新生兒先天性巨結(jié)腸癥臨床病理特征及CR聯(lián)合AchE診斷價值分析

王巧鴿，張紅麗，趙平

新生兒巨結(jié)腸癥是小兒較為常見的先天性腸道畸形，其發(fā)病機制是因為直腸或結(jié)腸遠端的腸管持續(xù)痙攣，使糞便淤積阻滯在近端結(jié)腸，造成腸道肥厚、擴張，也被稱作腸管無神經(jīng)節(jié)細胞癥[1]。先天性新生兒巨結(jié)腸癥的臨床表現(xiàn)為在出生后的1～6 d內(nèi)發(fā)生急性腸梗阻，且胎便排出延遲，常伴腹脹、嘔吐等，對新生兒的生長發(fā)育以及生命健康帶來極大的威脅。因此如何有效對先天性新生兒巨結(jié)腸癥作出準(zhǔn)確診斷可以為治療提供便利條件。目前臨床常用鋇劑灌腸X線片、直腸測壓以及病理檢查來進行診斷，但當(dāng)活檢部位位于結(jié)腸遠端可能會對檢查結(jié)果造成偏差[2-3]。乙酰膽堿酯酶(AchE)是常用的免疫組織化學(xué)染色法，其可顯示結(jié)腸增生的膽堿能纖維，在結(jié)直腸相關(guān)疾病的診斷上具有較好的效果；鈣視網(wǎng)膜蛋白(CR)是一種重要的鈣結(jié)合蛋白，在含有神經(jīng)節(jié)細胞的腸段均有表達，是一種同時標(biāo)記神經(jīng)節(jié)細胞及神經(jīng)纖維的標(biāo)志物[4-5]。基于此本次研究選擇西北婦女兒童醫(yī)院2020年3月至2020年9月出生的67例新生兒先天性巨結(jié)腸癥患兒為研究對象，以Kappa值預(yù)測模型研究CR、AchE在新生兒先天性巨結(jié)腸癥病理診斷中的價值，以期為新生兒先天性巨結(jié)腸癥的診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選擇西北婦女兒童醫(yī)院2020年3月至2020年9月出生的72例疑診或待除外的新生兒先天性巨結(jié)腸癥患兒直腸黏膜活檢標(biāo)本，其中男40例，女32例；年齡7～21 d，平均(14.23±2.36)d；體質(zhì)量(3345.57±346.48)g；胎齡(39.24±3.16)周。臨床表現(xiàn)為：出生后均有反復(fù)出現(xiàn)腹脹，胎便排出延遲或嘔吐，經(jīng)鋇劑灌腸檢測提示結(jié)腸動力活動性差。所有患兒均行CR染色及AchE染色，以直腸黏膜活檢和手術(shù)標(biāo)本根治標(biāo)本的病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過我院倫理委員會研究批準(zhǔn)后實施本次試驗，倫理編號2021-022。

1.2 方法

(1)CR染色：將石蠟塊5 μm切片，采用En-Vision法進行免疫組織化學(xué)染色，將石蠟切片脫蠟水化，以3 min/次使用PBS沖洗3次，加入3%的過氧化氫溶液，在室溫下孵育8 min，加入CR并以40 ℃孵育45 min，再加入聚合物增強劑孵育30 min，另外添加酶標(biāo)抗兔聚合物孵育30 min，加入現(xiàn)配DAB溶液，顯微鏡下觀察后使用自來水沖洗，以蘇木精復(fù)染使用0.1%鹽酸分化，用自來水沖洗返藍，最后脫水、透明進行封片。

(3) AchE染色：將活檢標(biāo)本8 μm冰凍后切片，使用碘化乙酰膽堿50 mg、1 mL蒸餾水、0.1 mol/L醋酸鹽酸沖液6.5 mL、0.1 mol/L枸櫞酸鈉液、30 mol/L硫酸銅液1 mL和5 mol/L鐵氰化鉀1 mL現(xiàn)配孵育液進行20 min孵育，再使用雙氧水孵育10 min，以蘇木精復(fù)染使用0.1%鹽酸分化，用自來水沖洗返藍，最后脫水、透明進行封片。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

