抗菌藥物聯(lián)合中藥單體對泛耐藥鮑曼不動桿菌生物被膜的影響

孟千琳 彭勤 凌保東,*

(1 成都醫(yī)學(xué)院結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610500；2 成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610500；3 南充市中心醫(yī)院，南充 637000)

近年來，全球泛耐藥鮑曼不動桿菌(extensively drug resistant,XDRAB)檢出率急劇增加，已被世界衛(wèi)生組織(WHO)列入ESKAPE家族的最高級別耐藥病原體之一[1-2]，其中XDRAB生物被膜的形成作為重要的毒力因素[3-4]，通過阻止抗菌藥物的滲入、抵抗宿主免疫系統(tǒng)、保護(hù)休眠菌，甚至導(dǎo)致全耐藥細(xì)菌出現(xiàn)，使頑固性感染難以治愈[5-6]。因此，迫切需要從新的角度對細(xì)菌耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，尋找新的防治策略與方法。筆者前期研究表明抗菌藥物與中藥單體組合用藥對XDRAB具有逆轉(zhuǎn)耐藥性作用[7]，本研究擬深入探討這種逆轉(zhuǎn)XDRAB耐藥性作用是否與生物被膜的抑制作用相關(guān)，以期為臨床防治XDRAB感染提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

4種抗菌藥物：多黏菌素B(批號：J0716A，含量: ＞6500 IU/mg)、亞胺培南(M0502A，含量＞95%)、美羅培南(M0108A，含量＞98%)、替加環(huán)素(F1208A，含量＞98%)；3種中藥單體：黃芩苷(大連美侖生物公司，批號：M0515A，含量: ≥95% )、鹽酸小檗堿(大連美侖生物公司，批號：J1202A，含量:≥97%) 、槲皮素二水物( 上海源葉生物科技有限公司，批號: C13A9Y58602，含量: ≥95% ) ;

1.2 菌株

2018—2019年成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院不同科室的臨床標(biāo)本分離的XDRAB 9株，其中臨床分布重癥醫(yī)學(xué)科5株，呼吸科2株，老年醫(yī)學(xué)科1株，急診科1株，質(zhì)控菌大腸埃希菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室留存。

1.3 試劑

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(批號：20200815青島海博生物技術(shù)有限公司)、MH肉湯培養(yǎng)基(批號：MB0148大連美侖生物公司)、磷酸緩沖液(批號：20201228上海生工生物工程有限公司)

1.4 儀器

恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific公司)、酶標(biāo)儀(伯騰儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 抗菌藥物、中藥單體對XDRAB生長的影響

使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每株菌設(shè)置6個復(fù)孔，每孔加入20 μLA600=0.12的菌液和170 μL TSB培養(yǎng)基，模型對照組加入10 μL PBS，實(shí)驗(yàn)組加入10 μL對應(yīng)濃度的藥液，37℃，孵育24 h，每隔4 h測一次A600值，利用比濁法檢測24 h內(nèi)4種抗菌藥物及3種中藥單體在1、1/2、1/4、1/8和1/16×MIC的濃度下對9株XDRAB生長的影響，最終選擇不抑制細(xì)菌生長的藥物濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工作濃度。

