腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物DCLK1通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移*

劉 偉， 代偉林， 王英杰， 黃 晶

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，武漢 430022 2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，武漢 430023

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤，起源于鼻咽上皮細(xì)胞[1-2]。雖然NPC在世界其他地區(qū)相對(duì)少見(jiàn)，但在中國(guó)南部和東南亞某些地區(qū)尤為流行，最高年發(fā)病率為30/10萬(wàn)[3-4]。由于鼻咽癌特殊的解剖位置，放射治療仍然是主要的治療方法。盡管隨著現(xiàn)代放射治療技術(shù)和診斷成像技術(shù)的進(jìn)步，臨床結(jié)局有了顯著改善，但仍有20%和30%的鼻咽癌患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5]。由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，鼻咽癌患者的5年生存率仍然很低，尤其是晚期患者[6]。因此，有必要尋找新的、有效的鼻咽癌治療方法，以進(jìn)一步改善鼻咽癌患者的預(yù)后。

DCLK1是一種微管相關(guān)蛋白激酶，是胰腺和腸道干細(xì)胞標(biāo)記物。DCLK1在許多癌癥中過(guò)度表達(dá)，如結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、肝癌和食管癌[7]。越來(lái)越多研究證據(jù)表明，DCLK1在控制腫瘤干細(xì)胞、腫瘤轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和癌細(xì)胞生長(zhǎng)、自我更新的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[8-10]。Chandrakesan等[11]的研究表明，通過(guò)旁分泌機(jī)制和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(ATM)介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)(DDR)的激活，DCLK1在簇狀細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)了腸上皮放射性抵抗和自我更新及存活。此外，Ji等[7]發(fā)現(xiàn)，以DCLK1為靶點(diǎn)的miR-15b不僅抑制結(jié)直腸癌的自我更新和致瘤性，而且提高癌細(xì)胞對(duì)化療/放療的敏感性。最近，有研究表明，Niclosamide(一種FDA批準(zhǔn)的驅(qū)蟲藥)可阻止淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1(LEF1)介導(dǎo)的DCLK1轉(zhuǎn)錄，從而降低腫瘤干細(xì)胞特性，并使結(jié)直腸癌對(duì)放化療敏感[12-13]。綜上所述，DCLK1在腫瘤干性、腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、放化療敏感性中扮演著非常重要的角色。然而，DCLK1在鼻咽癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能尚不明確。

本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究DCLK1調(diào)控鼻咽癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能，以期為鼻咽癌尋找潛在的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人鼻咽癌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(中國(guó)上海)。鼻咽癌細(xì)胞系在RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，該培養(yǎng)液中添加10%胎牛血清和100 U/mL青霉素和鏈霉素，并在37℃、含5%CO2的濕空氣中培養(yǎng)。鼻咽正常上皮細(xì)胞系NP69在角質(zhì)形成細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)(購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司)。LipofectamineTM2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。抗DCLK1抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。AKT抑制劑(AKT-IN-1)購(gòu)于美國(guó)MCS公司。DCLK1敲低shRNA質(zhì)粒和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)于中國(guó)上海吉?jiǎng)P公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)印跡法 提取處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，處理樣品蛋白質(zhì)和熱變性。SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移膜，包封，然后加入兔抗人RPA1一級(jí)抗體，孵育4℃過(guò)夜，TBST洗滌3次，5 min/次，加入二級(jí)抗體孵育2 h，TBST洗滌3次，5 min/次。使用NBT/BCIP顯色。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 脫蠟后組織切片抗原修復(fù)，水合(1 mmol/L草酸四乙胺，pH8.0)，阻斷非特異性蛋白1 h，RPA1抗體孵育30 min，加生物素標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和HRP工作液標(biāo)記的親和素酶，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，脫水，透明，貼裝。用0.01 mol/L PBS(pH7.5)代替RPA1抗體作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。RPA1的陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞核內(nèi)的棕黃色顆粒。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 單細(xì)胞懸液接種于6孔板(1000個(gè)/孔)中，24 h后，給予不同劑量的輻射(0、1、2、4、6 Gy)，每個(gè)劑量設(shè)3孔。輻射后，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 單細(xì)胞懸浮液接種于24孔板(5000個(gè)/孔)，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)時(shí)間適當(dāng)。加入MTT溶液20 μL/孔(5 g/L MTT溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取培養(yǎng)液并加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀讀取470 nm處的吸光度值。

1.2.5 構(gòu)建皮下移植瘤模型 將shControl和shDCLK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE1，構(gòu)建DCLK1敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株。shDCLK1-#1、shDCLK1-#2是敲低DCLK1的2條shRNA，以鑒別假陽(yáng)性。將上述鼻咽癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，構(gòu)建小鼠原位移植瘤模型，觀察裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況。

