TRPC6通過GSK-3β/β-catenin通路調(diào)控EMT減輕TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷*

張彥紅， 韓永明， 陳澤斌， 廖燕宏

1湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，武漢 430065 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2解剖學(xué)系，3神經(jīng)系統(tǒng)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030

我國慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國成人CKD患病率約為10.8%，據(jù)此推算每10個(gè)成年人就有1人患病。而腎纖維化是引起各種CKD的共同病理特征[1]。近年來大量的文獻(xiàn)證實(shí)，腎小管上皮細(xì)胞(tubular epithelial cell，TEC)通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，可從不同方面促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生發(fā)展[2-3]。瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential channels，TRPCs)是一種非選擇性陽離子通道，包含7個(gè)成員，其中TRPC6參與多種腎病的發(fā)生發(fā)展[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)抑制TRPC6活性或者敲除TRPC6基因具有一定的抗纖維化作用[6]，從而對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用，但其中涉及的分子機(jī)制還不是十分清楚。本實(shí)驗(yàn)以TRPC6基因敲除型(TRPC6 knockout，TRPC6-/-)和野生型(wild type，WT)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分離培養(yǎng)原代TEC，從細(xì)胞水平研究TRPC6通過調(diào)控EMT減輕腎纖維化損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

本實(shí)驗(yàn)以SPF級(jí)成年雄性TRPC6-/-和WT小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。其中WT小鼠為構(gòu)建TRPC6-/-小鼠的背景小鼠129 SvEv，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，TRPC6-/-小鼠由美國NIH/NIEHS Lutz Birnbaumer實(shí)驗(yàn)室提供。EMT分子標(biāo)記和通路相關(guān)抗體購買于CST公司。

1.2 分離培養(yǎng)TEC與實(shí)驗(yàn)分組

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分離培養(yǎng)原代TEC，具體步驟如下：①取體質(zhì)量20～25 g的雄性成年小鼠1～2只，無菌室頸椎脫臼，75%乙醇浸泡消毒，獲取腎臟，剝?nèi)ケ荒?，放置冰上；②分離腎皮質(zhì)和淺髓部分，切成1～3 mm3大小的組織塊，隨后轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中；③離心管中加入2.5～3.0 mL含有0.1% Ⅱ型膠原酶的消化液于37℃恒溫水浴鍋中振蕩消化10～15 min，吸取上清，隨后加入等體積預(yù)冷的含10%血清培養(yǎng)液終止消化；④重復(fù)上述步驟3次左右，集合所有消化液，分別使用80目和200目細(xì)胞篩雙重過濾，獲得腎小管節(jié)段；⑤用含有10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸腎小管節(jié)段并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，放入37℃ 5% CO2細(xì)胞孵育箱中靜置培養(yǎng)。第3天，細(xì)胞從腎小管節(jié)段周圍長出，換液，第4～5天TEC可鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。分離培養(yǎng)的原代TEC，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)處理后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組：WT對(duì)照組、WT TGF-β1組、TRPC6-/-對(duì)照組、TRPC6-/-TGF-β1組。

1.3 培養(yǎng)的TEC進(jìn)行TGF-β1誘導(dǎo)處理

TEC在培養(yǎng)3 d時(shí)，加入5 ng/mL的TGF-β1進(jìn)行誘導(dǎo)處理72 h，對(duì)照組加入同等體積的無菌檸檬酸鹽(pH=3.0)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況并采集圖像。

1.4 免疫熒光染色技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)β-catenin的表達(dá)水平

TEC從細(xì)胞孵育箱拿出，棄掉培養(yǎng)液后加入4%的多聚甲醛室溫固定15 min；以1%的Triton X-100/PBS室溫破膜10 min；1∶100的一抗/PBS稀釋液37℃孵育1.5 h；1∶150的熒光二抗/PBS稀釋液室溫避光孵育2 h；DAPI染核；抗猝滅封片劑封片；共聚焦顯微鏡下觀察β-catenin的表達(dá)水平。

1.5 采用Western blot技術(shù)檢測(cè)TEC中TRPC6及腎纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

細(xì)胞總蛋白提取：收集各組TEC，用超聲儀將細(xì)胞裂解，離心后取上清。

以10%或12%的PAGE膠電泳，PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜75 min，5%脫脂牛奶封閉30 min；搖床上4℃過夜孵育一抗，室溫孵育二抗1.0～1.5 h，新鮮配置的ECL顯影液均勻平鋪在膜上，觀察并采集圖像。利用Western blot檢測(cè)TEC中TRPC6、EMT分子標(biāo)記物(E-cad，Cadh16，α-SMA)和GSK-3β/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 原代TEC的分離培養(yǎng)