1.5.2 抗菌藥物、中藥單體單用及組合用藥對XDRAB生物被膜的影響

菌液的制備：接種細(xì)菌于L B 固體培養(yǎng)板，37℃細(xì)菌培養(yǎng)箱孵育16～20 h，挑取3～5顆單克隆于200 μL 0.9%生理鹽水中進(jìn)行混勻，取100 μL于酶標(biāo)儀測定A600值，最終通過加入0.9%生理鹽水調(diào)整至A600=0.12，細(xì)菌含量達(dá)到1×108CFU/mL。XDRAB生物被膜形成能力的檢測：使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，陰性對照組選取無生物被膜形成能力的大腸埃希菌DH5α菌株，設(shè)置6個復(fù)孔，每孔依次加入180 μL的TSB培養(yǎng)基和20 μLA600=0.12的菌液，37℃，孵育24 h。去除培養(yǎng)基后用200 μL PBS清洗3遍，空氣干燥20 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，去除結(jié)晶紫，重復(fù)3遍，最后加入95%乙醇，酶標(biāo)儀下測定570 nm的吸光度A。生物被膜形成能力判定標(biāo)準(zhǔn)為:①BF陰性：A模型對照≤A陰性對照，②BF陽性：A模型對照＞A陰性對照，結(jié)晶紫棋盤染色法(crystal violet staining,CVS)：參照文獻(xiàn)[8-9]的實(shí)驗(yàn)方法，并稍作調(diào)整，使用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每株菌設(shè)置6個復(fù)孔，藥物濃度選擇不抑制細(xì)菌生長的濃度，以此濃度為基礎(chǔ)進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)置高、中、低3個濃度梯度。將4種特殊使用級抗菌藥物分為A1、A2、A3、A4；3種中藥單體分為B1、B2、B3。以A1和B1組合為例進(jìn)行藥物分組：①藥物單用組：A1濃度分別為(A1高濃度)、(A1中濃度)、(A1低濃度)；B1濃度分別為(B1高濃度)、(B1中濃度)、(B1低濃度)；②藥物聯(lián)用組：A1和B1的3個濃度分別兩兩組合，得到A1與B1聯(lián)合應(yīng)用的9個濃度組合，綜上通過棋盤組合法比較藥物單用和聯(lián)用時各個濃度下對XDRAB生物被膜的抑制作用。空白對照組加入180 μL TSB培養(yǎng)基，藥物單用組加入170 μL TSB培養(yǎng)基、對應(yīng)濃度的藥液10 μL，藥物聯(lián)用組加入160 μL TSB培養(yǎng)基、兩個組合濃度的藥液各10 μL，最后加入A600為0.12的細(xì)菌重懸液20 μL，總體系為200 μL，37 ℃，孵育24 h，吸出培養(yǎng)基后用200 μL PBS清洗3遍，空氣中干燥20 min，每孔加入200 μL 0.1%結(jié)晶紫染色20 min，吸出結(jié)晶紫，重復(fù)PBS清洗3遍，空氣干燥20 min，加入95%乙醇溶解，酶標(biāo)儀測定570 nm下吸光度A，生物被膜抑制率(%)=[1-(藥物組吸光度A/模型對照組吸光度A)]×100。

1.5.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS26.0t檢驗(yàn)和Graphpad Prism 8.0.1分別進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖，計(jì)量資料以(±s)表示，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物、中藥單體對XDRAB生長的影響

結(jié)果顯示(圖1)，與模型對照組相比，亞胺培南(4 μg/mL)、美羅培南(2 μg/mL)、多黏菌素B(0.25 μg/mL)、替加環(huán)素(0.0625 μg/mL)、黃芩苷(128 μg/mL)、鹽酸小檗堿(32 μg/mL)、槲皮素二水物(64 μg/mL)，在24 h內(nèi)不抑制細(xì)菌的生長，將該濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的工作濃度。

2.2 抗菌藥物、中藥單體單用及組合用藥對XDRAB生物被膜的影響

與陰性對照組相比，9株XDRAB均會形成生物被膜，藥物濃度選擇見“2.1”，以此濃度為基礎(chǔ)進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)置高、中和低3個濃度梯度，藥物濃度分組見表1。與模型對照組相比，4種抗菌藥物、3種中藥單體在各自高濃度下單用均能夠明顯抑制XDRAB生物被膜的形成(P＜0.05)，抑制作用槲皮素二水物＞替加環(huán)素＞美羅培南＞鹽酸小檗堿＞多黏菌素B＞黃芩苷＞亞胺培南，4種抗菌藥物分別和3種中藥單體在高濃度下聯(lián)合用藥對XDRAB生物被膜抑制效果均明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥(P＜0.05)，結(jié)果見表2，其中替加環(huán)素與黃芩苷的9個濃度組合均能夠顯著抑制XDRAB生物被膜的形成(P＜0.05)，抑制效果均比替加環(huán)素、黃芩苷分別對應(yīng)濃度單用時的作用強(qiáng)(P＜0.05),在替加環(huán)素(0.015625 μg/mL) +黃芩苷(32 μg/mL)的濃度組合下，藥物劑量最小，結(jié)果見表3和圖3。