(1)CR染色：當(dāng)CR染色黏膜下神經(jīng)叢中神經(jīng)纖維棕黃色著色即判定為真陽性，黏膜下神經(jīng)叢中神經(jīng)纖維出現(xiàn)較少不均勻棕黃色著色即判定為假陽性，黏膜下神經(jīng)叢中神經(jīng)纖維出現(xiàn)棕色或黃色即判定為假陰性，黏膜下神經(jīng)叢中神經(jīng)纖維無著色即判定為真陰性[6]。

(2)AchE染色：當(dāng)AchE染色發(fā)現(xiàn)黏膜固有層、黏膜肌層出現(xiàn)棕黃色粗大神經(jīng)纖維即判定為真陽性，出現(xiàn)棕黃色粗大神經(jīng)纖維但不位于黏膜固有層、黏膜肌層即判定為假陽性，黏膜固有層、黏膜肌層無棕黃色但存在粗大神經(jīng)纖維即判定為假陰性，黏膜固有層、黏膜肌層無棕黃色粗大神經(jīng)纖維即判定為真陰性[7]；聯(lián)合檢查中以上任一項檢查出現(xiàn)即判定為陰陽情況。

(3)計算方法：特異性=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%，準(zhǔn)確率=(真陽性+真陰性)/總例數(shù)×100%；陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%，陰性預(yù)測值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征分析

65例患兒中根據(jù)直腸黏膜活檢和手術(shù)標(biāo)本根治標(biāo)本的病理診斷確診為先天性巨結(jié)腸患兒57例。CR染色結(jié)果顯示，陰性表達55例(84.62%)，陽性表達10例(15.38%)，CR陽性反應(yīng)于正常腸壁黏膜下叢和肌間神經(jīng)叢，可染色正常神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)纖維，呈棕色表達于細胞核和細胞質(zhì)；CR陰性表達于先天性巨結(jié)腸痙攣段腸壁黏膜下層和肌層，CR陰性表達見圖1。AchE染色結(jié)果顯示陽性53例(81.54%)，陰性12例(18.46%)，AchE染色陽性者可在黏膜固有層看到少量陽性的粗顆粒狀結(jié)構(gòu)，見圖2。

圖1 先天性巨結(jié)腸癥直腸活檢CR染色陽性 圖2 先天性巨結(jié)腸癥直腸活檢AchE染色陽性

2.2 CR、AchE單獨及聯(lián)合診斷價值新生兒先天性巨結(jié)腸癥與病理結(jié)果比較

CR染色診斷符合率為90.77%(59/65)，AchE染色診斷符合率為84.62%(55/65)，聯(lián)合診斷符合率為92.31%(60/65)。具體見表1、2、3。

表1 CR診斷價值新生兒先天性巨結(jié)腸癥與病理結(jié)果比較

表2 AchE診斷價值新生兒先天性巨結(jié)腸癥與病理結(jié)果比較

表3 CR聯(lián)合AchE診斷價值新生兒先天性巨結(jié)腸癥與病理結(jié)果比較

2.3 CR、AchE單獨及聯(lián)合檢測診斷新生兒先天性巨結(jié)腸癥的價值分析

由表1可見，CR、AchE單獨及聯(lián)合檢測診斷新生兒先天性巨結(jié)腸癥的靈敏度分別為92.98%、87.72%、94.49%，特異度分別為75.00%、62.50%、87.50%，Kappa一致性分別為0.628、0.574、0.759，其中CR、AchE聯(lián)合檢測診斷與手術(shù)病理診斷結(jié)果一致性較好。

表4 CR、AchE單獨及聯(lián)合檢測診斷新生兒先天性巨結(jié)腸癥的價值分析 (%)