1.2.6 構(gòu)建尾靜脈轉(zhuǎn)移瘤模型 將shControl和shDCLK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE1，構(gòu)建DCLK1敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株和對(duì)照細(xì)胞株。將上述鼻咽癌細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注射至裸鼠體內(nèi)，構(gòu)建小鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DCLK1在鼻咽癌細(xì)胞和組織中異常高表達(dá)

如圖1A、1B所示，與正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69相比，DCLK1在鼻咽癌細(xì)胞株(CNE1、CNE2、5-8F)表達(dá)明顯升高。本研究還檢測(cè)了DCLK1在鼻咽癌和非鼻咽癌組織中的表達(dá)(n=20)，與非鼻咽癌組織相比，在鼻咽癌組織DCLK1免疫組織化學(xué)染色中褐黃色顆粒增多。該結(jié)果表明，鼻咽癌DCLK1的表達(dá)顯著高于非鼻咽癌組織(圖1C、1D)(均P<0.05)。

A：Western blot檢測(cè)DCLK1在鼻咽癌細(xì)胞株中(CNE1、CNE2、5-8F)的表達(dá)；B：定量分析Western blot檢測(cè)結(jié)果，與NP69比較，*P<0.05；C：免疫組化檢測(cè)DCLK1在鼻咽癌組織中的表達(dá)；D：定量分析免疫組化檢測(cè)結(jié)果(n=20)，△P<0.05圖1 DCLK1在鼻咽癌細(xì)胞和組織中異常高表達(dá)Fig.1 DCLK1 expression is extremely high in nasopharyngeal carcinoma cells and tissues

2.2 敲低DCLK1表達(dá)抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)

首先，我們構(gòu)建了DCLK1 shRNA質(zhì)粒(shDCLK1)，并驗(yàn)證了其對(duì)DCLK1的敲低效率(圖2A)。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組(shControl組)相比，shDCLK1組的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖2B)。該結(jié)果表明，敲低DCLK1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力。平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組(shControl組)相比，shDCLK1組的細(xì)胞平板克隆數(shù)目明顯減少(圖2C、2D)。該結(jié)果表明，敲低DCLK1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的平板克隆形成能力。而且，本研究構(gòu)建了裸鼠皮下移植瘤模型，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(圖3A)。與對(duì)照組(shControl組)裸鼠皮下瘤相比，shDCLK1組裸鼠皮下瘤的體積明顯較小(圖3B)。

1：shControl；2：shDCLK1-#1；3：shDCLK1-#2；A：Western blot檢測(cè)shRNA敲低DCLK1表達(dá)的效果；B：細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低DCLK1表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響；C：平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低DCLK1表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞平板克隆形成能力的影響；D：定量分析平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果；與shControl組比較，**P<0.01圖2 敲低DCLK1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖能力Fig.2 Knockdown of DCLK1 expression inhibits the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells

A：構(gòu)建裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤模型；B：觀察記錄各實(shí)驗(yàn)分組中裸鼠皮下瘤體積(n=6)，**P<0.01圖3 敲低DCLK1表達(dá)抑制裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)Fig.3 Knockdown DCLK1 expression inhibits subcutaneous tumor growth in nude mice with nasopharyngeal carcinoma

該結(jié)果表明，敲低DCLK1表達(dá)可抑制裸鼠鼻咽癌皮下移植瘤的生長(zhǎng)。

2.3 敲低DCLK1表達(dá)抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移

DCLK1在鼻咽癌中高表達(dá)并調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組(shControl組)相比，shDCLK1組的細(xì)胞遷移數(shù)目明顯減少(圖4A)。該結(jié)果表明，敲低DCLK1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力。而且，本研究構(gòu)建了裸鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)移瘤模型，進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。與對(duì)照組(shControl組)相比，shDCLK1組裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目明顯減少(圖4B)。該結(jié)果表明，敲低DCLK1表達(dá)可抑制鼻咽癌裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成。

1：shControl；2：shDCLK1-#1；3：shDCLK1-#2；A：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低DCLK1表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響(5個(gè)視野，×100)；B：構(gòu)建裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移瘤模型，觀察裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤形成情況，箭頭所示為裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤圖4 敲低DCLK1表達(dá)抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移Fig.4 Knockdown of DCLK1 expression inhibits the metastasis of nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells

