高寒草甸鏈霉菌Qhu-M197活性次級代謝產(chǎn)物的研究

樊嘉凱 向信 鄧佳文 邱慶輝 馬艷 張得鈞 張本印

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016)

天然產(chǎn)物對于新藥研發(fā)至關(guān)重要，過去40年來，小分子藥物50%以上直接或間接來源于天然產(chǎn)物[1]。微生物天然產(chǎn)物是天然產(chǎn)物重要的組成部分，其在抗感染和抗腫瘤方面的活性尤為突出[2-3]。放線菌次級代謝產(chǎn)物占微生物天然產(chǎn)物的比例很高，目前臨床近70%的抗生素都由放線菌產(chǎn)生[4]，但從傳統(tǒng)生境來源放線菌中發(fā)現(xiàn)新化合物的幾率不斷下降，而已知化合物重復(fù)發(fā)現(xiàn)率極高[5]。棲息于特殊生態(tài)環(huán)境(簡稱特境)的微生物為適應(yīng)逆境因子，演化出了獨特的適應(yīng)能力和功能基因，包括活性天然產(chǎn)物的生物合成基因。目前，在極地[6]、深海[7]、鹽湖[8]、火山口[9]和熱泉[10]等極端生境中都分離到了新穎的微生物物種和次級代謝產(chǎn)物。近些年，隨著抗生素濫用及多重耐藥菌的出現(xiàn)，尋找新型抗生素已迫在眉睫，因此越來越多的研究者將目光投向了對特境微生物，尤其是放線菌，希望通過發(fā)掘特境放線菌次級代謝產(chǎn)物研發(fā)出克服耐藥菌的新型抗生素。

青藏高原號稱“世界屋脊”，具有低溫、干旱、營養(yǎng)貧瘠、強紫外、低氧和低壓等多種逆境因子[11]，相比于傳統(tǒng)生境，生長在此的微生物為適應(yīng)特境，應(yīng)具有特殊的生理功能、生存能力及代謝途徑。目前，青藏高原放線菌研究多數(shù)局限于抗菌等方面的活性篩選，如張玲等[12]從青藏高原土壤中分離到了151株鏈霉菌，其中68株具有抗菌活性。馬愛愛等[13]從青藏高原凍土中分離到54株放線菌，對其進行了形態(tài)學(xué)和分子分類鑒定，并開展了抗菌活性研究，但放線菌的次級代謝產(chǎn)物研究較少。

本實驗室前期篩選到一株青藏高原高寒草甸土壤來源放線菌Qhu-M197，由于該菌株具有較強抗菌、抗腫瘤活性，因此，本研究對該菌株開展了初步鑒定，同時，在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，開展了活性次級代謝產(chǎn)物的分離、鑒定，另外還評價了主要活性成分的抗菌和抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

菌株Qhu-M197分離自青海省黃南藏族自治州澤庫縣海拔3959 m的高山草甸(E101°29'17.27''，N35°13'47.25'')土壤樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基

MS固體培養(yǎng)基：D-甘露醇20 g，大豆粉20 g，瓊脂20 g，1 L自來水，pH 7.2。

YMG液體培養(yǎng)基：酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖4 g，1 L蒸餾水，pH 7.2。

ISP4液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉10 g，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂2 g，氯化鈉1 g，硫酸銨2 g，碳酸鈣2 g，微量鹽1 mL。微量鹽：七水硫酸亞鐵0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，七水硫酸鋅0.1 g，1 L蒸餾水，pH 7.2。

TSB液體培養(yǎng)基：胰酪胨大豆肉湯30 g，1 L蒸餾水，pH 7.2。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，1 L蒸餾水，pH 7.2。

1.1.3 主要試劑及儀器

化學(xué)純甲醇、乙酸乙酯(天津富宇化工)、色譜純甲醇(上海麥克林生化科技有限公司)、MCI GEL大孔吸附樹脂(日本三菱化學(xué)公司)、Sephadex LH-20(北京索萊寶科技有限公司)、MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司)、半制備高效液相色譜儀LC-20AT(日本島津公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、恒溫搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)、生物安全柜(太倉藝斯高醫(yī)療器械科技有限公司)、三氣培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)、核酸提取儀FastPrep-24TM(美國MP Biomedicals公司)。

1.1.4 指示菌及腫瘤細胞株

指示菌：大腸埃希菌(Escherichia coliATCC25922)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilisATCC 51650)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC51650)、白念珠菌(Candida albicansATCC 10231)；腫瘤細胞株：人HepG2肝癌細胞和人MCF-7乳腺癌細胞；保存于青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院生物制藥基礎(chǔ)實驗室。

