1株人源抑制致病菌的糞腸球菌性能評價

唐樂 鄧淑芬 秦嫚嫚 江友 裘梁,*

(1 江西中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心，南昌 330006；2 江西中醫(yī)藥大學(xué) 江西省中藥防治血管重塑相關(guān)疾病重點實驗室，南昌 330006；3 深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院，深圳 518108)

腸道微生態(tài)與腸道菌群有著直接聯(lián)系，腸道菌群的種類及數(shù)量直接影響著腸道微生態(tài)的改變。腸道菌群可以分為益生菌、致病菌和條件致病菌。常見的益生菌有雙歧桿菌和乳酸桿菌等，是一類可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡來對宿主產(chǎn)生有益作用的活的微生物。如，它具有緩解便秘[1]、治療非酒精性脂肪性肝病[2]、改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及精神疾病[3]和預(yù)防腫瘤[4]等作用。條件致病菌則是指與宿主間的生態(tài)平衡在某些情況下被打破，形成生態(tài)失調(diào)而導(dǎo)致疾病發(fā)生的正常菌群，如人體共生菌之一的腸球菌即是一種條件致病菌。由于菌株差異，腸球菌具有益生和潛在致病雙重性。一方面腸球菌在機體內(nèi)發(fā)揮著重要的益生功能，能夠調(diào)整腸道菌群微生態(tài)平衡，促進腸道環(huán)境健康[5]。另一方面，腸球菌也具有潛在的致病性。臨床實驗證實，腸球菌不僅可引起皮膚創(chuàng)傷和尿路感染，而且可能引發(fā)新生兒早產(chǎn)[6]、新生兒極低體重[7]、新生兒腦膜炎[8]和新生兒敗血癥[9]等。糞腸球菌是腸球菌的一種，它是一種革蘭陽性細菌，一般沒有莢膜。它存在于人體的口腔、呼吸道、腸道、泌尿道和生殖道。它可以作為益生菌使用，抑制其他病原菌的生長，調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境，在調(diào)節(jié)人體免疫方面發(fā)揮重要作用[10-11]。本研究從健康成人糞便分離出一株能產(chǎn)生抑菌圈的糞腸球菌，評價了其耐酸耐膽鹽能力、抗生素敏感性和拮抗致病菌等生物學(xué)特性，從而為該菌株做微生態(tài)制劑防治致病菌方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品及細胞

糞便樣品取自健康成人。人結(jié)直腸腺癌細胞(Caco-2)來自本實驗室保存。

1.1.2 指示菌

糞腸球菌(Enterococcus faecalis)V583、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)ZDY01、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)ZDY04、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)ZDY08、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosusGG)均來自本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑

MRS固體培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯(BHI)、牛膽鹽購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS和胎牛血清購自北京?？寺∩锘瘜W(xué)制品有限公司；甘油購自西隴化工股份有限公司；抗生素藥敏試紙片購自杭州微生物試劑有限公司；腸球菌編碼鑒定盒購自杭州濱和微生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離、篩選

將4.5 g糞便樣品溶解至30 mL MRS肉湯培養(yǎng)基，梯度稀釋到1×10-6涂布至MRS固體培養(yǎng)基表面，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑選產(chǎn)生抑菌圈的單個菌落接種至1 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)后的菌液再次涂布至MRS固體培養(yǎng)基表面，得到純的菌株。同時，將菌株用20%甘油凍存于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株的鑒定

(1)生化鑒定 根據(jù)腸球菌成套編碼鑒定盒說明書對菌株進行生理生化鑒定，參照編碼手冊進行鑒別。

(2)16S rDNA鑒定 將菌株用MRS固體培養(yǎng)基活化之后，接種于MRS液體培養(yǎng)中，37℃過夜培養(yǎng)，12000 r/min離心5 min，收集菌體。采用細菌基因組DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，細菌16S rDNA的通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')進行PCR擴增16S rDNA序列，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變熱5 min；94℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測：利用2% 瓊脂糖對PCR產(chǎn)物進行檢測，每孔加入反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，電壓120 V，電泳時間 20 min，電泳結(jié)束后，利用凝膠成像儀進行觀察。并將PCR產(chǎn)物送至生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

