• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    丁酸鹽對C2C12成肌細(xì)胞的增殖和分化作用

    2022-08-19 06:52:56管理曹子怡陳潔
    老年醫(yī)學(xué)與保健 2022年3期
    關(guān)鍵詞:成肌細(xì)胞肌少癥貨號(hào)

    管理,曹子怡,陳潔

    復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科,上海 200040

    肌少癥是一種與年齡相關(guān)的進(jìn)行性、全身性骨骼肌疾病,涉及肌肉質(zhì)量下降和肌肉功能喪失,可引發(fā)跌倒、骨折、衰弱和死亡等不良后果。回顧性研究提示,亞洲人群的肌少癥患病率為5.5%~25.7%[1-2]。肌少癥的發(fā)生由炎癥、免疫衰老、肌肉蛋白合成代謝、氧化應(yīng)激和肌衛(wèi)星細(xì)胞活性抑制等共同作用[3-7],在機(jī)體活動(dòng)減少和營養(yǎng)不良的情況下,這些機(jī)制會(huì)進(jìn)一步影響肌少癥[8]。因此,抗阻運(yùn)動(dòng)聯(lián)合營養(yǎng)補(bǔ)充是治療和預(yù)防肌少癥的有效方法[9],但由于目前肌少癥的發(fā)病機(jī)制不明,具體的營養(yǎng)素補(bǔ)充劑以及治療靶點(diǎn)仍未有定論。近年來的研究表明,腸道微生物群可能參與肌少癥的發(fā)生,增齡引起的腸道菌群組成及其衍生代謝物改變可以促進(jìn)慢性炎癥和肌肉蛋白合成代謝抵抗,最終導(dǎo)致肌肉質(zhì)量下降和功能受損[10-11]。丁酸鹽是一種短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA),目前已知的丁酸鹽作用多通過抑制組蛋白脫乙酰酶產(chǎn)生的表觀遺傳效應(yīng)[12]。雖然SCFA 能夠改善肌肉組織功能,但丁酸鹽本身對肌肉萎縮的影響及具體作用機(jī)制仍有待確定。本研究旨在探索腸道菌群代謝物在肌少癥人群中的改變,明確SCFAs(尤其是丁酸鹽)對肌肉組織的作用,為肌少癥的防治提供嶄新思路。

    1 材料和方法

    1.1 一般資料

    2020年11月—12月,經(jīng)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后入選共和新路街道及甘泉路街道的社區(qū)老年人14 例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥60 歲;(2)性別不限;(3)本地常住人口。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)常年臥床;(2)體成分發(fā)生急性變化(顯著水腫或脫水);(3)發(fā)熱、感染或不明原因傳染病;(4)患有嚴(yán)重心、肺、腎和腦疾??;(5)近3 個(gè)月使用抗生素、非甾體抗炎藥、抗過敏藥或類固醇激素;(6)近3 個(gè)月患有嚴(yán)重影響身體活動(dòng)的疾?。ㄊ中g(shù)或骨折);(7)過去1 周存在吸煙、飲酒等影響腸道菌群的行為。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(20190068),所有受試者自愿參與本研究,并簽署知情同意書。

    14 例受試者年齡62~85 歲,平均(71.5 ±8.1)歲,其中男性5 例、女性9 例,肌少癥6 例、非肌少癥8例。與非肌少癥組比較,肌少癥組四肢骨骼肌質(zhì)量(appendicular skeletal muscle mass,ASM)降低,6 m 步速減慢,丁酸鹽水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2 組的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、骨骼肌質(zhì)量指數(shù)(appendicular skeletal muscle mass index,ASMI)和握力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后續(xù)研究選擇丁酸鹽作為干預(yù)因素。見表1。

    表1 2 組一般資料比較(±s,n=14)

    表1 2 組一般資料比較(±s,n=14)