1.2 方法

1.2.1 菌株Qhu-M197的分子鑒定

將菌株Qhu-M197在TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，獲得的培養(yǎng)液在8000 r/min離心3 min，收集菌體，無菌水清洗2次，使用核酸提取儀破碎細胞提取基因組DNA，作為PCR模板。使用細菌通用性擴增引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')進行16S rRNA基因擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：ddH2O 9.5 μL，DNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，PremixTaq12.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性6 min；95℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送蘭州天啟基因生物科技有限公司進行測序。對測序結(jié)果進行拼接校對后，將拼接后的序列導(dǎo)入EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行比對，下載相似性較高的代表性菌株序列，使用MEGA7.0軟件，以Maximum Composite Likelihood模型計算遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor-joining，N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。Bootstrap自展1000次檢驗進化樹拓撲結(jié)構(gòu)置信區(qū)間。

1.2.2 菌株Qhu-M197小量發(fā)酵及抗菌活性篩選

菌株Qhu-M197接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min搖床培養(yǎng)3 d，制備種子液；然后將種子液以5%體積轉(zhuǎn)接于50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(YMG和ISP4)中，28℃，200 r/min旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)7 d。同時吸取200 μL種子液涂布于MS固體培養(yǎng)基，28℃恒溫箱培養(yǎng)10 d。發(fā)酵完成后，使用等體積乙酸乙酯分別對液體和固體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物進行萃取，乙酸乙酯相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到發(fā)酵提取物。

將發(fā)酵提取物用甲醇配制濃度為100 mg/mL，采用紙片擴散法[14]檢測樣品對4種指示菌的抗菌活性，以兩性霉素B、氨芐西林鈉和阿奇霉素為陽性對照，甲醇為陰性對照。

1.2.3 菌株Qhu-M197固體培養(yǎng)大量發(fā)酵與萃取

取保存于20%甘油中的菌株Qhu-M197，接種于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min，旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)3 d。將活化好的菌株，在MS固體培養(yǎng)基劃線分離，28℃恒溫箱培養(yǎng)3 d，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到含50 mL TSB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28℃，200 r/min旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)3 d，制備種子液，吸取200 μL種子液涂布于MS平板上，28℃，恒溫箱避光培養(yǎng)10 d，每個平板倒30 mL左右培養(yǎng)基，共計10 L培養(yǎng)基。待發(fā)酵完成后，將所有發(fā)酵平板切碎，使用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取物后，濃縮、干燥和稱重，獲得樣品5.35 g。

1.2.4 菌株Qhu-M197次級代謝產(chǎn)物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

發(fā)酵提取物經(jīng)MCI大孔吸附樹脂分離、甲醇水溶液：20%、40%、60%、80%和100%的梯度洗脫，HPLC檢測分析后，合并洗脫液，得到餾分：Fr.1～Fr.10。各個餾分抗菌活性追蹤結(jié)果表明，F(xiàn)r.7和Fr.8具有較好抗菌活性，隨后對這兩個餾分進一步純化。Fr.7經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(氯仿:甲醇1:1，V/V)分離，結(jié)合HPLC檢測合并得到5個餾分Fr.7.1～Fr.7.5。其中Fr.7.1與Fr.8.2合并后，再次使用Sephadex LH-20柱層析(氯仿:甲醇,1:1，V/V)進行分離，經(jīng)HPLC檢測合并得到3個子餾分Fr.7.1-1～Fr.7.1-3。采用半制備高效液相色譜進一步分離時的色譜柱均為Shim-pack GIST C18柱(10 mm×250 mm，5 μm)，流速4 mL/min，檢測波長254 nm。Fr.7.1-2采用半制備高效液相色譜(A相為水，B相為乙腈，38%B相等度洗脫)純化，得到化合物S1(37.1 mg)。 Fr.7.3經(jīng)半制備型高效液相色譜(A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇，50% B相等度洗脫)純化后得到化合物S2(3.6 mg)和S3(3 mg)。Fr.8經(jīng)Sephadex LH-20柱層析(氯仿:甲醇1:1，V/V)分離，HPLC檢測合并得到6個餾分Fr.8.1～Fr.8.6。Fr.8.5經(jīng)半制備型高效液相色譜(A相0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇，60% B相等度洗脫)純化得到化合物S4(4 mg)。通過高分辨質(zhì)譜(HR-ESIMS)結(jié)合核磁共振波譜(NMR)數(shù)據(jù)和文獻數(shù)據(jù)的比對，鑒定出化合物S1～S4的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 化合物S1～S4抗菌活性評價