(3)系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將測序序列與Genebank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)菌16S rDNA序比對，并用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定菌株的種屬。

1.2.3 毒力基因鑒定

將QT01菌株用MRS固體培養(yǎng)基活化之后，接種于MRS液體培養(yǎng)中，37℃過夜培養(yǎng)，12000 r/min離心5 min，收集菌體。采用細菌基因組DNA提取試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，分別以efαM、efαS、hyi、gei、ccf、cob、cyiA、cyiB、cyiM、cpd、esp和agg引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變熱5 min；94℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測：利用2% 瓊脂糖對PCR產(chǎn)物進行檢測，每孔加入反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，電壓120 V，電泳時間 20 min，電泳結(jié)束后，利用凝膠成像儀進行觀察。

1.2.4 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法[12]，測定分離菌QT01對 14種常見抗生素的藥敏試驗。將QT01菌接種到 BHI 液體培養(yǎng)基中，37℃ 過夜厭氧培養(yǎng)。取500 μL QT01菌液離心(8000 r/min，3 min)，菌體經(jīng)PBS洗滌2次，重懸于PBS中，將細菌濃度稀釋至1×106CFU/mL，取100 μL涂布于BHI固體平板上，晾干，用鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，放置于37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量抑菌圈的大小。抑菌圈大小按2016年美國臨床和實驗室標準協(xié)會(clinical and laboratory standards institute,CLSI)制訂的標準進行供試菌及藥物敏感性鑒定和判斷。

1.2.5 耐膽鹽試驗

將QT01菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱過夜厭氧培養(yǎng)，分別配制不含牛膽鹽及含0.3%、0.5%和1%牛膽鹽的BHI液體培養(yǎng)基。將培養(yǎng)后的QT01菌液以1:100的比例加入到不含牛膽鹽及含有不同濃度牛膽鹽的BHI液體培養(yǎng)基中，每個濃度做3個復(fù)孔，放至37℃厭氧培養(yǎng)箱，分別在0、4、8、12和24 h檢測培養(yǎng)液A600值，并進行平板計數(shù)。

1.2.6 耐酸試驗

將QT01菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱過夜厭氧培養(yǎng)。用0.1 mol/L HCL將BHI液體培養(yǎng)基pH值分別調(diào)成2.0、3.0、4.0、5.0和6.0，分別取不同pH值的培養(yǎng)基10 mL分裝到15 mL的離心管中，每個pH值做3個復(fù)孔，在每個管中加入100 μL QT01菌液，放至 37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10和12 h時進行平板計數(shù)。

1.2.7 模擬胃腸道試驗

人工胃液制備[13]：含7 mmol/L NaCl、 7 mmol/L KCl、 45 mmol/L NaHCO3、0.30%胃蛋白酶，以0.1 mol/L HCl 調(diào) pH至2.5，過濾除菌備用。人工腸液制備[13]：含0.1 g/L胰蛋白酶、3 g/L牛膽鹽、0.835 g/L KCl、6.5 g/L NaCl、0.22 g/L CaCl2、1.386 g/L NaHCO3，以0.1 mol/L HCl調(diào) pH至7.5，過濾除菌備用。將QT01菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱過夜厭氧培養(yǎng)，取500 μL QT01菌液離心(12000 r/min，10 min)，棄上清，菌體重懸于10%脫脂乳中。取100 μL菌懸液與10 mL的人工胃液或人工腸液混合后，37℃厭氧培養(yǎng)，分別在0和2 h取樣檢測培養(yǎng)液A600值，并進行平板計數(shù)。

