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    丁酸鹽對C2C12成肌細(xì)胞的增殖和分化作用

    2022-08-19 06:52:56管理曹子怡陳潔
    老年醫(yī)學(xué)與保健 2022年3期
    關(guān)鍵詞:成肌細(xì)胞肌少癥貨號(hào)

    管理,曹子怡,陳潔

    復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院消化內(nèi)科,上海 200040

    肌少癥是一種與年齡相關(guān)的進(jìn)行性、全身性骨骼肌疾病,涉及肌肉質(zhì)量下降和肌肉功能喪失,可引發(fā)跌倒、骨折、衰弱和死亡等不良后果。回顧性研究提示,亞洲人群的肌少癥患病率為5.5%~25.7%[1-2]。肌少癥的發(fā)生由炎癥、免疫衰老、肌肉蛋白合成代謝、氧化應(yīng)激和肌衛(wèi)星細(xì)胞活性抑制等共同作用[3-7],在機(jī)體活動(dòng)減少和營養(yǎng)不良的情況下,這些機(jī)制會(huì)進(jìn)一步影響肌少癥[8]。因此,抗阻運(yùn)動(dòng)聯(lián)合營養(yǎng)補(bǔ)充是治療和預(yù)防肌少癥的有效方法[9],但由于目前肌少癥的發(fā)病機(jī)制不明,具體的營養(yǎng)素補(bǔ)充劑以及治療靶點(diǎn)仍未有定論。近年來的研究表明,腸道微生物群可能參與肌少癥的發(fā)生,增齡引起的腸道菌群組成及其衍生代謝物改變可以促進(jìn)慢性炎癥和肌肉蛋白合成代謝抵抗,最終導(dǎo)致肌肉質(zhì)量下降和功能受損[10-11]。丁酸鹽是一種短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid,SCFA),目前已知的丁酸鹽作用多通過抑制組蛋白脫乙酰酶產(chǎn)生的表觀遺傳效應(yīng)[12]。雖然SCFA 能夠改善肌肉組織功能,但丁酸鹽本身對肌肉萎縮的影響及具體作用機(jī)制仍有待確定。本研究旨在探索腸道菌群代謝物在肌少癥人群中的改變,明確SCFAs(尤其是丁酸鹽)對肌肉組織的作用,為肌少癥的防治提供嶄新思路。

    1 材料和方法

    1.1 一般資料

    2020年11月—12月,經(jīng)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后入選共和新路街道及甘泉路街道的社區(qū)老年人14 例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥60 歲;(2)性別不限;(3)本地常住人口。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)常年臥床;(2)體成分發(fā)生急性變化(顯著水腫或脫水);(3)發(fā)熱、感染或不明原因傳染病;(4)患有嚴(yán)重心、肺、腎和腦疾??;(5)近3 個(gè)月使用抗生素、非甾體抗炎藥、抗過敏藥或類固醇激素;(6)近3 個(gè)月患有嚴(yán)重影響身體活動(dòng)的疾?。ㄊ中g(shù)或骨折);(7)過去1 周存在吸煙、飲酒等影響腸道菌群的行為。本研究通過復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(20190068),所有受試者自愿參與本研究,并簽署知情同意書。

    14 例受試者年齡62~85 歲,平均(71.5 ±8.1)歲,其中男性5 例、女性9 例,肌少癥6 例、非肌少癥8例。與非肌少癥組比較,肌少癥組四肢骨骼肌質(zhì)量(appendicular skeletal muscle mass,ASM)降低,6 m 步速減慢,丁酸鹽水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2 組的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、骨骼肌質(zhì)量指數(shù)(appendicular skeletal muscle mass index,ASMI)和握力差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后續(xù)研究選擇丁酸鹽作為干預(yù)因素。見表1。

    表1 2 組一般資料比較(±s,n=14)

    表1 2 組一般資料比較(±s,n=14)

    項(xiàng)目 非肌少癥組(n=8) 肌少癥組(n=6) t/χ2 P年齡(歲) 62~80 (69.4 ±6.8) 63~85 (74.3 ±9.5) -1.136 0.278性別[例(%)]— 1.000男性 3 (37.50) 2 (33.33)女性 5 (62.50) 4 (66.67)BMI (kg·m -2) 22.96 ±2.33 20.68 ±2.53 1.746 0.106 ASM (kg) 18.10 ±3.66 14.30 ±1.86 2.531 0.028 ASMI (kg·m -2) 6.63 ±0.84 5.75 ±0.67 2.094 0.058握力(kg) 31.44 ±8.13 23.10 ±6.05 2.104 0.057 6 m 步速(m·s -1) 1.28 ±0.18 1.01 ±0.23 2.495 0.028丁酸鹽(μmol·g -1) 30.79 ±1.48 14.37 ±8.32 2.429 0.032

