血清外泌體LncRNA-CCAT1表達(dá)對(duì)乙型肝炎病毒相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷價(jià)值分析

李蘭花

我國(guó)是乙型肝炎(乙肝)患者和肝炎病毒攜帶人數(shù)最高的國(guó)家，且臨床調(diào)查顯示乙肝病毒(HBV)攜帶者占我國(guó)總?cè)丝?0%左右[1-2]。原發(fā)性肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其發(fā)生與HBV慢性感染間存在明顯的流行病學(xué)關(guān)系，嚴(yán)重威脅患者生命安全[3-4]。因此，采取及時(shí)有效的診斷和治療HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌方法尤為重要。近年來(lái)，外泌體的臨床和機(jī)制研究受到重視。外泌體主要是由多種類型細(xì)胞分泌的一種小囊泡，外泌體中含豐富的mRNA和蛋白質(zhì)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是長(zhǎng)度超過(guò)200nt的一類非編碼RNA，主要參與基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及表現(xiàn)遺傳調(diào)控等過(guò)程。研究報(bào)道顯示，LncRNA-結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(CCAT1)在多種腫瘤中異常高表達(dá)，并且與腫瘤分期及患者預(yù)后相關(guān)[5-6]。但目前，臨床上尚無(wú)有關(guān)LncRNA-CCAT1與原發(fā)性肝細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道。本研究探討血清外泌體LncRNA-CCAT1表達(dá)對(duì)HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷價(jià)值，旨在為臨床診斷、治療及預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院于2017年1月至2019年1月收治的HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者79例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》[7]中關(guān)于HBV診斷標(biāo)準(zhǔn)，且臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性肝細(xì)胞癌；②預(yù)計(jì)患者生存期超過(guò)3個(gè)月者；③患者臨床資料完整，且患者隨訪資料完整；④獲得患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①甲、丙、丁和戊型肝炎；②其他非乙肝原因引起的肝臟損傷；③合并其他惡性腫瘤者；④嚴(yán)重精神疾病者；⑤心、肺、腎功能嚴(yán)重異常者。納入的79例患者中，其中，男49例，女30例；年齡43～78歲，平均年齡(62.13±7.68)歲；病程3～21年，平均病程(11.36±3.25)年；平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.12±1.26)kg/m2。選擇我院于2017年1月至2019年1月收治的單純HBV患者83例作為對(duì)照組，其中，男54例，女29例；年齡45～79歲，平均年齡(62.64±6.54)歲；病程3～20年，平均病程(10.92±3.46)年；平均BMI(22.89±1.30)kg/m2。另選擇我院于2017年1月至2019年1月健康體檢者80例作為正常組，其中，男47例，女33例；年齡41～79歲，平均年齡(62.48±3.65)歲；平均BMI(22.71±1.23)kg/m2。三組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 肝功能檢測(cè) 受試者均于清晨空腹采集外周靜脈血3 mL，以2 500 r/min離心半徑10 cm，離心12 min，取上清液(血清標(biāo)本)，置于-70 ℃保存待測(cè)，采用放射免疫法測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平，應(yīng)用Dxc 800TB全自動(dòng)生化儀及配套試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。

1.2.2 血清外泌體LncRNA-CCAT1表達(dá) 受試者均于清晨空腹采集外周靜脈血3 mL，以2 500 r/min離心半徑10 cm，離心12 min，取上清液(血清標(biāo)本)，置于-70 ℃保存待測(cè)。①總RNA提?。喝〕鰳悠方鈨龊蠹尤隩rizol試劑(北京百奧萊博科技有限公司)，充分混合均勻后加入氯仿，振蕩，以2 500 r/min離心半徑10 cm，離心5 min后取上層無(wú)色液體，加入異丙醇充分混合均勻后離心，將上清液棄去，加入焦碳酸二乙酯溶解。②逆轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)備cDNA：參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)操作說(shuō)明書進(jìn)行。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR：參照熒光定量PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)使用說(shuō)明書，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃ 30 s變性、58 ℃ 30 s退火、72 ℃ 30 s延伸，共完成35個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線分析PCR產(chǎn)物，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，取3個(gè)孔平均值，以GAPDH作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt表示相對(duì)表達(dá)量。LncRNA-CCAT1：上游引物：5′-GCCGTGTTAAGCATTGCGAA-3′，下游引物：5′-AGAGTAGTGCCTGGCCTAGA-3′。

1.3 預(yù)后評(píng)價(jià)

HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者均隨訪至2021年1月31日，以死亡或隨訪末為終點(diǎn)，觀察患者平均生存期，采用電話、微信、門診等方式隨訪。

1.4 觀察指標(biāo)

①觀察三組肝功能指標(biāo)變化；②觀察三組血清外泌體LncRNA-CCAT1表達(dá)；③采用ROC曲線分析血清外泌體LncRNA-CCAT1對(duì)HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的診斷；④觀察HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌預(yù)后情況；⑤分析血清外泌體LncRNA-CCAT1與生存相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組肝功能變化比較