1.2.8 抑菌試驗

QT01菌株充分活化后，以1%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)。取屎腸球菌Ab、 屎腸球菌As、糞腸球菌V583、 產(chǎn)氣腸桿菌ZDY01、植物乳桿菌ZDY04、干酪乳桿菌、 嗜熱鏈球菌、 鼠李糖乳桿菌作為指示菌，分別將菌體量為1×106CFU的指示菌涂布于MRS固體平板上，靜置晾干。用移液槍吸取2 μL過夜培養(yǎng)的QT01菌液(菌體量約為1×105CFU) 滴至MRS固體平板 (每個平板5滴) 。置于37 ℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)20～24 h，用游標卡尺測量抑菌圈的大小。

1.2.9 黏附能力及抑菌能力測定

Caco-2細胞經(jīng)活化后，按1×105個細胞/孔的細胞量鋪至24孔板，以DMEM培養(yǎng)基(不含雙抗)培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至單層達98%。QT01過夜培養(yǎng)后，無菌PBS清洗兩次，重懸于DMEM培養(yǎng)基(不含雙抗)，將125 μL QT01菌懸液(濃度約1×108CFU/mL)與Caco-2細胞共孵育2 h后，PBS洗去未黏附的細菌，經(jīng)含0.25% EDTA的胰酶消化后，收集細胞懸浮液，涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)12 h，計算平板上菌落數(shù)。采用同樣方法制備致病菌V583菌懸液，抑制V583實驗通過3種方式進行：①競爭試驗：QT01菌與致病菌V583同時與Caco-2細胞共孵育2 h。②排斥試驗：QT01菌與Caco-2細胞共孵育1 h后，PBS洗去未黏附的細菌，再加入致病菌V583共孵育1 h。③置換試驗：致病菌V583與 Caco-2 細胞共孵育1 h后，PBS洗去未黏附的細菌，再加入QT01菌共孵育1 h。最后，PBS洗去未黏附的細菌，經(jīng)0.25% EDTA的胰酶消化后，收集溶液，涂布于BHI固體培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)12 h，計算平板上菌落數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism version 8.4.3軟件和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，所得數(shù)據(jù)均表示為均值±標準差(±s)，采用單因素和兩因素方差分析法 (ANOVA)比較組間顯著性差異，用Tukey' spost hoc 進行檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離與鑒定

PYR、VP、蔗糖、精氨酸、MAG、蕈糖、蔗糖和山梨醇試驗為陽性；DPP、PMG和TMZ為陰性。參考編碼手冊，該分離菌株與糞腸球菌一致，故初步判定為糞腸球菌，詳見表1。

將來源于健康成人的糞便經(jīng)梯度稀釋后，涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃過夜厭氧培養(yǎng)后，MRS固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)一具有顯著透明圈菌株，將其命名為QT01，該菌落形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、白色菌落，菌落直徑1.0～2.0 mm。另隨機挑取QT01周圍的2個菌落，分別命名為Ab和As。對3株菌進行16S rDNA基因序列的測定及與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫比對分析，結(jié)果表明QT01為糞腸球菌，Ab和As分別為屎腸球菌。生理生化鑒定結(jié)果見表1。通過與糞腸球菌模式菌株生理生化特征進行對比，可初步確定QT01為糞腸球菌。進一步將QT01、Ab和As與腸球菌屬其他菌株進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果如圖1所示，QT01與腸球菌屬其他糞腸球菌進化水平相當，與里氏腸球菌S299株和腸道共生性腸球菌LMG7937株等關(guān)系接近。Ab和As均為屎腸球菌。

表1 分離菌生化特性試驗結(jié)果Tab.1 Results of the biochemical characteristics test of the isolate

2.2 糞腸球菌毒力基因鑒定

采用表2中引物，PCR擴增QT01毒力基因，結(jié)果如圖2所示。QT01含毒力基因agg，cylA，esp，efaS，cpd和cob，且大小與理論值相符，但不含毒力基因gelE，cylM，cylB，ccf和hyl。