    項(xiàng)目 非肌少癥組(n=8) 肌少癥組(n=6) t/χ2 P年齡(歲) 62~80 (69.4 ±6.8) 63~85 (74.3 ±9.5) -1.136 0.278性別[例(%)]— 1.000男性 3 (37.50) 2 (33.33)女性 5 (62.50) 4 (66.67)BMI (kg·m -2) 22.96 ±2.33 20.68 ±2.53 1.746 0.106 ASM (kg) 18.10 ±3.66 14.30 ±1.86 2.531 0.028 ASMI (kg·m -2) 6.63 ±0.84 5.75 ±0.67 2.094 0.058握力(kg) 31.44 ±8.13 23.10 ±6.05 2.104 0.057 6 m 步速(m·s -1) 1.28 ±0.18 1.01 ±0.23 2.495 0.028丁酸鹽(μmol·g -1) 30.79 ±1.48 14.37 ±8.32 2.429 0.032

    1.2 肌少癥診斷

    1.2.1 肌肉質(zhì)量通過人體成分分析儀(Inbody 270)檢測受試者的ASM,ASMI=ASM/身高2。

    1.2.2 肌肉力量受試者站立位,雙臂自然垂于身體兩側(cè),用力握住握力器(瑞獅生物科技有限公司)手柄,測量3 次,記錄測量最大值。

    1.2.3 軀體功能受試者以日常步速沿直線方向行走6 m,可借助拐杖(不鼓勵(lì)使用)。共測試2 次,計(jì)算2 次的平均6 m 步速。

    采用2019年亞洲肌少癥工作組[13]推薦的診斷閾值評估肌少癥:(1)男性ASMI<7.0 kg/m2、女性ASMI<5.7 kg/m2為肌肉質(zhì)量下降;(2)男性握力<28.0 kg、女性握力<18.0 kg 為肌肉力量下降;(3)步速<1 m/s為軀體功能受損。在滿足肌肉質(zhì)量下降的基礎(chǔ)上,握力與步速符合任1 項(xiàng)即可確診為肌少癥,據(jù)此將所有受試者分為肌少癥組和非肌少癥組。

    1.3 標(biāo)本采集

    采集受試者糞便樣本,并于-80 ℃冰箱保存,由麥特繪普生物科技(上海)有限公司提取代謝物,經(jīng)衍生化處理后基于UPLC-MS/MS 平臺(tái),通過Q300TM試劑盒(麥特繪譜,HY5023R)進(jìn)行代謝物檢測。

    1.4 藥物與試劑

    DMEM 高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素(雙抗)、馬血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國Gibco 公司,貨號(hào)分別為11995065、15140122、16050122、10091148、25200056);抗-Ki67 抗體、抗-Myf5 抗體(英國Abcam公司,貨號(hào)分別為ab15580、ab125301);Hoechst 抗體(美國Thermo Fisher 公司,貨號(hào)H3570);抗-MyoD 抗體(中國Santa Cruz 公司,貨號(hào)sc-377460);抗-MyHC抗體(美國R&D Systems 公司,貨號(hào)MF20);β-Tubulin抗體、二抗鼠IgG 抗體、二抗兔IgG 抗體(美國CST 公司,貨號(hào)分別為5346S、7076S、7074P2);PBS 緩沖液(中國Bioss 公司,貨號(hào)C01-01001);CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所,貨號(hào)CK04);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國Takara 公司,貨號(hào)RR036A);RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(中國碧云天公司,貨號(hào)分別為P0013B、P0012A)。

    1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分化

    1.5.1 溶液制備丁酸鈉購自上海阿拉丁生化科技有限公司(貨號(hào)S102956),充分溶于ddH2O,制成1 000 mmol/L 的丁酸鹽溶液備用,避光環(huán)境下室溫儲(chǔ)存。

    1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組C2C12 成肌細(xì)胞購自富恒生物,應(yīng)用DMEM 高糖培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2~3 d 更換1 次生長培養(yǎng)液(DMEM +10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素)。待細(xì)胞貼壁后,丁鹽酸組每4 mL 培養(yǎng)液加入3 μL 丁酸鹽儲(chǔ)備液,對照組加入等體積、濃度的ddH2O。