3 討論

先天性巨結(jié)腸是由于腸神經(jīng)節(jié)細胞缺如，是一種常見的先天性腸道畸形，在胚胎6～12周發(fā)育過程中，若有病毒感染、代謝紊亂以及胎兒血運障礙等因素，會使神經(jīng)節(jié)細胞變性或神經(jīng)發(fā)育停頓，造成無神經(jīng)節(jié)細胞的腸段出現(xiàn)痙攣、狹窄現(xiàn)象，最終形成巨腸癥[8-9]。直腸黏膜活檢在臨床上常用來診斷先天性巨結(jié)腸癥，但仍然存在漏診誤診的發(fā)生[10]。新生兒先天性巨結(jié)腸癥患兒大多數(shù)有胎便排除延遲、腹脹腹瀉以及嘔吐癥狀，早期癥狀不明顯，隨著狹窄段腸道發(fā)生繼發(fā)性擴張，腹脹隨之發(fā)生，而新生兒先天性巨結(jié)腸癥病情反復(fù)發(fā)作，癥狀持續(xù)加重，會造成新生兒營養(yǎng)障礙及生長發(fā)育滯后，故應(yīng)重視新生兒先天性巨結(jié)腸癥的診斷[11-12]。鑒別診斷主要是與非神經(jīng)節(jié)細胞缺如的便秘疾病鑒別，其中臨床癥狀與新生兒先天性巨結(jié)腸癥相似，主要表現(xiàn)為便秘、腹脹甚至結(jié)腸擴張形成的巨結(jié)腸，包括先天性節(jié)細胞減少癥、腸神經(jīng)元發(fā)育不良。新生兒先天性巨結(jié)腸癥主要特征是存在誤神經(jīng)節(jié)細胞腸段，而其他疾病均沒有這個特點。依靠染色進行病理診斷需要豐富的臨床病理提升和超高的病理制片技術(shù)，不僅要保證取材足夠大小和深度符合要求，還要對不成熟的神經(jīng)節(jié)細胞和合并結(jié)腸炎的淋巴單核細胞用常規(guī)染色法進行鑒別，較容易出現(xiàn)誤診。需要結(jié)合免疫組化和酶組織化學(xué)染色法進行判斷。

有研究指出，免疫組織化學(xué)檢測CR、AchE在先天性巨結(jié)腸癥的診斷上有一定的診斷價值[13]。CR是一種重要的鈣結(jié)合蛋白，在正常結(jié)腸黏膜下和肌間神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)從中表達，但在痙攣段腸管不能見到CR陽性顯色的神經(jīng)細胞。相關(guān)資料顯示，CR可導(dǎo)致胚胎期神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子緩沖能力下降，進而引起胚胎內(nèi)細胞損傷，與先天性巨結(jié)腸發(fā)病有關(guān)。AchE存在于膽堿能神經(jīng)纖維，AchE陽性神經(jīng)在正常人腸壁黏膜的固有膜內(nèi)無法顯示，AchE染色可使腸壁黏膜的固有膜內(nèi)AchE陽性神經(jīng)顯示，故AchE染色在先天性巨結(jié)腸診斷方面具有一定臨床價值。因此本次研究以Kappa值預(yù)測模型研究CR、AchE在新生兒先天性巨結(jié)腸癥病理診斷中的價值，觀察其染色變化，在新生兒先天性巨結(jié)腸癥的診斷上有著積極意義。結(jié)果顯示，CR陽性反應(yīng)于正常腸壁黏膜下叢和肌間神經(jīng)叢，可染色正常神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)纖維，呈棕色表達于細胞核和細胞質(zhì)；CR陰性表達于先天性巨結(jié)腸痙攣段腸壁黏膜下層和肌層；AchE染色陽性者可在黏膜固有層看到少量陽性的粗顆粒狀結(jié)構(gòu)。