小鼠頸椎脫臼處死，經(jīng)過75%乙醇消毒，在無菌條件下獲取新鮮腎臟，取得皮質(zhì)和淺層髓質(zhì)的腎小管節(jié)段。

細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d后，TEC從腎小管節(jié)段周緣慢慢爬出，細(xì)胞不斷地增殖，數(shù)量逐漸增多，最終可平鋪整個(gè)培養(yǎng)皿。正常條件下，培養(yǎng)的TEC呈鵝卵石狀或者不規(guī)則的多邊形(圖1)。

A：新鮮分離的小鼠腎臟；B：分離的原代TEC隨培養(yǎng)時(shí)間延長的形態(tài)變化，培養(yǎng)3 d后，少量細(xì)胞從腎小管節(jié)段組織周圍長出，培養(yǎng)第5天，細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿圖1 原代TEC的分離培養(yǎng)Fig.1 The isolation and culture of primary TEC

2.2 原代TEC經(jīng)TGF-β1處理后TRPC6表達(dá)水平升高

分離培養(yǎng)的WT小鼠原代TEC，加入5 ng/mL TGF-β1，處理0、12、24、48、72 h，收集細(xì)胞，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組TRPC6的表達(dá)水平。結(jié)果(圖2)顯示，原代TEC經(jīng)TGF-β1處理48、72 h后，TRPC6的表達(dá)水平明顯增高(均P<0.01)。

WT小鼠原代TEC經(jīng)TGF-β1處理0、12、24、48、72 h后，A：采用Western blot技術(shù)檢測(cè)TRPC6蛋白的表達(dá)情況；B：Western blot檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與TGF-β1 作用0 h組比較，**P<0.01，n=3圖2 WT小鼠原代TEC經(jīng)TGF-β1處理后TRPC6的表達(dá)水平Fig.2 The expression level of TRPC6 in primary TEC stimulated with TGF-β1

2.3 原代TEC經(jīng)TGF-β1處理后發(fā)生EMT且GSK-3β/β-catenin被激活

為了研究腎纖維化是否與EMT有關(guān)，以及其中涉及的分子機(jī)制，WT小鼠原代TEC經(jīng)TGF-β1處理0、12、24、48、72 h，采用Western blot技術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)EMT分子標(biāo)記以及GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果(圖3A～D)顯示：原代TEC經(jīng)TGF-β1處理0、12、24、48、72 h后，在WT小鼠中，與對(duì)照組(作用0 h)相比，隨著TGF-β1作用時(shí)間的延長，EMT分子標(biāo)記出現(xiàn)明顯變化，E-cad和Cadh16的表達(dá)水平降低，而α-SMA的表達(dá)水平升高，這說明原代TEC經(jīng)TGF-β1處理后發(fā)生EMT。

另外，Western blot結(jié)果(圖3E～G)顯示：原代TEC經(jīng)TGF-β1處理0、12、24、48、72 h后，p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)水平均明顯升高，這顯示原代TEC經(jīng)TGF-β1處理后細(xì)胞內(nèi)GSK-3β/β-catenin通路被激活。

WT小鼠原代TEC經(jīng)TGF-β1處理0、12、24、48、72 h，A：采用Western blot技術(shù)檢測(cè)EMT分子標(biāo)記(E-cad，Cadh16，α-SMA)的表達(dá)情況；B、C、D：EMT分子標(biāo)記(E-cad，Cadh16，α-SMA)的Western blot結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；E：采用Western blot技術(shù)檢測(cè)p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)水平；F、G：Western blot結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與TGF-β1 作用0 h組比較，*P<0.05 **P<0.01，n=3圖3 WT小鼠原代TEC經(jīng)TGF-β1處理后發(fā)生EMT及GSK-3β/β-catenin通路被激活Fig.3 The appearance of EMT and activation of GSK-3β/β-catenin signaling pathway in TEC stimulated with TGF-β1

2.4 TRPC6敲除后EMT被抑制

為了從細(xì)胞水平進(jìn)一步研究敲除TRPC6對(duì)腎臟的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)以WT和TRPC6-/-小鼠為研究對(duì)象，分離培養(yǎng)TEC，并經(jīng)TGF-β1處理72 h后，采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)EMT分子標(biāo)記(E-cad，Cadh16，α-SMA)的表達(dá)情況。