    1.5.3 細(xì)胞分化2 組細(xì)胞經(jīng)丁酸鹽和ddH2O處理48 h 后,當(dāng)細(xì)胞密度≥80%時(shí)吸棄生長培養(yǎng)液,加入分化培養(yǎng)液(DMEM +2%馬血清+1%青霉素-鏈霉素)進(jìn)行分化誘導(dǎo),隔天換液,持續(xù)96 h。

    1.6 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    將每孔2 ×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中,每孔加入10 μL CCK-8 進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。恒溫箱孵育1~2 h后,于24 h、48 h 使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度。

    1.7 免疫熒光染色

    丁酸鹽處理48 h 后,檢測C2C12 成肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)。PBS 緩沖液潤洗細(xì)胞2 遍,每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入4%多聚甲醛固定60 min。1 mL PBS 慢洗3 遍,每遍5 min。封閉液(PBS +10% 山羊血清+0.3%Triton)覆蓋皿底,室溫孵育1 h。使用抗-Ki67 抗體標(biāo)記增殖的細(xì)胞核,Hoechst 抗體標(biāo)記全體細(xì)胞核???Ki67 一抗(1∶100)4 ℃冰箱孵育過夜,熒光鼠/兔IgG二抗(1∶500)室溫孵育2 h。PBS 充分洗滌細(xì)胞培養(yǎng)皿后,以PBS 稀釋Hoechst 抗體(1∶500),室溫避光孵育20 min。通過激光共聚焦顯微鏡(德國Leica,TCS SP8)對每個(gè)樣品隨機(jī)取5 個(gè)視野顯像。

    Ki-67 是一種標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的核抗原,Ki-67增殖指數(shù)常被用于評價(jià)細(xì)胞增殖水平。Ki-67 增殖指數(shù)=陽性細(xì)胞核數(shù)/全體細(xì)胞核數(shù)。

    1.8 蛋白免疫印跡檢測

    將處理后的細(xì)胞充分裂解,并加入上樣緩沖液。蛋白樣本移入金屬水浴鍋中100 ℃加熱15 min 變性,室溫下冷卻5 min 后離心,取上清加入SDS-PAGE 凝膠樣品槽。轉(zhuǎn)膜后將0.4 μm 聚偏二氟乙烯膜(美國Merck 公司)放入BSA 封閉液中置低速搖床上封閉1 h。使用MyoD、Myf5、MyHC 一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,鼠/兔IgG 二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。充分洗膜后通過ECL 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行顯影。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,2 組間比較采用Fisher 確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 丁酸鹽促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞增殖

    采用CCK-8 檢測丁酸鹽對C2C12 成肌細(xì)胞增殖能力的影響。與對照組比較,丁酸鹽處理48 h 后C2C12成肌細(xì)胞增殖率上調(diào)。對2 組細(xì)胞的Ki-67 增殖指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,與對照組比較,丁酸鹽組Ki-67 +細(xì)胞核增多(16.82%vs35.96%,P=0.009)。見圖1。

    圖1 丁酸鹽促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞增殖(n=3)

    2.2 丁酸鹽改善C2C12 成肌細(xì)胞分化

    與對照組比較,分化48 h 后丁酸鹽組C2C12 成肌細(xì)胞MyoD、Myf5 的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);分化96 h 后丁酸鹽組C2C12 成肌細(xì)胞MyHC 的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)。見圖2。

    圖2 丁酸鹽改善C2C12 分化水平(n=3)

    3 討論

    近年來測序分析技術(shù)不斷進(jìn)步,幫助研究者挖掘微生物學(xué)標(biāo)志物,實(shí)現(xiàn)由微生物群落的比較到臨床診斷與微生物學(xué)應(yīng)用的跨越[13-14]。人體內(nèi)微生物群落與健康和疾病等因素密切相關(guān)[15-16]。