另外本次研究發(fā)現(xiàn)單CR、AchE染色及CR聯(lián)合AchE染色診斷新生兒先天性巨結(jié)腸癥的價值進行分析，發(fā)現(xiàn)CR、AchE染色單獨及聯(lián)合診斷先天性巨結(jié)腸Kappa一致性分別為0.628、0.574、0.759，其中CR、AchE聯(lián)合檢測診斷與手術(shù)病理診斷結(jié)果一致性較好，提示聯(lián)合診斷能提升診斷價值。AchE染色是臨床上研究較多的一種診斷先天性巨結(jié)腸癥的手段，在新生兒先天性巨結(jié)腸癥患兒病變腸段中AchE活性會異常升高，繼而顯色反應(yīng)會呈現(xiàn)出神經(jīng)纖維大量贈生，即可診斷為新生兒先天性巨結(jié)腸癥，而由于神經(jīng)節(jié)細胞的缺失，副交感神經(jīng)節(jié)前纖維無法與神經(jīng)節(jié)細胞形成觸突，繼而副交感神經(jīng)會進入腸壁，乙酰膽堿的特異度會因此增高，成為AchE染色診斷先天性巨結(jié)腸癥的優(yōu)勢[14]。但有研究指出AchE染色的敏感性不佳，會產(chǎn)生大量假陰性結(jié)果，由于AchE具有較高的滲透性，可以同時存在膽堿能神經(jīng)元和非膽堿能神經(jīng)元，故會造成較高的假陽性。CR作為重要的鈣結(jié)合蛋白之一，可在Ca2+濃度升高時減輕細胞損傷，可以發(fā)揮保護神經(jīng)的功效。CR染色可在正常腸段中對神經(jīng)元以及神經(jīng)纖維中染色，在痙攣病變腸段無法對神經(jīng)節(jié)細胞著色，且在神經(jīng)纖維的染色情況與正常腸段比較也大有不同，故可作為診斷先天性巨結(jié)腸癥的手段[15-16]。但對于黏膜固有層表達其連續(xù)性較差，更多表現(xiàn)在黏膜下神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)纖維中，在黏膜下呈現(xiàn)弱陽性，從而加大診斷的難度，而且在標(biāo)本取材上有著嚴(yán)格要求，切片過淺無法獲得較好的著色呈現(xiàn)。CR主要集中表達在中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，在正常結(jié)腸黏膜下和肌間神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)叢也有表達，在無神經(jīng)節(jié)細胞的狹窄短結(jié)腸不表達[17]。CR染色可減輕AchE染色潛在的毒性，減少診斷假陰性結(jié)構(gòu)，而AchE染色可在取材檢查方面提供便利條件，故筆者建議應(yīng)行CR聯(lián)合AchE染色診斷新生兒先天性巨結(jié)腸癥，同時新生兒先天性巨結(jié)腸癥病情復(fù)雜，在鑒別時應(yīng)密切關(guān)注新生兒先天性巨結(jié)腸癥的病理性質(zhì)，以提高診斷的準(zhǔn)確性[18]。

在本次研究中也存在以下不足：①新生兒期的神經(jīng)節(jié)細胞尚未發(fā)育成熟，其結(jié)構(gòu)缺乏典型性；②活檢部位為較遠較短的腸斷；③研究時間短、區(qū)域覆蓋范圍小以及納入病例小等。以上均會對研究所得結(jié)論造成影響，因此后期還需花費更多時間和精力去完善所得結(jié)論。④沒有納入影像學(xué)檢查及肛門直腸測壓檢測結(jié)果，使得本診斷結(jié)果缺少必要的數(shù)據(jù)支持，影響了其應(yīng)用機制。

綜上所述，CR聯(lián)合AchE染色診斷新生兒先天性巨結(jié)腸癥有著較為準(zhǔn)確的診斷率，可有效減少誤診率，臨床應(yīng)當(dāng)重視。