表1 4種抗菌藥物和3種中藥單體對9株XDRAB生物被膜抑制的工作濃度分組(μg/mL)Tab.1 The working concentration group of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of traditional Chinese medicine monomers on 9 XDRAB biofilm inhibition (μg/mL)

表2 4種抗菌藥物、3種中藥單體單用、聯(lián)用對9株XDRAB生物被膜形成的影響(±s,n=9)Tab.2 The activity of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of Chinese medicine monomers on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

表2 4種抗菌藥物、3種中藥單體單用、聯(lián)用對9株XDRAB生物被膜形成的影響(±s,n=9)Tab.2 The activity of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of Chinese medicine monomers on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

"-"：該濃度藥物對生物被膜的抑制率與空白組一致

藥物(μg/mL)生物被膜形成能力(A570)顯著性差異(與空白組比較)BF抑制藥物(μg/mL)生物被膜形成能力(A570)顯著性差異(與空白組比較)BF抑制率/%(與空白組比較)XDRAB(n=9)PXDRAB(n=9)P率/%(與空白組比較)空白1.125±0.373小檗堿(16)0.864 ±0.107＜0.0523.2陰性對照0.410±0.030小檗堿(8)1.120 ±0.064＞0.05-亞胺培南(4)0.720±0.154＜0.0136.0槲皮素(64)0.512 ±0.049＜0.0154.5亞胺培南(2)0.874±0.183＜0.0522.4槲皮素(32)0.734±0.075＜0.0134.8亞胺培南(1)0.980±0.190＞0.0512.9槲皮素(16)0.861 ±0.081＜0.0523.5美羅培南(2)0.616±0.191＜0.0145.3亞胺培南(4) /黃芩苷(128)0.437 ±0.063＜0.0161.2美羅培南(1)0.846±0.175＜0.0524.8亞胺培南(4)/小檗堿(32)0.512 ±0.138＜0.0154.5美羅培南(0.5)0.902±0.173＜0.0520.0亞胺培南(4)/槲皮素(64)0.410 ±0.042＜0.0163.6多黏菌素B(0.25)0.682±0.129＜0.0139.4美羅培南(2) /黃芩苷(128)0.402 ±0.081＜0.0164.3多黏菌素B(0.125)0.919±0.098＜0.0518.4美羅培南(2)/小檗堿(32)0.384 ±0.094＜0.0166.0多黏菌素B(0.0625)1.034±0.101＞0.058.1美羅培南(2)/槲皮素(64) 0.376 ±0.041＜0.0166.6替加環(huán)素(0.0625)0.598 ±0.068＜0.0146.9多黏菌素B(0.25) /黃芩苷(128) 0.582 ±0.099＜0.0148.3替加環(huán)素(0.03125)0.780 ±0.084＜0.0130.7多黏菌素B(0.25)/小檗堿(32) 0.507 ±0.099＜0.0155.0替加環(huán)素(0.015625) 0.918 ±0.086＜0.0518.4多黏菌素B(0.25)/槲皮素(64) 0.450 ±0.108＜0.0160.0黃芩苷(128)0.704 ±0.082＜0.0137.5替加環(huán)素(0.0625) /黃芩苷(128) 0.412 ±0.101＜0.0163.4黃芩苷(64)0.887 ±0.053＜0.0521.2替加環(huán)素(0.0625)/小檗堿(32) 0.456 ±0.071＜0.0159.5黃芩苷(32)0.894 ±0.072＜0.0520.6替加環(huán)素(0.0625)/槲皮素(64) 0.398 ±0.079＜0.0164.7小檗堿(32)0.660 ±0.117＜0.0141.4