Western blot(圖4)結(jié)果顯示：在WT小鼠中，與對(duì)照組比較，TEC經(jīng)TGF-β1處理72 h后，E-cad和Cadh16表達(dá)下降，α-SMA表達(dá)升高；TRPC6-/-小鼠與WT小鼠相比，EMT分子標(biāo)記的表達(dá)出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，即TGF-β1處理后表達(dá)下降的E-cad和Cadh16出現(xiàn)回升，表達(dá)升高的α-SMA出現(xiàn)了下降。

TEC經(jīng)TGF-β1處理72 h后，A：采用Western blot技術(shù)檢測(cè)WT和TRPC6-/-小鼠TEC中EMT分子標(biāo)記(E-cad，Cadh16，α-SMA)的表達(dá)情況；B、C、D：EMT分子標(biāo)記的Western blot結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，*P<0.05 **P<0.01，n=3圖4 敲除TRPC6對(duì)TGF-β1處理后TEC中EMT的調(diào)控作用Fig.4 The regulatory effect of TRPC6 knockout on EMT in TEC stimulated with TGF-β1

這說明敲除TRPC6可在一定程度上抑制腎纖維化中TGF-β1所致EMT進(jìn)程，但其中涉及的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

2.5 TRPC6敲除后GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路下調(diào)

為明確腎纖維化中TRPC6調(diào)控EMT的分子機(jī)制是否與GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)，TEC經(jīng)TGF-β1處理72 h后，采用免疫熒光技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)情況。免疫熒光結(jié)果(圖5A)顯示：在WT小鼠中TEC經(jīng)TGF-β1處理72 h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)升高，而TRPC6敲除后，TGF-β1刺激所致細(xì)胞內(nèi)升高的β-catenin表達(dá)明顯下降。Western blot(圖5B、5C、5D)結(jié)果顯示：原代TEC經(jīng)TGF-β1處理72 h后，p-GSK-3β和β-catenin表達(dá)明顯升高，而TRPC6敲除后，TGF-β1引起的p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)升高均被下調(diào)。

TEC經(jīng)TGF-β1處理72 h后，A：采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)WT和TRPC6-/-小鼠中β-catenin的表達(dá)情況，標(biāo)尺=20 μm；B：采用Western blot技術(shù)檢測(cè)WT和TRPC6-/-小鼠中p-GSK-3β和β-catenin的表達(dá)情況；C、D：Western blot結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，**P<0.01，n=3圖5 敲除TRPC6下調(diào)GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路Fig.5 TRPC6 knockout negatively regulates the GSK-3β/β-catenin signaling pathway

這充分說明了TEC經(jīng)TGF-β1處理后，GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路被激活，敲除TRPC6后GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路被下調(diào)，這可能與TRPC6調(diào)控的EMT密切相關(guān)。

3 討論

纖維化是一種正常的組織修復(fù)過程，反應(yīng)過度就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和膠原纖維超負(fù)荷產(chǎn)生和累積，使得器官硬化從而導(dǎo)致功能下降，直至末期器官功能衰竭。腎纖維化是CKD發(fā)展到一定階段的共同通路，最終將導(dǎo)致終末期腎衰竭。此過程中發(fā)揮功能的主要效應(yīng)細(xì)胞是肌成纖維細(xì)胞，但其來源頗具爭議[7]。有研究發(fā)現(xiàn)TEC經(jīng)EMT，是肌成纖維細(xì)胞的一個(gè)重要來源，促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生發(fā)展[8-9]。

TEC是構(gòu)成腎小管的最主要細(xì)胞，對(duì)維持腎臟正常的生理功能非常重要。在外界損傷因素的刺激下，TEC經(jīng)EMT，可從多方面促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生發(fā)展：①使細(xì)胞停滯在G2/M期，影響細(xì)胞更新，阻止自我修復(fù)；②分泌炎性因子，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)；③通過旁分泌作用，刺激固有的成纖維細(xì)胞增殖活化以及外周細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，增加胞外基質(zhì)的合成、分泌和沉積；④分泌和活化多種促纖維化的細(xì)胞因子，比如PDGF、TGF-β1、MMP等[10-11]。