表2 糞腸球菌毒力基因及引物Tab.2 Enterococcus faecalis virulence genes and primers

2.3 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗獲得的藥敏環(huán)直徑大小判斷QT01對抗生素的敏感性，結(jié)果顯示：QT01對阿莫西林、青霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星和萬古霉素敏感；對利福平、慶大霉素和鏈霉素中度敏感；對四環(huán)素、卡那霉素、桿肽菌、多黏菌素B、紅霉素和頭孢西丁耐藥。說明QT01對大部分常見抗生素敏感。具體結(jié)果見表3。

表3 QT01藥敏試驗結(jié)果Tab.3 Results of drug sensitivity test of QT01

2.4 抑菌試驗結(jié)果

為進一步確定QT01是否能抑制其他致病菌生長，將QT01與其他菌相互作用。從表4可以看出，QT01對條件致病菌V583、As、Ab和ZDY01等菌株都有不同程度的抑制作用，其中對V583的抑菌圈直徑為(1.59±0.51) mm，抑菌效果最好；對As、Ab和ZDY01的抑菌圈直徑分別為(1.01±0.22) mm，(0.824±0.206) mm，(0.634±0.266) mm，抑菌效果次之；此外，QT01對益生菌ZDY04的抑菌圈直徑為(0.345±0.025) mm，抑菌效果較弱，而對益生菌Streptococcus thermophilus和Lactobacillus rhamnosusGG的抑菌效果并不明顯。以上結(jié)果表明QT01能抑制條件致病菌，而不能抑制益生菌的生長(圖3)。

表4 QT01抑菌試驗結(jié)果Tab.4 Results of Bacteriostatic Test of QT01

2.5 細胞黏附試驗結(jié)果

以糞腸球菌V583為指示菌，采用競爭、排斥和替換3種方式進行實驗考察QT01拮抗V583黏附腸上皮細胞作用。結(jié)果如表5所示：與對照組相比，在競爭實驗中， QT01 顯著抑制了糞腸球菌V583對Caco-2細胞的黏附；但在排斥和替換試驗中， QT01對V583 黏附Caco-2細胞的能力并無明顯影響。

表5 QT01對 V583的黏附拮抗作用Tab.5 Adhesion antagonism of QT01 to V583

2.6 耐酸試驗結(jié)果

將QT01分別接種于不同p H值( 2.0、3.0、4.0 、5.0和6.0)的BHI液體培養(yǎng)基中厭氧生長12 h，隨后進行平板菌落計數(shù)。結(jié)果如圖4所示：在pH 6.0時，QT01仍保持一定的生長速度，而在pH≤5.0時，QT01幾乎不能生長。

2.7 模擬胃腸道試驗結(jié)果

我們采用模擬胃腸液確定QT01菌株耐受胃腸道能力。如圖5所示，QT01在模擬胃液中維持初始活菌計數(shù)水平。而在模擬腸液中，2 h后的QT01的活菌計數(shù)增加了1.902×108CFU/mL，提高了1.2倍。因此，QT01雖不能在胃液中增殖，但能耐受胃液2 h，同時亦能耐受腸液。

2.8 耐膽鹽試驗結(jié)果

將QT01接種于含不同膽鹽濃度(0.3%、0.5%和1%)的BHI液體培養(yǎng)基中，考察其膽鹽耐受能力。結(jié)果如圖6所示：與不加膽鹽的對照組相比，QT01在0.3%、0.5%和1%膽鹽濃度下處理4 h后生長速度較慢，但在8 h后各實驗組與對照組間已無明顯差異。說明在膽鹽環(huán)境中并不會影響QT01菌株的生長，其具有耐膽鹽特性。

