉姆薩染液染色20～30 min，根據(jù)克隆形成數(shù)計算克隆形成率，克隆形成率=(克隆數(shù)/100)×100%。

1.2.3 成球?qū)嶒灆z測成球數(shù)和成球直徑 取各組對數(shù)生長期的鼻咽癌CNE2和5-8F細胞，胰酶消化處理細胞，血細胞計數(shù)器計數(shù)細胞密度。用RPMI 1640培養(yǎng)液清洗2次，然后用干細胞培養(yǎng)液[2% B27、20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和20 ng/mL表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)]在6孔板中培養(yǎng)，每孔接種100個細胞，置于5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。每隔1 d補加新鮮培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下拍照并記錄成球直徑和成球率。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位變化 取各組對數(shù)生長期的鼻咽癌CNE2和5-8F細胞并制成細胞懸液，用PBS重懸3次，加JC-1染色液于37℃條件下避光孵育30 min，用提前預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌2～3次，加入1 mL的RPMI 1640培養(yǎng)液，于流式細胞儀上進行檢測。正常細胞中JC-1聚集在線粒體中發(fā)出紅色熒光，凋亡細胞因JC-1以單體形式存在胞質(zhì)中而發(fā)出綠色熒光，計算紅/綠熒光比值作為線粒體膜電位水平。

1.2.5 試劑盒檢測SOD、MDA含量 收集各組對數(shù)生長期的鼻咽癌CNE2和5-8F細胞，嚴(yán)格按照SOD和MDA試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 Western blot檢測Ki67、P21、OCT4、Nanog、ABCG2、Bax和Bcl-2蛋白水平 收集對數(shù)生長期的鼻咽癌CNE2和5-8F細胞，胰酶消化細胞后制成細胞懸液，4℃、3000 r/min條件下離心10 min，取上清。用RIPA蛋白裂解液于冰上提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入Ki67兔單克隆抗體(1∶500)、p21小鼠單克隆抗體(1∶500)、OCT4兔多克隆抗體(1∶200)、Nanog小鼠單克隆抗體(1∶200)、ABCG2小鼠單克隆抗體(1∶200)、Bax小鼠單克隆抗體(1∶400)、Bcl-2兔多克隆抗體(1∶1000)，4℃孵育搖床過夜。加入按比例稀釋HRP標(biāo)記的對應(yīng)二抗(1∶4000)，室溫避光孵育2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法于暗室下曝光顯影，將膠片進行掃描存檔，Photoshop整理去色，Alpha軟件分析條帶吸光度值。

1.3 生物信息學(xué)分析及驗證

在Starbase 2.0數(shù)據(jù)庫中選擇miRNA-circRNA，輸入LARP4，得到所有可能與circ_LARP4產(chǎn)生互作的miRNA。以名稱排序，將不重復(fù)的RNA名輸入dbDEMC2數(shù)據(jù)庫的Meta-profiling Heatmap模塊，選擇鼻咽癌，并分別選擇癌組織與正常、轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移、早期和晚期的對比，產(chǎn)生熱圖，整合。得到不同狀況下circ_LARP4的差異表達靶miRNA。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 circ_LARP4過表達效率

檢測不同鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、HONE-1、5-8F和正常人鼻咽上皮細胞系NP67中circ_LARP4表達水平。與NP67細胞比較，CNE2、HONE-1細胞中circ_LARP4表達水平顯著降低(P<0.05)，CNE1、5-8F細胞中circ_LARP4表達水平亦顯著降低(P<0.01)。轉(zhuǎn)染后，與Control組比較，Vector組鼻咽癌CNE2和5-8F細胞中circ_LARP4表達水平無明顯差異(P>0.05)，circ_LARP4組CNE2和5-8F細胞中circ_LARP4表達水平均顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。結(jié)果提示，circ_LARP4過表達載體構(gòu)建成功。

A：qRT-PCR檢測不同鼻咽癌細胞系CNE1、CNE2、HONE-1、5-8F和正常人鼻咽上皮細胞系NP67中circ_LARP4表達水平，與NP67細胞比較，*P<0.05 **P<0.01；B：qRT-PCR檢測過表達circ_LARP4后CNE2和5-8F細胞中circ_LARP4表達水平，與Control組比較，*P<0.05圖1 qRT-PCR檢測circ_LARP4表達水平Fig.1 Expression level of circ_LARP4 detected by qRT-PCR