    目前,已知促進(jìn)骨骼肌生長的特定腸道菌群種類包括干酪乳桿菌、長雙歧桿菌、直腸真桿菌、球狀梭菌和巴氏桿菌。這些菌種通過產(chǎn)生SCFA 來改善肌肉的功能[17-18],而菌群紊亂導(dǎo)致SCFA 減少可引起胰島素抵抗,減少線粒體脂肪酸氧化,繼而引起肌肉內(nèi)脂肪酸沉積增多。這種現(xiàn)象會(huì)使肌肉力量與質(zhì)量下降,并進(jìn)一步促進(jìn)胰島素抵抗,從而形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致肌少癥的發(fā)生[19-20]。此外,SCFA 可以增加血清中胰島素樣生長因子1 的含量,促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞增殖,改善肌肉再生[21]。補(bǔ)充劑(如基于果聚糖的益生元或抗性馬鈴薯淀粉等)可以增加個(gè)別產(chǎn)丁酸菌的相對豐度,提高丁酸的產(chǎn)量[22]。攝取益生元(如菊粉型果聚糖和阿拉伯低聚木糖)有利于促進(jìn)雙歧桿菌與產(chǎn)丁酸菌之間的相互作用,從而增加產(chǎn)量。因此,聯(lián)合營養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)的綜合治療方案,可以促進(jìn)衰弱老人腸道微生物群結(jié)構(gòu)的年輕化。

    本次研究表明,丁酸鹽通過改善成肌細(xì)胞增殖促進(jìn)肌肉再生。一方面丁酸鹽對于C2C12 成肌細(xì)胞有促增殖效應(yīng);另一方面丁酸鹽上調(diào)Myf5、MyoD 的表達(dá)水平,進(jìn)而改善成肌細(xì)胞分化水平。促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)是增殖、分化等細(xì)胞活動(dòng)的基礎(chǔ),對該通路的調(diào)控有利于改善肌細(xì)胞的細(xì)胞活力和蛋白質(zhì)降解。此外,丁酸鹽對能量攝取的調(diào)節(jié)作用以及胞內(nèi)脂滴沉積的緩解,有利于改善肌細(xì)胞的分化水平[23]。通過對組蛋白去乙?;傅囊种?,丁酸鹽還有助于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化[24]。成肌細(xì)胞的促增殖環(huán)境為預(yù)防、治療隨年齡引起的骨骼肌退化提供了新的視角。

    本研究通過對社區(qū)老年人群糞便樣本的代謝物檢測,結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了特定濃度的丁酸鹽對C2C12 成肌細(xì)胞生成的促進(jìn)作用。后續(xù)研究中,更大的樣本量將有利于明確產(chǎn)丁酸菌是否為肌少癥患者與健康人群間的差異菌種,同時(shí)血清學(xué)數(shù)據(jù)有助于確定丁酸鹽與肌少癥之間的相關(guān)性[25]。

