蛭蛇通絡(luò)膠囊抗炎及舒張血管的有效組分辨識(shí)△

李煜，丁茹，張方博，楊洪軍

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；

2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；

3.陜西健民制藥有限公司，陜西 咸陽 712000；

4.中國中醫(yī)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700

腦卒中是導(dǎo)致全世界成年人死亡和致殘的主要病因，由腦血管病變所致腦部血液供應(yīng)障礙引起，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧，出現(xiàn)神經(jīng)功能損害，常伴有高血壓、糖尿病和高脂血癥等疾病[1]。其病理過程復(fù)雜，涉及炎癥反應(yīng)、能量代謝紊亂、血腦屏障損傷等[2]。通過治療恢復(fù)腦血流后，也會(huì)導(dǎo)致一定程度的組織損傷[3]，因此探索有效治療腦卒中的手段成為科學(xué)研究重點(diǎn)。

蛭蛇通絡(luò)膠囊是由人參、黃芪、天麻、丹參、紅花、葛根、川芎、石菖蒲、郁金、水蛭、冰片及烏梢蛇12 味中藥組成，具有益氣活血、息風(fēng)通絡(luò)等功效[4]，臨床用于腦梗死恢復(fù)期患者，癥見半身不遂、口舌歪斜、氣短乏力等。缺血性腦卒中的病理機(jī)制可能涉及抗炎、抗氧化應(yīng)激、血管舒縮等[5-6]。

含藥腸吸收液主要應(yīng)用于中藥及中藥復(fù)方質(zhì)量評(píng)價(jià)、體外藥理機(jī)制研究和有效成分辨識(shí)，具有避免未吸收成分的干預(yù)及耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)[7]。本研究從炎癥及血管舒張的藥理活性著手，利用脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 致炎模型和大鼠離體胸主動(dòng)脈舒縮模型，采用“腸吸收液-體外活性”結(jié)合拆方探索蛭蛇通絡(luò)膠囊抗炎和舒張血管的作用機(jī)制，明確蛭蛇通絡(luò)膠囊發(fā)揮抗炎及舒張血管作用的主要組分，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究其可行性和有效性。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

無特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD 大鼠10只，體質(zhì)量180～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：11401300087638。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)為2021B093。實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物房，室內(nèi)溫度為20～22 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，換氣頻率為15 次/h，確保自由飲食飲水。

小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。采用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試藥

人參、黃芪、天麻、丹參、葛根、水蛭、烏梢蛇、紅花、川芎、郁金和石菖蒲藥材均由陜西健民制藥有限公司提供，所有藥材均經(jīng)該公司王建英執(zhí)業(yè)藥師按《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）標(biāo)準(zhǔn)鑒定。潑尼松（批號(hào)：S173703，美國Selleckchem 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：8119017，美國Gibco公司）；FBS（批號(hào)：A58G00J，美國Gemini 公司）；LPS（批號(hào)：818E034，北京索萊寶科技有限公司）；小鼠源白細(xì)胞介素-1α（IL-1α，批號(hào)：129030469）、IL-1β（批號(hào)：125030470）和IL-6（批號(hào)：J11030471）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 儀器

ALC-M 型組織-器官水浴系統(tǒng)、ALC-CWB 型數(shù)控恒溫循環(huán)水槽均購于上海奧爾科特生物科技有公司；5452R 型低溫超高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；SpectraMax M5 型多功能酶標(biāo)儀（美國Becton-Dickinson 公司）；四通道離體組織器官灌流系統(tǒng)（美國Radnoti 公司）；MCO-18AIC 型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫

中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）；PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；BATMANTCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）；Venny 2.1.0 在線軟件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）；Cytoscape 3.7.1 軟件；Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)用溶液的制備

2.1.1臺(tái)氏（Tyrode）緩沖液的配制 分別取KCl、NaH2PO4、NaCl、MgCl2、NaHCO3各0.28、0.05、8.0、0.1、1.0 g以雙蒸水500 mL溶解，4 ℃保存?zhèn)溆茫籆aCl20.2 g 用雙蒸水500 mL 溶解，4 ℃保存?zhèn)溆茫皇褂们皩烧呋旌?，加入葡萄?.0 g，搖勻即得。