2.2 過表達circ_LARP4對鼻咽癌CNE2和5-8F細胞增殖的影響

克隆形成實驗檢測鼻咽癌CNE2和5-8F細胞克隆形成率，與Control組比較，Vector組CNE2和5-8F細胞克隆形成率無明顯差異(均P>0.05)，circ_LARP4組CNE2和5-8F細胞克隆形成率均顯著降低(均P<0.05)，見圖2A。Western blot檢測Ki67和p21蛋白水平，與Control組比較，Vector組CNE2和5-8F細胞Ki67和p21蛋白水平均無明顯差異(均P>0.05)，circ_LARP4組CNE2和5-8F細胞中Ki67蛋白水平顯著降低，p21蛋白水平顯著增高(均P<0.05)，見圖2B。

1：Control組；2：Vector組；3：circ_LARP4組；A：克隆形成實驗檢測克隆形成率；B：Western blot檢測Ki67和p21蛋白水平；與Control組比較，*P<0.05圖2 鼻咽癌CNE2和5-8F細胞增殖能力檢測Fig.2 Proliferation of nasopharyngeal carcinoma CNE2 and 5-8F cells

2.3 過表達circ_LARP4對鼻咽癌CNE2和5-8F腫瘤干細胞特性的影響

顯微鏡觀察并測量腫瘤干細胞成球數(shù)和成球直徑，與Control組比較，Vector組CNE2和5-8F干細胞成球率及成球直徑均無明顯差異(均P>0.05)，circ_LARP4組CNE2和5-8F干細胞成球率及成球直徑顯著減小(均P<0.05)，見圖3A、3B和3C。Western blot檢測干細胞標(biāo)記物OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平，與Control組比較，Vector組鼻咽癌CNE2和5-8F細胞OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平均無明顯差異(均P>0.05)，circ_LARP4組CNE2和5-8F細胞OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平均顯著降低(均P<0.05)，見圖3D、3E和3F。

1：Control組；2：Vector組；3：circ_LARP4組；A：成球?qū)嶒?；B：細胞成球率；C：細胞成球直徑；D：蛋白條帶圖；E：鼻咽癌CNE2細胞OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平；F：鼻咽癌5-8F細胞OCT4、Nanog和ABCG2蛋白水平；與Control組比較，*P<0.05圖3 鼻咽癌CNE2和5-8F干細胞樣特性檢測Fig.3 Detection of stem cell-like characteristics of nasopharyngeal carcinoma CNE2 and 5-8F cells

2.4 過表達circ_LARP4對鼻咽癌CNE2和5-8F細胞線粒體膜電位的影響

流式細胞術(shù)檢測鼻咽癌CNE2和5-8F細胞的線粒體膜電位變化，Control組CNE2和5-8F細胞線粒體中可見大量紅色熒光，僅見極少數(shù)綠色熒光。Vector組與Control組無明顯差異，circ_LARP4組CNE2和5-8F細胞線粒體中綠色熒光明顯增多。與Control組比較，Vector組CNE2和5-8F細胞JC-1紅/綠熒光比(%)無明顯差異(均P>0.05)，circ_LARP4組CNE2和5-8F細胞JC-1紅/綠熒光比(%)顯著降低(均P<0.05)，見圖4。

1：Control組；2：Vector組；3：circ_LARP4組；與Control組比較，*P<0.05圖4 鼻咽癌CNE2和5-8F細胞線粒體膜電位變化Fig.4 Changes of mitochondrial membrane potential in nasopharyngeal carcinoma CNE2 and 5-8F cells

2.5 過表達circ_LARP4對鼻咽癌CNE2和5-8F細胞線粒體凋亡蛋白水平及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

Western blot檢測鼻咽癌CNE2和5-8F細胞線粒體損傷標(biāo)記物Bax、Bcl-2蛋白水平，與Control組比較，Vector組CNE2和5-8F細胞線粒體Bax/Bcl-2均無明顯差異(均P>0.05)，circ_LARP4組CNE2和5-8F細胞線粒體Bax/Bcl-2均顯著升高(均P<0.05)，見圖5A。試劑盒檢測鼻咽癌CNE2和5-8F細胞中SOD及MDA含量，與Control組比較，Vector組CNE2和5-8F細胞中SOD和MDA含量均無明顯差異(均P>0.05)，circ_LARP4組CNE2和5-8F細胞中SOD含量均顯著降低(均P<0.05)，MDA含量均顯著增高(均P<0.05)，見圖5B、5C。