采用微量二倍稀釋法[15]測定4個化合物的最小抑菌濃度MIC。DMSO溶解化合物，配制為濃度4 mg/mL的母液備用。在96孔板第一列每孔加入200 μL LB液體培養(yǎng)基，第2列加入100 μL LB液體培養(yǎng)基，第3列加入190 μL LB液體培養(yǎng)基，第4列及以后每列加入100 μL LB液體培養(yǎng)基，在第3列每孔加入樣品10 μL，吹打混勻，再從第3列吸取100 μL至第4列，吹打混勻后，按上述操作依次2倍稀釋至第12列，第12列吸取100 μL棄去。

4種指示菌37℃，180 r/min培養(yǎng)12 h后，使用滅菌后的LB培養(yǎng)基稀釋1000倍，除第一列外，每孔加入100 μL稀釋菌液，使各化合物終濃度分別為：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39和0.19 μg/mL。實驗設(shè)3個重復(fù)，以兩性霉素B、氨芐西林鈉、阿奇霉素為陽性對照，甲醇為陰性對照。將96孔板置于37℃恒溫箱培養(yǎng)16 h，觀察檢定菌培養(yǎng)基渾濁度，培養(yǎng)基最澄清的最低藥物濃度即為該化合物的MIC。

1.2.6 化合物S1～S4細胞毒活性評價

分別取對數(shù)生長期的HepG2細胞，MCF-7細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，使用添加10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基將細胞稀釋為1×105個/mL的細胞懸浮液，以每孔100 μL接種于96孔板中，37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h?；衔镉肈MSO溶解作為母液，并用MEM培養(yǎng)基將母液稀釋至0.01、0.1、1、10和100 μg/mL等5個濃度后備用。待細胞貼壁，吸棄96孔板中原有培養(yǎng)基，將已配制好的含有化合物的MEM培養(yǎng)基加入到96孔板中，每孔100 μL，每個濃度做6個重復(fù)孔。依據(jù)首次篩選結(jié)果，將化合物S1的處理濃度改為0.25、0.5、1、2和4 μg/mL?；衔颯2、S3和S4的處理濃度改為12.5、25、50、100和200 μg/mL。使用CCK-8[16]法測定細胞活性，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度，根據(jù)以下公式計算細胞存活率。細胞存活率=(實驗組細胞吸光值/對照組細胞吸光值)100%。Graphad prism8.0軟件計算化合物的IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

通過對菌株Qhu-M197的16S rRNA基因測序(GenBank收錄號為ON6520616)，將序列上傳至EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行比對，選取同源性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，結(jié)果顯示，菌株Qhu-M197與Streptomyces phaeoluteigriseusDSM 41896T(MPOH01000466)在同一分類支上，相似度為100.00%，初步鑒定該菌株為Streptomyces phaeoluteigriseussp.Qhu-M197。

2.2 鏈霉菌Qhu-M197發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性評價

利用YMG、ISP4培養(yǎng)基對Qhu-M197進行液體發(fā)酵，MS培養(yǎng)基對其進行固體發(fā)酵，采用紙片擴散法檢測菌株Qhu-M197的3種培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物對大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、白念珠菌的抗菌活性。結(jié)果顯示，菌株Qhu-M197發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌具有顯著的抑制活性，并且MS固體培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性最強(圖2和表1)。基于以上活性評價，后續(xù)研究選用MS固體培養(yǎng)基對菌株Qhu-M197進行大量發(fā)酵并進一步對其發(fā)酵產(chǎn)物中的活性成分進行分離和結(jié)構(gòu)鑒定工作。

表1 菌株 Qhu-M197 3種發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性結(jié)果Tab.1 The results of antimicrobial activity of fermentation products with three media of the strain Qhu-M197

2.3 菌株Qhu-M197次級代謝產(chǎn)物的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

菌株Qhu-M197以MS為培養(yǎng)基，進行固體培養(yǎng)，經(jīng)乙酸乙酯萃取和濃縮干燥，共獲5.35 g粗提物，經(jīng)過MCI大孔吸附樹脂、Sephadex LH20凝膠層析和半制備HPLC分離，獲得代號為S1～S4的4個化合物，經(jīng)1H NMR、13C NMR、HR-ESI-MS高分辨質(zhì)譜分析及與文獻數(shù)據(jù)比對，確定其分別為mithramycin (S1)，aerugine (S2)、aeruginol (S3)和2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dihydroxy-6H-1,5-benzoxazocin-6-one(S4)，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示。