觀察組血清AST和ALT水平高于對(duì)照組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且對(duì)照組血清AST和ALT水平高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組肝功能變化比較

2.2 三組LncRNA-CCAT1表達(dá)比較

觀察組LncRNA-CCAT1表達(dá)高于對(duì)照組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而對(duì)照組和正常組LncRNA-CCAT1表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組LncRNA-CCAT1表達(dá)水平比較

2.3 血清外泌體LncRNA-CCAT1對(duì)HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌預(yù)測(cè)價(jià)值

采用ROC曲線分析血清外泌體LncRNA-CCAT1對(duì)HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，ROC曲線下面積為0.902，最佳截?cái)嘀禐?.814，見(jiàn)圖1。

圖1 ROC曲線分析LncRNA-CCAT1對(duì)HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌的預(yù)測(cè)價(jià)值

2.4 HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌預(yù)后情況

所有患者均隨訪至2021年1月31日，隨訪12～48個(gè)月。平均總生存期為34.52個(gè)月(見(jiàn)圖2)。

圖2 HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌生存分析

2.5 血清外泌體LncRNA-CCAT1與生存時(shí)間的

血清外泌體LncRNA-CCAT1與生存呈線性負(fù)相關(guān)(r=-0.714,P=0.005)。

3 討論

HBV是原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要致病病因，高載量的HBV不僅與原發(fā)性肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密，且是影響原發(fā)性肝細(xì)胞治療效果及預(yù)后的關(guān)鍵因素[8-12]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，原發(fā)性肝細(xì)胞癌發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，位居惡性腫瘤死亡原因的第3位，嚴(yán)重影響人們的生存質(zhì)量[13]。由于原發(fā)性肝細(xì)胞癌具有早期診斷困難、惡性程度高、預(yù)后差及生存時(shí)間等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命安全[14-16]。因此，提高原發(fā)性肝細(xì)胞癌的早期診斷率是改善預(yù)后及延長(zhǎng)患者生存期的有效措施之一。AST和ALT是目前用于診斷HBV及評(píng)價(jià)肝功能的輔助指標(biāo)，可反映肝臟內(nèi)的炎癥程度[17]。本文研究表明，觀察組和對(duì)照組血清AST和ALT水平高于正常組，由此可見(jiàn)HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者肝功能明顯下降，認(rèn)為其原因可能是由于HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌當(dāng)機(jī)體感染易感病毒后除乙肝病毒對(duì)肝臟的損傷作用外，肝細(xì)胞癌對(duì)機(jī)體特異性免疫同樣會(huì)對(duì)肝功能和肝細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷。

外泌體可包含微小RNAs、信使RNA和蛋白質(zhì)，是穩(wěn)定有效的一種細(xì)胞信號(hào)傳遞和交換方式，并且在外泌體的保護(hù)下這些內(nèi)容物不易被降解[17]。LncRNA-CCAT1位于染色體8q24.21 cMyc基因增強(qiáng)子區(qū)域。而其中cMyc可通過(guò)與LncRNA-CCAT1啟動(dòng)子區(qū)域的特定區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞獲得無(wú)限增殖能力，且可抑制細(xì)胞凋亡[18-19]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究證實(shí)，LncRNA-CCAT1與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[20-21]。甘兆義等[22]學(xué)者研究報(bào)道顯示，下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中LncRNA-CCAT1表達(dá)能夠抑制細(xì)胞遷移、增殖，且可誘導(dǎo)凋亡。任瀟凡等[23]學(xué)者研究報(bào)道顯示，術(shù)前收集胰腺癌患者66例與健康體檢者66例作為研究對(duì)象，胰腺癌患者血清外泌體LncRNA-CCAT1表達(dá)明顯升高，外泌體LncRNA-CCAT1監(jiān)測(cè)胰腺癌敏感度為89.4%、特異性為87.9%、準(zhǔn)確性為89.4%，且血清外泌體LncRNA-CCAT1過(guò)表達(dá)與不良預(yù)后呈正相關(guān)，及為影響不良預(yù)后獨(dú)立因素。本文研究表明，觀察組LncRNA-CCAT1表達(dá)高于對(duì)照組和正常組，且與生存呈線性負(fù)相關(guān)，由此可見(jiàn)HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者血清外泌體LncRNA-CCAT1表達(dá)明顯升高，且與預(yù)后密切相關(guān)，故而其可作為原發(fā)性肝細(xì)胞癌診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)的有效標(biāo)志物，但其與原發(fā)性肝細(xì)胞癌具體發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。

綜上所述，血清外泌體LncRNA-CCAT1表達(dá)對(duì)HBV相關(guān)原發(fā)性肝細(xì)胞癌具有良好診斷價(jià)值，可作為早期篩查原發(fā)性肝細(xì)胞癌的一種新型標(biāo)志物，且與預(yù)后密切相關(guān)，具有重要研究?jī)r(jià)值。