    1.2 肌少癥診斷

    1.2.1 肌肉質(zhì)量通過人體成分分析儀(Inbody 270)檢測受試者的ASM,ASMI=ASM/身高2。

    1.2.2 肌肉力量受試者站立位,雙臂自然垂于身體兩側(cè),用力握住握力器(瑞獅生物科技有限公司)手柄,測量3 次,記錄測量最大值。

    1.2.3 軀體功能受試者以日常步速沿直線方向行走6 m,可借助拐杖(不鼓勵(lì)使用)。共測試2 次,計(jì)算2 次的平均6 m 步速。

    采用2019年亞洲肌少癥工作組[13]推薦的診斷閾值評估肌少癥:(1)男性ASMI<7.0 kg/m2、女性ASMI<5.7 kg/m2為肌肉質(zhì)量下降;(2)男性握力<28.0 kg、女性握力<18.0 kg 為肌肉力量下降;(3)步速<1 m/s為軀體功能受損。在滿足肌肉質(zhì)量下降的基礎(chǔ)上,握力與步速符合任1 項(xiàng)即可確診為肌少癥,據(jù)此將所有受試者分為肌少癥組和非肌少癥組。

    1.3 標(biāo)本采集

    采集受試者糞便樣本,并于-80 ℃冰箱保存,由麥特繪普生物科技(上海)有限公司提取代謝物,經(jīng)衍生化處理后基于UPLC-MS/MS 平臺(tái),通過Q300TM試劑盒(麥特繪譜,HY5023R)進(jìn)行代謝物檢測。

    1.4 藥物與試劑

    DMEM 高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素(雙抗)、馬血清、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA(美國Gibco 公司,貨號(hào)分別為11995065、15140122、16050122、10091148、25200056);抗-Ki67 抗體、抗-Myf5 抗體(英國Abcam公司,貨號(hào)分別為ab15580、ab125301);Hoechst 抗體(美國Thermo Fisher 公司,貨號(hào)H3570);抗-MyoD 抗體(中國Santa Cruz 公司,貨號(hào)sc-377460);抗-MyHC抗體(美國R&D Systems 公司,貨號(hào)MF20);β-Tubulin抗體、二抗鼠IgG 抗體、二抗兔IgG 抗體(美國CST 公司,貨號(hào)分別為5346S、7076S、7074P2);PBS 緩沖液(中國Bioss 公司,貨號(hào)C01-01001);CCK-8 試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所,貨號(hào)CK04);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國Takara 公司,貨號(hào)RR036A);RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(中國碧云天公司,貨號(hào)分別為P0013B、P0012A)。

    1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分化

    1.5.1 溶液制備丁酸鈉購自上海阿拉丁生化科技有限公司(貨號(hào)S102956),充分溶于ddH2O,制成1 000 mmol/L 的丁酸鹽溶液備用,避光環(huán)境下室溫儲(chǔ)存。

    1.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組C2C12 成肌細(xì)胞購自富恒生物,應(yīng)用DMEM 高糖培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2~3 d 更換1 次生長培養(yǎng)液(DMEM +10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素)。待細(xì)胞貼壁后,丁鹽酸組每4 mL 培養(yǎng)液加入3 μL 丁酸鹽儲(chǔ)備液,對照組加入等體積、濃度的ddH2O。

    1.5.3 細(xì)胞分化2 組細(xì)胞經(jīng)丁酸鹽和ddH2O處理48 h 后,當(dāng)細(xì)胞密度≥80%時(shí)吸棄生長培養(yǎng)液,加入分化培養(yǎng)液(DMEM +2%馬血清+1%青霉素-鏈霉素)進(jìn)行分化誘導(dǎo),隔天換液,持續(xù)96 h。

    1.6 CCK-8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    將每孔2 ×103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板中,每孔加入10 μL CCK-8 進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。恒溫箱孵育1~2 h后,于24 h、48 h 使用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度。

    1.7 免疫熒光染色

    丁酸鹽處理48 h 后,檢測C2C12 成肌細(xì)胞的增殖效應(yīng)。PBS 緩沖液潤洗細(xì)胞2 遍,每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入4%多聚甲醛固定60 min。1 mL PBS 慢洗3 遍,每遍5 min。封閉液(PBS +10% 山羊血清+0.3%Triton)覆蓋皿底,室溫孵育1 h。使用抗-Ki67 抗體標(biāo)記增殖的細(xì)胞核,Hoechst 抗體標(biāo)記全體細(xì)胞核???Ki67 一抗(1∶100)4 ℃冰箱孵育過夜,熒光鼠/兔IgG二抗(1∶500)室溫孵育2 h。PBS 充分洗滌細(xì)胞培養(yǎng)皿后,以PBS 稀釋Hoechst 抗體(1∶500),室溫避光孵育20 min。通過激光共聚焦顯微鏡(德國Leica,TCS SP8)對每個(gè)樣品隨機(jī)取5 個(gè)視野顯像。

    Ki-67 是一種標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的核抗原,Ki-67增殖指數(shù)常被用于評價(jià)細(xì)胞增殖水平。Ki-67 增殖指數(shù)=陽性細(xì)胞核數(shù)/全體細(xì)胞核數(shù)。