    猜你喜歡
    成肌細(xì)胞肌少癥貨號(hào)
    2019亞洲肌少癥診斷共識(shí)下肌少癥相關(guān)危險(xiǎn)因素評估
    Ang Ⅱ誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞萎縮模型的構(gòu)建
    肌少癥對脊柱疾病的影響
    運(yùn)動(dòng)預(yù)防肌少癥
    中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:50:40
    鞋品牌新品爆單“故事匯”
    雙能X線吸收法在肌少癥診治中的研究進(jìn)展
    作者更正致歉說明
    成肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及臨床應(yīng)用前景*
    8-羥鳥嘌呤可促進(jìn)小鼠骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖和分化
    成肌細(xì)胞的臨床應(yīng)用進(jìn)展
    免费看av在线观看网站| 久久久久久久久久久久大奶| 在线观看www视频免费| 免费日韩欧美在线观看| av黄色大香蕉| 久久久久久久久久成人| 九九在线视频观看精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产国语露脸激情在线看| 男女高潮啪啪啪动态图| 一级毛片我不卡| 欧美3d第一页| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲精品自拍成人| 九色成人免费人妻av| 中文字幕av电影在线播放| 9热在线视频观看99| 新久久久久国产一级毛片| 免费在线观看完整版高清| 国产免费一级a男人的天堂| 久久精品国产自在天天线| 欧美xxⅹ黑人| 在线天堂中文资源库| kizo精华| 国产色婷婷99| 久久久国产欧美日韩av| 天堂俺去俺来也www色官网| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一级片'在线观看视频| 久久这里只有精品19| 久久99蜜桃精品久久| 大话2 男鬼变身卡| 国产又色又爽无遮挡免| 久久99热6这里只有精品| 久久久国产一区二区| 大香蕉久久成人网| 老司机影院毛片| 日本黄色日本黄色录像| 黄色配什么色好看| 国产成人精品一,二区| 久久狼人影院| 久久精品国产a三级三级三级| 丝袜脚勾引网站| 午夜老司机福利剧场| 午夜免费鲁丝| 午夜久久久在线观看| 亚洲国产精品专区欧美| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品视频女| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产欧美亚洲国产| 伊人久久国产一区二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 性色avwww在线观看| 色视频在线一区二区三区| 色哟哟·www| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 街头女战士在线观看网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久99一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影| 大陆偷拍与自拍| 伦精品一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 在线观看三级黄色| 狂野欧美激情性bbbbbb| 97超碰精品成人国产| 国产精品 国内视频| 777米奇影视久久| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 日本免费在线观看一区| 精品久久蜜臀av无| 亚洲四区av| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品免费大片| 一级黄片播放器| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 91国产中文字幕| 9色porny在线观看| 伊人久久国产一区二区| 亚洲欧美精品自产自拍| 有码 亚洲区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产精品免费大片| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日韩av免费高清视频| 在现免费观看毛片| 欧美变态另类bdsm刘玥| freevideosex欧美| 免费观看无遮挡的男女| 日本91视频免费播放| 熟女电影av网| 一边亲一边摸免费视频| 下体分泌物呈黄色| 色5月婷婷丁香| 久久99精品国语久久久| 中文字幕av电影在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 黄色配什么色好看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 日韩免费高清中文字幕av| 一个人免费看片子| 久久久亚洲精品成人影院| 黑人猛操日本美女一级片| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美+日韩+精品| 成人手机av| 天堂8中文在线网| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲av电影在线进入| 一级毛片 在线播放| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜福利视频在线观看免费| 国产精品 国内视频| 成人影院久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产男人的电影天堂91| 99热全是精品| 亚洲中文av在线| 国产一区二区在线观看av| 美国免费a级毛片| 丝袜喷水一区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 成年av动漫网址| 国产精品一区二区在线观看99| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品日本国产第一区| 精品人妻在线不人妻| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲国产精品一区三区| 高清在线视频一区二区三区| av网站免费在线观看视频| av一本久久久久| 在线观看www视频免费| 久久久久国产网址| 亚洲精品乱久久久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 熟女av电影| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲,一卡二卡三卡| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲av欧美aⅴ国产| av天堂久久9| 欧美成人精品欧美一级黄| 性高湖久久久久久久久免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 日韩av免费高清视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 看十八女毛片水多多多| 久久久国产一区二区| a级毛色黄片| 免费看光身美女| 国产黄频视频在线观看| av国产久精品久网站免费入址| 久久久久久久亚洲中文字幕| 超色免费av| 国产av国产精品国产| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费观看在线日韩| 人人澡人人妻人| a级毛色黄片| 国产成人精品福利久久| 国产亚洲欧美精品永久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 在线天堂最新版资源| 国产亚洲欧美精品永久| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 高清在线视频一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 国产免费一区二区三区四区乱码| 午夜福利,免费看| 日本wwww免费看| 在线 av 中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 国产欧美日韩一区二区精品| 最近最新中文字幕大全电影3 | 美女高潮到喷水免费观看| 女人被狂操c到高潮| 女同久久另类99精品国产91| 成在线人永久免费视频| 亚洲在线自拍视频| 国产又爽黄色视频| 国产成人av教育| 曰老女人黄片| 