1：Control組；2：Vector組；3：circ_LARP4組；A：Bax、Bcl-2蛋白水平；B：SOD含量；C：MDA含量；與Control組比較，*P<0.05圖5 鼻咽癌CNE2和5-8F細胞線粒體損傷標(biāo)記物檢測Fig.5 Detection of mitochondrial damage markers in nasopharyngeal carcinoma CNE2 and 5-8F cells

2.6 circ_LARP4靶向miRNA的篩選

Starbase與dbDEMC2的分析表明，對于鼻咽癌而言，circ_LARP4相關(guān)miRNA變化中，miR-135b-5p和miR-195-5p在癌組織與癌旁組織、轉(zhuǎn)移瘤與原位瘤的比較中均顯示出上調(diào)，見圖6。

圖6 鼻咽癌circ_LARP4相關(guān)miRNA Starbase與dbDEMC2分析預(yù)測的熱圖Fig.6 Heat map predicted by Starbase and dbDEMC2 of circ_LARP4-related miRNA in nasopharyngeal carcinoma

2.7 circ_LARP4靶miRNA的驗證

在CNE2細胞中驗證了miR-135b-5p與miR-195-5p對circ_LARP4的影響。如圖7所示，與Control組比較，Vector組miR-135b-5p、miR-195-5p表達均無明顯差異(均P>0.05)，circ_LARP4組miR-135b-5p、miR-195-5p表達均顯著上調(diào)(均P<0.05)，見圖7A。miR-135b-5p或miR-195-5p與circ_LAPR4共轉(zhuǎn)染組逆轉(zhuǎn)了circ_LAPR4過表達所致的細胞增殖和腫瘤干細胞特性，增加了凋亡細胞數(shù)(均P<0.05)(圖7B～7F)。

1：Vector組；2：circ_LARP4組；3：circ_LARP4+miR-135b-5p組；4：circ_LARP4+miR-195-5p組；A：circ_LAPR4過表達模型中miR-135b-5p和miR-195-5p的表達水平；B：CNE2細胞中miRNA轉(zhuǎn)染驗證；C：Western blot檢測蛋白表達；D：增殖相關(guān)蛋白表達；E：腫瘤干細胞特性相關(guān)蛋白表達；F：凋亡相關(guān)蛋白表達；與Control組比較，△P<0.05；與Vector組比較，*P<0.05；與circ_LARP4組比較，#P<0.05圖7 鼻咽癌circ_LARP4相關(guān)miRNAFig.7 circ_LARP4-related miRNA in nasopharyngeal carcinoma

3 討論

鼻咽癌發(fā)生發(fā)展依賴于癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程。研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌發(fā)生過程中，circRNA通過其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)在鼻咽癌細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮調(diào)控作用。如circRNA SETD3通過miR-615-5p和miR-1538調(diào)節(jié)MAPRE1表達促進鼻咽癌細胞遷移和侵襲[15]；circRNA-ITCH在鼻咽癌組織及細胞系中低表達，過表達circRNA-ITCH可明顯抑制鼻咽癌CNE-2Z細胞的增殖和侵襲能力[16]；circRNA-ARHGAP12通過調(diào)節(jié)ezrin蛋白介導(dǎo)的細胞骨架重塑促進鼻咽癌細胞的遷移和侵襲[17]等。Lin等[14]發(fā)現(xiàn)circ_LARP4過表達可通過調(diào)節(jié)miR-513b-5p/LARP4軸來抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移。因此，本研究利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察circ_LARP4過表達對鼻咽癌細胞增殖、腫瘤干細胞樣特性及線粒體損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circ_LARP4過表達顯著抑制了鼻咽癌CNE2和5-8F細胞增殖、腫瘤干細胞干性并促進線粒體損傷。數(shù)據(jù)庫分析初步篩選出circ_LARP4的2種靶miRNA，miR-135b-5p和miR-195-5p，并在CNE2細胞中驗證了其對circ_LARP4的拮抗作用。這些結(jié)果提示，circ_LARP4可作為鼻咽癌的新型潛在治療靶點。