化合物S1：黃色粉末狀(甲醇)，HR-ESI-MS:m/z[M-H]-1083.4658(cal 1083.4654)，分子式為C52H76O24。1H NMR (500 MHz,CD3OD): δ 2.74(1H,overlapped,3-H),2.73(1H,overlapped,4-Ha),2.44(1H,overlapped,4-Hb),6.32 (1H,s,5-H),2.04(3H,s,7-CH3),6.53 (1H,s,10-H),4.85(1H,s,1’-H),3.45(3H,s,1’-OCH3),4.26(1H,overlapped,3’-H),4.26(1H,overlapped,4’-H),1.30(3H,s,5’-CH3),4.61(1H,d,J=10.0 Hz,1A-H),2.20(1H,dd,J=5.0,12.0 Hz,2AH),1.57(1H,m,2A-H),3.62(1H,d,J=8.5 Hz,3AH),2.99(1H,d,J=8.5 Hz,4A-H),3.41(1H,m,5A-H),1.38(1H,d,J=6.0 Hz,6A-H)，4.76(1H,overlapped,1B-H),2.08(1H,m,2B-H),1.74(1H,d,J=10.5 Hz,2B-H),4.28(1H,overlapped,3B-H),3.06(1H,t,J=10.5 Hz,4BH),3.31(1H,overlapped,5B-H),1.28(1H,overlapped,6B-H)，5.04(1H,d,J=10.0 Hz,1C-H),2.67(1H,d,J=10.0 Hz,2C-H),1.59(1H,m,2C-H),3.79(1H,m,3C-H),3.06(1H,overlapped,4C-H),3.38(1H,m,5CH),1.31(1H,overlapped,6C-H),1.96(1H,m,2D-H),1.80(1H,overlapped,2D-H),3.88(1H,d,J=6.7 Hz,3D-H),3.70(1H,overlapped,4D-H),2.96(1H,q,J=9.0 Hz,5D-H),1.30(1H,overlapped,6D-H),4.99(1H,dd,J=2.0,10.0 Hz，1E-H),1.95(1H,m,2EH),1.62(1H,m,2E-H),1.25(1H,overlapped,H-CH3).2.94(1H,overlapped,4E-H),3.71(1H,overlapped,5EH),29(1H,overlapped,6E-H).13C NMR (126 MHz,CD3OD): δ 202.9(C-1),76.9(C-2),41.5(C-3),26.7(C-4),135.5(C-4a),100.6(C-5),158.4(C-6),110.2(C-7),7.3(7-CH3),155.2(C-8),107.0(C-8a),163.3(C-9),107.8(C-9a),116.7(C-10),138.0(C-10a),81.7(C-1’),58.1(1’-OCH3),212.2(C-2’),77.0(C-3’),68.3(C-4’),18.5(C-5’),98.9(C-1A),39.4(C-2A),70.6(C-3A),76.7(C-4A),72.1(C-5A),17.4(C-6A),95.7(C-1B),36.5(C-2B),78.7(C-3B),75.2(C-4B),71.6(C-5B),15.7(C-6B),100.7(C-1C),35.9(C-2C),79.5(C-3C),74.9(C-4C),80.1(C-5C),16.8(C-6C),98.6(C-1D),31.8(C-2D),75.9(C-3D),69.1(C-4D),76.5(C-5D),17.3(C-6D),97.5(C-1E),43.6(C-2E),70.5(C-3E),26.0(3E-CH3),76.4(C-4E),70.4(C-5E),16.8(C-6E)。以上化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[17-18]報道基本一致，確定化合物S1為mithramycin。

化合物S 2：灰褐色固體(甲醇)，H R-E S IMS:m/z[M+H]+209.0582(cal 209.0510)，分子式為C10H11NO2S。1H NMR (500 MHz,CD3OD) δ4.81(1H,m,4-H),3.48(1H,dd,J=11.0,8.8 Hz,5-H),3.79 (2H,dd,J=5.5,1.1 Hz,6-H),6.95～6.86 (2H,m,3',5'-H),7.42(1H,dd,J=7.9,1.6 Hz,4'-H),7.35 (1H,ddd,J=8.7,7.3,1.7 Hz,6'-H).13C NMR (126 MHz,CD3OD) δ173.61(C-2),79.54(C-4),33.73(C-5),64.26(C-6),117.60(C-1’),160.23(C-2’),117.85(C-3’),134.11(C-4’),119.99(C-5’),131.64(C-6’)。以上化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，確定化合物S2為aerugine。