表3 替加環(huán)素與黃芩苷聯(lián)用對9株XDRAB生物被膜形成的影響(±s,n=9)Tab.3 The activity of tigecycline and baicalin on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

表3 替加環(huán)素與黃芩苷聯(lián)用對9株XDRAB生物被膜形成的影響(±s,n=9)Tab.3 The activity of tigecycline and baicalin on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

生物被膜形成能力(A570)顯著性差異(與空白組比較)藥物(μg/mL)BF抑制率/%(與空白組比較)XDRAB(n=9)P空白1.125±0.373陰性對照0.410±0.030替加環(huán)素(0.0625)/黃芩苷(128)0.412 ±0.101＜0.0163.4%替加環(huán)素(0.03125)/黃芩苷(128)0.474 ±0.067＜0.0157.9%替加環(huán)素(0.015625)/黃芩苷(128)0.512 ±0.055＜0.0154.5%替加環(huán)素(0.0625)/黃芩苷(64)0.519 ±0.120＜0.0153.9%替加環(huán)素(0.03125)/黃芩苷(64)0.592 ±0.110＜0.0147.4%替加環(huán)素(0.015625)/黃芩苷(64)0.668 ±0.105＜0.0140.7%替加環(huán)素(0.0625)/黃芩苷(32)0.579 ±0.124＜0.0148.6%替加環(huán)素(0.03125)/黃芩苷(32)0.639 ±0.133＜0.0143.2%替加環(huán)素(0.015625)/黃芩苷(32)0.779 ±0.120＜0.0530.8%

3 討論

細(xì)菌生物被膜的形成過程主要分為4步[10-11]：菌毛、鞭毛等黏附細(xì)胞器進(jìn)行初始黏附、細(xì)菌聚集進(jìn)行不可逆附著、形成成熟的生物被膜、生物被膜內(nèi)部深層細(xì)菌與生物被膜分散后進(jìn)行再定植，生物被膜形成后對抗菌藥物的耐藥性增強(qiáng)10～1000倍[12]。而XDRAB生物被膜一旦形成，臨床現(xiàn)有的抗菌藥物均難以控制，生物被膜菌所引起的院內(nèi)感染是目前全球醫(yī)學(xué)界所面臨的重要難題，尋找新的抗菌藥物組合勢在必行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4種抗菌藥物與3種中藥單體在各自高濃度單用、聯(lián)用均可以顯著抑制XDRAB生物被膜的形成，單藥抑制作用槲皮素二水物＞替加環(huán)素＞美羅培南＞鹽酸小檗堿＞多黏菌素B＞黃芩苷＞亞胺培南，4種抗菌藥物亞胺培南、美羅培南、多黏菌素B、替加環(huán)素與3種中藥單體黃芩苷、鹽酸小檗堿、槲皮素二水物在單用及聯(lián)用時對 XDRAB 的生物被膜形成均具有不同程度的抑制作用，組合用藥表現(xiàn)為不同程度的協(xié)同抗生物被膜效應(yīng)。