2.4 DCLK1通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌CNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移

與對(duì)照組(shControl組)相比，shDCLK1組的p-AKT表達(dá)降低(圖5A)，表明敲低DCLK1可抑制AKT信號(hào)通路。為了進(jìn)一步證明DCLK1是否通過(guò)AKT信號(hào)通路發(fā)揮促腫瘤發(fā)展的功能，本研究應(yīng)用AKT抑制劑(AKT-IN-1)抑制AKT信號(hào)通路。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，與過(guò)表達(dá)對(duì)照組(Vector組)相比，DCLK1過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞生長(zhǎng)能力明顯增強(qiáng)，而DCLK1+AKT-IN-1組的細(xì)胞生長(zhǎng)能力顯著減弱(圖5B)。這表明DCLK1可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的增殖，而DCLK1促腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)功能可被AKT抑制劑(AKT-IN-1)阻斷。平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示，與Vector組相比，DCLK1過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞平板克隆數(shù)目顯著增加，而DCLK1+AKT-IN-1組的細(xì)胞平板克隆數(shù)目顯著減少(圖5C)。這表明DCLK1可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的平板克隆形成，而DCLK1促腫瘤細(xì)胞平板克隆形成的生物學(xué)功能可被AKT抑制劑(AKT-IN-1)阻斷。此外，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，與Vector組相比，DCLK1過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增加，而DCLK1+AKT-IN-1組的細(xì)胞遷移數(shù)目顯著減少(圖5D)。這表明DCLK1可促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的遷移，而DCLK1促腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能可被AKT抑制劑(AKT-IN-1)阻斷。上述研究結(jié)果表明，DCLK1通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌CNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。

1：Vector；2：DCLK1；3：DCLK1+AKT-IN-1；A：Western blot檢測(cè)shRNA敲低DCLK1表達(dá)對(duì)AKT、p-AKT蛋白表達(dá)的影響；B：細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)DCLK1表達(dá)及應(yīng)用AKT抑制劑(AKT-IN-1)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖能力的影響，與Vector組比較，**P<0.01；C：平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)DCLK1表達(dá)及應(yīng)用AKT抑制劑(AKT-IN-1)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞平板克隆形成能力的影響；D：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上調(diào)DCLK1表達(dá)及應(yīng)用AKT抑制劑(AKT-IN-1)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響圖5 DCLK1通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌CNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移Fig.5 DCLK1 promotes the growth and metastasis of nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells through AKT signaling pathway

3 討論

據(jù)報(bào)道，有多種因素，如EB病毒感染、環(huán)境因素和遺傳易感基因，都與鼻咽癌的發(fā)生有關(guān)[14]。由于鼻咽癌患者死亡的兩個(gè)主要原因是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此進(jìn)一步闡明鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制至關(guān)重要。本研究表明，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物DCLK1在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

DCLK1是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)microRNA依賴性機(jī)制(即下調(diào)幾種關(guān)鍵的腫瘤抑制因子microRNA)參與促進(jìn)EMT、腫瘤轉(zhuǎn)移等。例如，miR-613通過(guò)下調(diào)DCLK1從而抑制人肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和侵襲[15]，而miR-137通過(guò)下調(diào)DCLK1進(jìn)而抑制結(jié)腸癌的惡性生物學(xué)特征[16]。miR-424還通過(guò)直接調(diào)節(jié)DCLK1抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存活和侵襲[17]。此外，DCLK1的高表達(dá)已被證明可促進(jìn)人胰腺癌的發(fā)生發(fā)展[18]。尤其重要的是，MicroRNA-223-5p通過(guò)靶向DCLK1抑制鼻咽癌的進(jìn)展[19]。以上研究表明，DCLK1的異常高表達(dá)與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在本研究中，DCLK1在鼻咽癌細(xì)胞株和臨床鼻咽癌組織標(biāo)本中均高表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)表明，敲低DCLK1表達(dá)可抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞的增殖和克隆形成，以及降低CNE1細(xì)胞的遷移。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，敲低DCLK1表達(dá)可抑制鼻咽癌CNE1細(xì)胞在裸鼠皮下移植瘤中生長(zhǎng)，以及減少鼻咽癌CNE1細(xì)胞在裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移模型中肺轉(zhuǎn)移的形成。

據(jù)報(bào)道，DCLK1通過(guò)多種信號(hào)通路參與人類癌癥的發(fā)生進(jìn)展。例如，Wang等[20]報(bào)道DCLK1通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。Liu等[21]指出，lncRNA SNHG1通過(guò)DCLK1介導(dǎo)的Notch1途徑促進(jìn)胃癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Zhang等[22]研究報(bào)道，DCLK1基因敲除可能通過(guò)抑制β-catenin/c-Myc途徑調(diào)節(jié)食管鱗狀細(xì)胞癌的增殖、遷移、侵襲和化療敏感性，從而抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。尤其重要的是，Liu等[23]研究報(bào)道DCLK1通過(guò)PI3K/Akt/Sp1軸誘導(dǎo)NF-κB p65亞單位表達(dá)，并通過(guò)PI3K/Akt/IκBα途徑激活NF-κB p65，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果同樣表明，在鼻咽癌CNE1細(xì)胞中DCLK1上調(diào)AKT信號(hào)通路，而且AKT抑制劑可抑制DCLK1誘導(dǎo)的癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DCLK1在鼻咽癌中高表達(dá)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明DCLK1促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步分子機(jī)制研究表明，DCLK1通過(guò)AKT信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。因此，本研究表明DCLK1具有調(diào)控鼻咽癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能，有可能成為鼻咽癌潛在的治療靶點(diǎn)。