3 討論和結(jié)論

本實驗以成人糞便分離出的糞腸球菌QT01為研究對象，通過耐酸、耐膽鹽、藥敏試驗、模擬胃腸道實驗和抑菌試驗等表明該菌株耐酸但不能在酸性條件增殖，耐膽鹽并能增殖；對常見抗生素如阿莫西林、青霉素、氯霉素和環(huán)丙沙星等敏感；能抑制糞腸球菌致病株V583和產(chǎn)氣腸桿菌，但不能抑制植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌。不同菌株具有不同的抑菌物質(zhì)，其抑菌機理也并不相同。Claes等[15]稱，LGG對沙門菌的強烈抑制作用來自乳酸的積累。Vimont等[16]研究發(fā)現(xiàn)屎腸球菌LCW44對單核細胞李斯特菌的抑制是由于細菌素的產(chǎn)生。同時，有研究表明菌體的自聚集與致病菌的共聚集效應(yīng)對抑菌活性也起到了一定的作用。然而本文所涉及的糞腸球菌QT01究竟是通過何種機理產(chǎn)生抑菌作用還有待進一步研究。

能夠抵抗較強的酸性環(huán)境是外源菌體能在腸道中存活和發(fā)揮作用的先決條件。胃液pH會隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化而出現(xiàn)波動，pH通常為3左右[17]，空腹食用酸性食品可達1.5，食用堿性食品可達4～5，且食物尤其是流食通過胃的時間相對較短，一般1～2 h[18]。本實驗中Enterococcus faecalisQT01經(jīng) pH2、3、4、5和6的培養(yǎng)基處理12 h后，菌株僅在pH6條件下維持一定的生長能力，pH2、3、4和5均無法正常生長。模擬胃腸道實驗也證明，QT01在人工胃液處理2 h后，活菌數(shù)量雖沒有發(fā)生明顯變化，但仍能存活。因此，研究者判斷該糞腸球菌菌株QT01能夠耐受胃內(nèi)低酸環(huán)境，但不能在酸性環(huán)境下增殖。將在下一步研究中擬對pH＜5條件培養(yǎng)的細菌移除酸性條件進行培養(yǎng)，以判斷其是否能耐受酸性環(huán)境。

外源菌體被食入人體后，不僅要抵抗胃液，還要抵抗具有抑菌作用的膽鹽。高濃度膽鹽形成的滲透壓使腸液內(nèi)的微生物質(zhì)壁分離從而抑制其生長。人體小腸中膽汁鹽的含量在0.03%～0.3%范圍波動，只有具有較強耐膽汁鹽能力的菌株才能順利通過小腸而到達大腸[19]。本試驗中糞腸球菌經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為0.3%、0.5%和1%的膽鹽處理4 h后平均活菌數(shù)密度分別為 4.24×109、3.92×109和3.29×109CFU/mL，8 h時活菌數(shù)達到峰值，分別為9.44×109、9.99×109和9.57×109CFU/mL，說明糞腸球菌不僅能夠耐受高膽鹽，還能在高膽鹽環(huán)境下增殖。

耐萬古霉素腸球菌是引起院內(nèi)感染的主要因素之一[20-21]，而采用抗生素治療會導(dǎo)致腸內(nèi)耐萬古霉素腸球菌增殖，使患者更容易發(fā)生血液感染[22]。其中，腸球菌約占感染性心內(nèi)膜炎病原菌的5%～15%，也有少數(shù)病例報道早產(chǎn)兒敗血癥和腦膜炎中也檢測到糞腸球菌和屎腸球菌。Enterococcus faecalisQT01除對紅霉素和頭孢西丁有耐藥性外，對其他抗生素均敏感。此外，QT01能夠有效抑制如糞腸球菌致病菌V583等腸球菌的生長，文獻報道糞腸球菌產(chǎn)生的細菌素能抑制革蘭陽性細菌如梭狀芽胞桿菌、李斯特菌、葡萄球菌和乳酸桿菌等[16,23]，但對于QT01是否通過分泌的抑菌物質(zhì)抑制V583增殖以及是否在體內(nèi)能有效緩解萬古霉素抗性腸球菌引起的感染有待進一步研究。

綜上所述，Enterococcus faecalisQT01具有很好的耐酸、耐膽鹽和抑菌生物學(xué)特性，或可將其作為微生態(tài)制劑使用[25]。