在线天堂中文资源库| 精品午夜福利视频在线观看一区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品91无色码中文字幕| 美国免费a级毛片| 久久中文看片网| 日本vs欧美在线观看视频| 国产乱人伦免费视频| 国产精品九九99| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 最近最新免费中文字幕在线| 热re99久久国产66热| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产av又大| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 天堂√8在线中文| 大码成人一级视频| 99久久人妻综合| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产成人精品久久二区二区免费| 在线免费观看的www视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜免费鲁丝| 亚洲视频免费观看视频| x7x7x7水蜜桃| 黄色 视频免费看| 日本a在线网址| 看免费av毛片| 黄色女人牲交| 777米奇影视久久| 一进一出抽搐gif免费好疼 | svipshipincom国产片| 亚洲 国产 在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| www.精华液| 18禁观看日本| 亚洲五月婷婷丁香| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| av有码第一页| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久狼人影院| 国产成人欧美在线观看 | 国产亚洲欧美98| 亚洲三区欧美一区| 亚洲七黄色美女视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产淫语在线视频| 十分钟在线观看高清视频www| 日本黄色视频三级网站网址 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久人妻熟女aⅴ| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 两人在一起打扑克的视频| 午夜两性在线视频| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 一级片'在线观看视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 麻豆国产av国片精品| 午夜激情av网站| 露出奶头的视频| 久久久久久久久免费视频了| 久久精品国产清高在天天线| 夫妻午夜视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 一进一出抽搐动态| 999精品在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产91精品成人一区二区三区| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜影院日韩av| 99香蕉大伊视频| 一二三四在线观看免费中文在| 国产有黄有色有爽视频| 成人精品一区二区免费| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品永久免费网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 在线av久久热| 免费看a级黄色片| 麻豆国产av国片精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 午夜日韩欧美国产| 岛国毛片在线播放| 午夜免费鲁丝| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 搡老岳熟女国产| 免费在线观看亚洲国产| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产成人av教育| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲av欧美aⅴ国产| av电影中文网址| 亚洲精品粉嫩美女一区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲 国产 在线| tocl精华| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美不卡视频在线免费观看 | 老司机福利观看| 韩国精品一区二区三区| 视频区图区小说| 丝袜在线中文字幕| 久9热在线精品视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 视频在线观看一区二区三区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 99热网站在线观看| 乱人伦中国视频| av福利片在线| 999久久久国产精品视频| 成人手机av| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲av熟女| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲在线自拍视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | av视频免费观看在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美色视频一区免费| 国产亚洲av高清不卡| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美精品亚洲一区二区| 1024视频免费在线观看| 麻豆成人av在线观看| 久久亚洲真实| 欧美性长视频在线观看| 在线看a的网站| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久 成人 亚洲| 十八禁网站免费在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费在线观看完整版高清| 国产高清videossex| 国产高清激情床上av| 久久久国产一区二区| 一级a爱片免费观看的视频| aaaaa片日本免费| av线在线观看网站| 国产区一区二久久| 丁香欧美五月| 欧美成人免费av一区二区三区 | 免费在线观看亚洲国产| 午夜影院日韩av| 操美女的视频在线观看| 亚洲美女黄片视频| 亚洲综合色网址| 欧美av亚洲av综合av国产av| av网站在线播放免费| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产蜜桃级精品一区二区三区 | 国产精品.久久久| 中文字幕av电影在线播放| 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品电影一区二区三区 | 老司机深夜福利视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| av电影中文网址| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 麻豆乱淫一区二区| 国产精品成人在线| 婷婷成人精品国产| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美 日韩 精品 国产| 午夜精品久久久久久毛片777| 身体一侧抽搐| 三级毛片av免费| 国产精品影院久久| 中文字幕色久视频| 国产高清激情床上av| 国产精品永久免费网站| 99热只有精品国产| 精品少妇久久久久久888优播| 91精品三级在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 捣出白浆h1v1| 9191精品国产免费久久| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品国产高清国产av | 999精品在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲精品中文字幕在线视频| 人人妻人人澡人人看| 成人国产一区最新在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 精品一区二区三卡| 欧美精品av麻豆av| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 怎么达到女性高潮| 90打野战视频偷拍视频| 国产亚洲精品一区二区www | 12—13女人毛片做爰片一| 国产极品粉嫩免费观看在线| 午夜影院日韩av| 