化合物S3：灰褐色固體，HR-ESI-MS:m/z[M+H]+207.0425(cal 207.0354)，分子式為C10H9NO2S。1H NMR (500 MHz,CD3OD): δ 7.38 (1H,t,J=1.0 Hz,5-H),4.74 (2H,d,J=1.0 Hz,6-H),4.74(2H,d,J=1.0 Hz,6-H),7.75 (1H,dd,J=7.9,1.6 Hz,3’-H),6.92 (1H,td,J=7.5,1.2 Hz,4’-H),7.31 (1H,ddd,J=8.5,7.2,1.6 Hz,5’-H),6.98 (1H,dd,J=8.3,1.1 Hz,6’-H).13C NMR (126 MHz,CD3OD): δ168.54(C-2),156.23(C-4),113.29(C-5),59.48(C-6)，117.12(C-1’),155.90(C-2’),126.93(C-3’),119.23(C-4’),131.29(C-5’),116.89(C-6’)。以上化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致，確定化合物S3為aeruginol。

化合物S 4：灰褐色固體(甲醇)，H R-E S IMS:m/z[M+H]+209.0581(cal 209.0688)，分子式為C10H11NO4。1H NMR (500 MHz,CD3OD): δ3.48 (1H,dd,J=11.0,8.8 Hz,3-H),3.37 - 3.30 (2H,m,3-H),4.86- 4.78 (1H,m,4-H),3.79 (2H,dd,J=5.5,1.2 Hz,5-H),6.96 - 6.84 (2H,m,8,10-H),7.35 (1H,ddd,J=8.7,7.3,1.7 Hz,9-H),7.42 (1H,dd,J=7.8,1.6 Hz,11-H).13C NMR (126 MHz,CD3OD):δ 172.16(C-1),32.28(C-3),78.08(C-4),62.81(C-5),158.77(C-7),116.40(C-8),132.65(C-9),118.54(C-10),130.19(C-11),116.15(C-12)。以上化合物的波譜數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致，確定化合物S4為2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dihydroxy-6H-1,5-benzoxazocin-6-one。

2.4 化合物S1～S4的抗菌活性和細胞毒活性

采用微量二倍稀釋法測定了化合物S1～S4的最小抑菌濃度，結(jié)果如表2所示，化合物S1對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌均具有較強的抑制活性，MIC值分別為0.012和0.095 μg/mL，但對革蘭大腸埃希菌和白念珠菌未表現(xiàn)出顯著抑制活性。化合物S2、S3及S4對4種指示菌均無明顯抑制活性。

表2 化合物S1～S4的抑菌活性(MIC,μg/mL)Tab.2 The antimicrobial activity of compounds S1～S4(MIC,μg/mL)

CCK-8法檢查化合物S1～S4對兩株腫瘤細胞HepG2、MCF-7的生長抑制活性。結(jié)果表明， 化合物S1的IC50分別為0.45和0.46 μmol/L?；衔颯2、S3和S4僅在濃度大于100 μg/mL及以上時，對HepG2和MCF-7腫瘤細胞具有一定程度的增殖抑制作用。

3 討論與結(jié)論

極端生境是新型抗生素的重要來源[22]。Bao等[23]從1株西藏荒漠土壤來源的鏈霉菌Streptomycessp.XZHG99T的次級代謝產(chǎn)物中分離到了3種新的angucycline類化合物，這3個化合物對5株腫瘤細胞顯示出顯著的細胞毒活性，IC50最低0.09 nmol/L。

本研究對青藏高原高山草甸土壤樣品中分離出的菌株Qhu-M197開展了次級代謝產(chǎn)物研究。通過3種發(fā)酵培養(yǎng)基小量發(fā)酵，結(jié)合抗菌活性篩選，最終選定MS固體培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離鑒定了4個化合物，即mithramycin(S1)，aerugine (S2)、aeruginol (S3)、以及2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dihydroxy-6H-1,5-benzoxazocin-6-one(S4)。發(fā)現(xiàn)化合物S1即mithramycin，對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌具有顯著的抗菌活性；同時對兩株腫瘤細胞HepG2和MCF-7顯示出顯著細胞毒活性。文獻報道m(xù)ithramycin是一種抗革蘭陽性菌、抗腫瘤的抗生素，但對革蘭陰性菌無活性[24]，這與我們研究結(jié)果一致。另據(jù)文獻報道，aerugine (S2)對一些植物病原真菌表現(xiàn)出了一定程度的抑制作用[19]。以上研究表明，青藏高原高寒草甸來源的鏈霉菌是抗菌和抗腫瘤活性次級代謝產(chǎn)物的重要來源。本研究豐富了青藏高原特境來源放線菌活性次級代謝產(chǎn)物的研究結(jié)果，為拓展該特境放線菌的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。