    1.8 蛋白免疫印跡檢測

    將處理后的細(xì)胞充分裂解,并加入上樣緩沖液。蛋白樣本移入金屬水浴鍋中100 ℃加熱15 min 變性,室溫下冷卻5 min 后離心,取上清加入SDS-PAGE 凝膠樣品槽。轉(zhuǎn)膜后將0.4 μm 聚偏二氟乙烯膜(美國Merck 公司)放入BSA 封閉液中置低速搖床上封閉1 h。使用MyoD、Myf5、MyHC 一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,鼠/兔IgG 二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h。充分洗膜后通過ECL 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行顯影。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示,2 組間比較采用Fisher 確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 丁酸鹽促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞增殖

    采用CCK-8 檢測丁酸鹽對C2C12 成肌細(xì)胞增殖能力的影響。與對照組比較,丁酸鹽處理48 h 后C2C12成肌細(xì)胞增殖率上調(diào)。對2 組細(xì)胞的Ki-67 增殖指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,與對照組比較,丁酸鹽組Ki-67 +細(xì)胞核增多(16.82%vs35.96%,P=0.009)。見圖1。

    圖1 丁酸鹽促進(jìn)C2C12 成肌細(xì)胞增殖(n=3)

    2.2 丁酸鹽改善C2C12 成肌細(xì)胞分化

    與對照組比較,分化48 h 后丁酸鹽組C2C12 成肌細(xì)胞MyoD、Myf5 的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);分化96 h 后丁酸鹽組C2C12 成肌細(xì)胞MyHC 的蛋白表達(dá)水平升高(P<0.01)。見圖2。

    圖2 丁酸鹽改善C2C12 分化水平(n=3)

    3 討論

    近年來測序分析技術(shù)不斷進(jìn)步,幫助研究者挖掘微生物學(xué)標(biāo)志物,實(shí)現(xiàn)由微生物群落的比較到臨床診斷與微生物學(xué)應(yīng)用的跨越[13-14]。人體內(nèi)微生物群落與健康和疾病等因素密切相關(guān)[15-16]。

    目前,已知促進(jìn)骨骼肌生長的特定腸道菌群種類包括干酪乳桿菌、長雙歧桿菌、直腸真桿菌、球狀梭菌和巴氏桿菌。這些菌種通過產(chǎn)生SCFA 來改善肌肉的功能[17-18],而菌群紊亂導(dǎo)致SCFA 減少可引起胰島素抵抗,減少線粒體脂肪酸氧化,繼而引起肌肉內(nèi)脂肪酸沉積增多。這種現(xiàn)象會(huì)使肌肉力量與質(zhì)量下降,并進(jìn)一步促進(jìn)胰島素抵抗,從而形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致肌少癥的發(fā)生[19-20]。此外,SCFA 可以增加血清中胰島素樣生長因子1 的含量,促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞增殖,改善肌肉再生[21]。補(bǔ)充劑(如基于果聚糖的益生元或抗性馬鈴薯淀粉等)可以增加個(gè)別產(chǎn)丁酸菌的相對豐度,提高丁酸的產(chǎn)量[22]。攝取益生元(如菊粉型果聚糖和阿拉伯低聚木糖)有利于促進(jìn)雙歧桿菌與產(chǎn)丁酸菌之間的相互作用,從而增加產(chǎn)量。因此,聯(lián)合營養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)的綜合治療方案,可以促進(jìn)衰弱老人腸道微生物群結(jié)構(gòu)的年輕化。

    本次研究表明,丁酸鹽通過改善成肌細(xì)胞增殖促進(jìn)肌肉再生。一方面丁酸鹽對于C2C12 成肌細(xì)胞有促增殖效應(yīng);另一方面丁酸鹽上調(diào)Myf5、MyoD 的表達(dá)水平,進(jìn)而改善成肌細(xì)胞分化水平。促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)是增殖、分化等細(xì)胞活動(dòng)的基礎(chǔ),對該通路的調(diào)控有利于改善肌細(xì)胞的細(xì)胞活力和蛋白質(zhì)降解。此外,丁酸鹽對能量攝取的調(diào)節(jié)作用以及胞內(nèi)脂滴沉積的緩解,有利于改善肌細(xì)胞的分化水平[23]。通過對組蛋白去乙?;傅囊种?,丁酸鹽還有助于調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的分化[24]。成肌細(xì)胞的促增殖環(huán)境為預(yù)防、治療隨年齡引起的骨骼肌退化提供了新的視角。

    本研究通過對社區(qū)老年人群糞便樣本的代謝物檢測,結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了特定濃度的丁酸鹽對C2C12 成肌細(xì)胞生成的促進(jìn)作用。后續(xù)研究中,更大的樣本量將有利于明確產(chǎn)丁酸菌是否為肌少癥患者與健康人群間的差異菌種,同時(shí)血清學(xué)數(shù)據(jù)有助于確定丁酸鹽與肌少癥之間的相關(guān)性[25]。

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