有關(guān)腎纖維化TEC的研究在細(xì)胞水平大多集中在細(xì)胞系，比如NRK-52E、HEK293T和HK-2，以原代TEC進(jìn)行的相關(guān)研究卻非常少見[12-13]。本實(shí)驗(yàn)為了探索TEC在腎纖維化中的重要作用，采用組織爬片法從新鮮腎臟中分離培養(yǎng)原代TEC，首先通過細(xì)胞篩的雙重過濾獲取腎小管節(jié)段，將其放在合適的培養(yǎng)液中，隨后組織周緣逐漸長出多邊形的TEC，以此為實(shí)驗(yàn)對(duì)象研究TRPC6對(duì)腎纖維化中EMT的調(diào)控作用及分子機(jī)制。

EMT是一個(gè)比較復(fù)雜的過程，在各種刺激因素的作用下，上皮細(xì)胞典型的上皮標(biāo)記分子表達(dá)降低，而細(xì)胞中原本沒有或者表達(dá)量低的間質(zhì)標(biāo)記分子表達(dá)升高，這在多種細(xì)胞的分化和重塑中都發(fā)揮了重要作用[14]。在腎纖維化過程中，EMT也具有明顯的促進(jìn)作用[12，15]。有關(guān)纖維化的報(bào)道中，TGF-β1是研究最為廣泛的一個(gè)細(xì)胞因子，在多種器官的纖維化和炎癥中都至關(guān)重要[16-17]。且纖維化過程中表達(dá)升高的TGF-β1還與EMT進(jìn)程密切相關(guān)，可通過不同的信號(hào)通路促進(jìn)EMT的發(fā)生發(fā)展，因此它常用來作為EMT發(fā)生的體外誘導(dǎo)劑[18-20]。TGF-β1誘導(dǎo)EMT發(fā)生所涉及的信號(hào)通路有很多，其中GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路在EMT的調(diào)控中具有重要的促進(jìn)作用[21-22]。本實(shí)驗(yàn)中，原代培養(yǎng)的TEC經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)EMT分子標(biāo)記表達(dá)水平發(fā)生明顯的變化，細(xì)胞內(nèi)GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)也明顯升高，這說明原代TEC經(jīng)TGF-β1刺激后細(xì)胞發(fā)生EMT，同時(shí)GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路被激活，這在一定程度上揭示原代TEC經(jīng)TGF-β1刺激后發(fā)生的EMT與GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)。

TRPC6是瞬時(shí)受體電位通道家族中的一員，廣泛表達(dá)在腎臟的多種細(xì)胞上，包括腎小管上皮細(xì)胞、足細(xì)胞和系膜細(xì)胞等，且與多種腎臟疾病密切相關(guān)[4，6]。TRPC6基因突變還會(huì)引發(fā)腎小球硬化癥，影響腎臟的正常過濾功能[23]。而敲除TRPC6基因或者抑制TRPC6活性，對(duì)危險(xiǎn)因素引起的腎損傷具有一定的保護(hù)作用。因此TRPC6作為治療腎病的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，一直以來受到人們的廣泛關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)中，為了研究TRPC6對(duì)腎纖維化的影響，我們分離培養(yǎng)原代TEC，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)TRPC6的表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)TEC經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生EMT，這說明TRPC6與TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞ETM密切相關(guān)，而TRPC6-/-小鼠與WT小鼠相比，其TEC經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，細(xì)胞內(nèi)EMT分子標(biāo)記的改變明顯發(fā)生逆轉(zhuǎn)，這說明敲除TRPC6可在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，同時(shí)，TRPC6敲除后，因TGF-β1刺激升高的p-GSK-3β和β-catenin表達(dá)明顯下降，說明該信號(hào)通路被下調(diào)，據(jù)此我們推測(cè)TRPC6可能通過GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控EMT，從而影響TGF-β1誘導(dǎo)的TEC損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲除TRPC6可通過抑制EMT減輕TGF-β1誘導(dǎo)的TEC損傷，且與GSK-3β/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)，在細(xì)胞水平上證實(shí)敲除TRPC6可減輕腎臟的纖維化損傷，從而對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用，為以后治療CKD新策略的研發(fā)提供了理論依據(jù)。同時(shí)，雖然已有大量研究證實(shí)損傷TEC發(fā)生的EMT在腎纖維化過程中是必需的，且抑制EMT可有效減輕腎纖維化損傷，但腎纖維化中EMT發(fā)生的分子機(jī)制還不是十分清楚。因此，研究EMT發(fā)生的相關(guān)分子機(jī)制，對(duì)于充分理解和研究腎纖維化進(jìn)程以及抗纖維化策略也有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。