目前，替加環(huán)素與多黏菌素被認(rèn)為是治療XDRAB感染的最后一道防線，但是，XDRAB的生物被膜一旦形成，耐藥性甚至轉(zhuǎn)變?yōu)槿退?，我們旨在通過研究臨床特殊使用級抗菌藥物與中藥單體組合治療針對XDRAB生物被膜的感染。本研究表明，亞胺培南(4 μg/mL)、美羅培南(2 μg/mL)、多黏菌素B(0.25 μg/mL)、替加環(huán)素(0.0625 μg/mL)、黃芩苷(128 μg/mL)、鹽酸小檗堿(32 μg/mL)、槲皮素二水物(64 μg/mL)的濃度下顯著抑制XDRAB生物被膜的形成，且該工作濃度均不抑制XDRAB生長，謝杰鵬等研究表明[13]，美羅培南通過抑制c-di-GMP進(jìn)一步抑制銅綠假單胞菌生物被膜的形成。此外，Tahereh等[14]研究證明，替加環(huán)素在亞抑菌濃度濃度下通過調(diào)控群體感應(yīng)系統(tǒng)abaI/abaR基因的表達(dá)從而抑制生物被膜的形成。鹽酸小檗堿作為天然異喹啉生物堿[15]，廣泛用于治療細(xì)菌性腹瀉及胃腸炎，本研究表明鹽酸小檗堿在32和16 μg/mL濃度下均可以明顯抑制XDRAB生物被膜的形成，并且臨床抗菌藥物亞胺培南、美羅培南、多黏菌素B、替加環(huán)素與鹽酸小檗堿聯(lián)合應(yīng)用均具有不同程度的協(xié)同抗生物被膜效應(yīng)，其中2 μg/mL美羅培南與32 μg/mL鹽酸小檗堿聯(lián)用可以有效抑制66%的XDRAB生物被膜的形成。Tong等[16]研究表明鹽酸小檗堿在亞抑菌濃度下通過下調(diào)大腸埃希菌鞭毛合成基因motA和fliA、外膜蛋白調(diào)節(jié)基因ompA從而抑制生物被膜的形成。

槲皮素二水物、黃芩苷作為典型黃酮類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等廣泛的藥理作用[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素二水物在64、32和16 μg/mL；黃芩苷在128、64和32 μg/mL濃度下均可以明顯抑制XDRAB生物被膜的形成，4種抗菌藥物分別與其聯(lián)用均表現(xiàn)不同程度的協(xié)同抗生物被膜作用，其中2 μg/mL的美羅培南聯(lián)用64 μg/mL槲皮素對XDRAB生物被膜的形成抑制率高達(dá)66.6%，而替加環(huán)素與黃芩苷的9個濃度組合均能夠顯著抑制XDRAB生物被膜的形成，聯(lián)用效果均優(yōu)于替加環(huán)素、黃芩苷單獨(dú)用藥，在0.015625 μg/mL替加環(huán)素與32 μg/mL黃芩苷的濃度組合下，藥物劑量最小。有研究表明，黃芩苷通過劑量依賴性抑制腐生鏈球菌中msrA基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制生物被膜的形成[18]。Du Z等[19]研究表明黃芩苷在亞抑菌濃度下有效阻止了金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。Peng等[20]研究結(jié)果顯示黃芩苷通過干擾禽致病性大腸埃希菌(apeC)群體感應(yīng)系統(tǒng)、降低lsrB和lsrK等毒力基因表達(dá)從而抑制生物被膜的形成。Memariani[21]的綜述中指出槲皮素通過降低大腸埃希菌rpoS的表達(dá)從而影響大腸埃希菌生物被膜的成熟。Aygül等[22]研究認(rèn)為槲皮素對奇異變形桿菌可能通過抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因、編碼調(diào)節(jié)蛋白flhDC從而抑制生物被膜的形成。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明替加環(huán)素與黃芩苷聯(lián)合對抗XDRAB的協(xié)同抗菌效應(yīng)為100%，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明替加環(huán)素與黃芩苷聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同抑制XDRAB生物被膜形成，抗菌藥物聯(lián)合中藥單體通過協(xié)同抗菌+協(xié)同抗生物被膜的雙重作用，實(shí)現(xiàn)雙靶標(biāo)對抗XDRAB的耐藥性問題，降低了替加環(huán)素和黃芩苷單一藥物的使用劑量，可有效預(yù)防XDRAB對替加環(huán)素產(chǎn)生耐藥性，為防控泛耐藥及全耐藥鮑曼不動桿菌感染提供了新的治療方案，為新型抗菌藥物聯(lián)合中藥單體復(fù)方制劑的研制提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有一定參考價(jià)值。