欧美一级毛片孕妇| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产一区在线观看成人免费| svipshipincom国产片| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 成人av一区二区三区在线看| 精品国产一区二区久久| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲精品国产一区二区精华液| av视频免费观看在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 免费在线观看完整版高清| 一级毛片女人18水好多| 午夜福利在线免费观看网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美日韩福利视频一区二区| 国产野战对白在线观看| 国产精品免费大片| 高清视频免费观看一区二区| 久久 成人 亚洲| 亚洲性夜色夜夜综合| 一本大道久久a久久精品| 免费人成视频x8x8入口观看| 麻豆乱淫一区二区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲国产精品sss在线观看 | 看片在线看免费视频| 国产精品av久久久久免费| 超碰成人久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | av有码第一页| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 99久久国产精品久久久| 国产成人系列免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲av成人av| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美在线一区亚洲| 在线观看www视频免费| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲第一av免费看| 成人影院久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 一本大道久久a久久精品| 亚洲国产欧美一区二区综合| videos熟女内射| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一区二区日韩欧美中文字幕| 看免费av毛片| 国产亚洲精品久久久久5区| 9热在线视频观看99| 国产精品偷伦视频观看了| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久草成人影院| 国产免费av片在线观看野外av| 免费观看精品视频网站| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 男人的好看免费观看在线视频 | 久久中文字幕一级| 少妇 在线观看| 一区二区三区精品91| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 午夜精品在线福利| videos熟女内射| 色尼玛亚洲综合影院| av欧美777| 黄片播放在线免费| 国产精品av久久久久免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产欧美亚洲国产| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 男人的好看免费观看在线视频 | 91av网站免费观看| 亚洲色图av天堂| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| av天堂在线播放| svipshipincom国产片| 在线天堂中文资源库| 欧美乱码精品一区二区三区| 又大又爽又粗| av中文乱码字幕在线| www.精华液| 久久亚洲精品不卡| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品一二三| 在线国产一区二区在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产99久久九九免费精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 女性被躁到高潮视频| 午夜精品在线福利| 国产精品久久久av美女十八| 精品久久久久久久久久免费视频 | 一级,二级,三级黄色视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 人妻久久中文字幕网| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99国产精品一区二区三区| 欧美成狂野欧美在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 一二三四在线观看免费中文在| bbb黄色大片| 亚洲国产看品久久| 中文字幕av电影在线播放| 男女下面插进去视频免费观看| 丝袜在线中文字幕| 一级片'在线观看视频| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲一区中文字幕在线| 免费观看a级毛片全部| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美激情高清一区二区三区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产精品亚洲av一区麻豆| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产精品久久久久成人av| 男人的好看免费观看在线视频 | 满18在线观看网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品免费大片| 久久久国产精品麻豆| 一二三四在线观看免费中文在| 精品无人区乱码1区二区| 国产免费av片在线观看野外av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产黄色免费在线视频| 午夜影院日韩av| 人人澡人人妻人| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 黄色 视频免费看| 亚洲avbb在线观看| videosex国产| 久久香蕉精品热| 久久久国产成人精品二区 | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日韩精品免费视频一区二区三区| 日日爽夜夜爽网站| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 搡老乐熟女国产| 日韩欧美免费精品| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 国产欧美亚洲国产| 久热爱精品视频在线9| 老司机午夜十八禁免费视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产欧美日韩一区二区三| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 波多野结衣一区麻豆| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲av片天天在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久 成人 亚洲| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美 日韩 精品 国产| 色尼玛亚洲综合影院| 香蕉丝袜av| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| av网站在线播放免费| 国产精品一区二区在线观看99| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 成人免费观看视频高清| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 啪啪无遮挡十八禁网站| 男女午夜视频在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 欧美性长视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 宅男免费午夜| 欧美精品啪啪一区二区三区| 日本wwww免费看| 男女床上黄色一级片免费看| 国产乱人伦免费视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 岛国毛片在线播放| 亚洲欧美激情在线| 一级片'在线观看视频| 免费高清在线观看日韩| 国产成人欧美| 成人18禁在线播放|