Ki67和p21是細胞增殖蛋白相關(guān)抗原，與細胞增殖密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Ki67在鼻咽癌細胞中高表達與鼻咽癌預(yù)后有關(guān)，p21是位于p53下游的細胞周期素依賴性激酶抑制因子，能夠抑制癌細胞增殖、分化和轉(zhuǎn)移[18]。本研究結(jié)果顯示，過表達circ_LARP4顯著抑制鼻咽癌CNE2和5-8F細胞克隆形成率及Ki67和p21蛋白水平。

腫瘤干細胞是指具有自我更新能力并產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞，腫瘤干細胞與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及抗藥性有關(guān)。OCT4、Nanog和ABCG2是腫瘤干細胞標(biāo)記物，是促進腫瘤細胞干性功能的主要基因。OCT4是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，是最早發(fā)現(xiàn)的維持干細胞自我更新、分化和多潛能性的重要細胞因子。Nanog是維持腫瘤干細胞全能性的關(guān)鍵基因，研究發(fā)現(xiàn)，Nanog在鼻咽癌組織中高表達與患者不良預(yù)后、腫瘤增殖、腫瘤形成及治療抵抗等一系列惡性疾病有關(guān)[19]。ABCG2是近年發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥蛋白及腫瘤干細胞亞群側(cè)群的分選標(biāo)志，有報道指出，ABCG2在鼻咽癌細胞中高表達與鼻咽癌細胞增殖、分化及腫瘤干細胞樣特性呈正相關(guān)性[20]。本實驗結(jié)果顯示，過表達circ_LARP4明顯抑制鼻咽癌CNE2和5-8F細胞中腫瘤干細胞標(biāo)記物OCT4、Nanog和ABNG2蛋白表達，同時降低腫瘤干細胞成球率。結(jié)果提示，過表達circ_LARP4通過下調(diào)腫瘤干細胞標(biāo)記蛋白水平抑制鼻咽癌腫瘤干細胞樣特性。

線粒體是細胞能量供應(yīng)及代謝的主要場所，參與調(diào)節(jié)細胞能量轉(zhuǎn)換、細胞凋亡及氧化應(yīng)激等過程，與維持細胞正常功能密切相關(guān)。線粒體在產(chǎn)生能量時會將電化學(xué)勢能儲存于線粒體內(nèi)膜，若線粒體膜兩側(cè)的質(zhì)子及其它離子濃度分布不均勻就會形成膜電位，線粒體膜電位的穩(wěn)定對維持細胞正常生理功能具有重要作用。Guo等[21]發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌細胞線粒體膜電位能夠抑制細胞增殖，并促進細胞凋亡和自噬。本研究結(jié)果顯示，細胞轉(zhuǎn)染過表達circ_LARP4后，鼻咽癌CNE2和5-8F細胞線粒體膜電位明顯增高，后續(xù)我們又檢測線粒體損傷標(biāo)記物Bax、Bcl-2蛋白水平及SOD和MDA含量，結(jié)果顯示，過表達circ_LARP4組細胞線粒體中Bax/Bcl-2顯著增高，SOD含量降低，MDA含量升高。結(jié)果進一步提示，過表達circ_LARP4能夠降低鼻咽癌細胞線粒體膜電位，加速細胞線粒體損傷。

大量的研究發(fā)現(xiàn)circRNA可作為miRNA的“分子海綿”，調(diào)控下游靶基因的表達，間接調(diào)控鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展[22]。目前關(guān)于circ_LARP4在鼻咽癌中作用的研究還比較有限，本研究通過Starbase分析，得出一系列可能的circ_LARP4靶miRNA，在dbDEMC2數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)，miR-135b-5p和miR-195-5p是其在鼻咽癌中潛在的靶標(biāo)，并在CNE2細胞中簡單驗證了miR-135b-5p和miR-195-5p對circ_LARP4作用的影響。當(dāng)然，局限于數(shù)據(jù)庫不夠成熟以及驗證不夠深入，這2種miRNA與circ_LARP4在鼻咽癌中的具體相互作用還有待研究。

綜上所述，過表達circ_LARP4抑制鼻咽癌細胞增殖、腫瘤干細胞樣特性，并促進細胞線粒體損傷，可能抑制鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程。