2.1.2各受試藥物供試液的配制 根據(jù)蛭蛇通絡(luò)膠囊的制備工藝路線，拆分為4 個(gè)組分，分別提取得到浸膏。浸膏1 為人參、黃芪、天麻、丹參和葛根用10 倍量60%乙醇提取2 次，合并提取液，濾過并減壓濃縮即得；浸膏2 為水蛭、烏梢蛇和紅花用10倍量水提取2 次，合并提取液，濾過并減壓濃縮即得；浸膏3 為川芎、郁金和石菖蒲經(jīng)水蒸氣蒸餾提取4 h，濾過并減壓濃縮即得；浸膏4 為合并以上3種浸膏，加60%乙醇適量，靜置沉淀24 h，濾過并減壓濃縮即得（不含冰片和揮發(fā)油）。分別稱取浸膏1～4 各34.0 g，以Tyrode 緩沖液200 mL 溶解，制備各受試藥物供試液。

2.1.3腸吸收液的制備 實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，脫頸處死，沿腹中線剪開皮膚和肌肉，發(fā)現(xiàn)胃幽門，并在幽門下方10 cm 處截?cái)嗄c段并沖洗干凈。將硅膠套管的一端插入腸管中，腸道內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)并用細(xì)線結(jié)扎。隨后用0 ℃Tyrode緩沖液沖洗腸段內(nèi)表面，另一端用線結(jié)扎牢固，以確保沒有泄漏。含藥腸吸收液（生藥量均為170.0 mg·mL-1）需量取2.1.2項(xiàng)下各受試藥物供試液25 mL，空白腸吸收液需量取Tyrode 緩沖液25 mL，預(yù)先將其加入麥?zhǔn)显」苤?，同時(shí)通入95% O2和5% CO2的混合氣體，開啟37 ℃恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)。使用注射器吸取Tyrode 緩沖液2 mL，注入腸管中，然后將其置于麥?zhǔn)显」苤小? h后收集腸管內(nèi)液體，0.22 μm 無菌濾膜濾過，即得組分1～3和全方4含藥腸吸收液，-20 ℃保存待用。

2.1.4克-亨氏（Krebs-Hensleit，K-H）液的制備 取A 液溶質(zhì)（NaCl 6.92 g、MgSO40.29 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.10 g、KCl 0.35 g）和B 液溶質(zhì)（CaCl20.28 g），各加雙蒸水溶解定容到500 mL，攪拌均勻，4 ℃保存?zhèn)溆?，臨用前將A 液500 mL 和B液500 mL混合，并加入葡萄糖2.0 g，搖勻即得。

2.2 LPS刺激RAW264.7細(xì)胞致炎模型

取對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7 細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)液，加入高糖DMEM 培養(yǎng)液適量，反復(fù)吹打后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL 的單細(xì)胞懸液。在24孔細(xì)胞板上每孔接種細(xì)胞懸液1 mL，培養(yǎng)24 h，分為對(duì)照組、模型組、給藥組和陽性藥組，每組重復(fù)3 次。對(duì)照組加入空白腸吸收液，給藥組加入2.1.3項(xiàng)下4個(gè)組分不同質(zhì)量濃度腸吸收液，陽性藥組加入不同質(zhì)量濃度潑尼松，孵育24 h 后，加入1.5 μg·mL-1LPS 1 mL，作用48 h，收集各組上清液，ELISA 檢測炎癥因子IL-1α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)。

2.3 離體血管舒縮活性

離體血管舒縮活性實(shí)驗(yàn)共分為6 組，即對(duì)照組（空白腸吸收液）、模型組（KCl刺激）和給藥組（4個(gè)組分含藥腸吸收液），實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3 次。雄性SD 大鼠脫頸處死，剪開胸腔迅速取出胸主動(dòng)脈條，放置于4 ℃K-H 液中，小心剝?nèi)ジ皆谛刂鲃?dòng)脈上的脂肪及結(jié)締組織，橫切成長3～4 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于預(yù)置K-H 液5 mL 的浴槽中，溫度（37.0±0.2）℃恒定，持續(xù)通入95% O2和5% CO2的混合氣體。標(biāo)本的一端固定，另一端經(jīng)張力換能器連接Radnoti 離體組織灌流系統(tǒng)，記錄實(shí)驗(yàn)過程中張力的變化。穩(wěn)定過程先以0 g張力開始，維持10 min；調(diào)節(jié)其基礎(chǔ)張力至1 g，平衡1 h，期間每隔20 min更換1次K-H液；主動(dòng)脈環(huán)穩(wěn)定后用1 mmol·L-1KCl 300μL刺激，作用15 min 后誘導(dǎo)血管環(huán)收縮，收縮穩(wěn)定后用預(yù)熱的K-H液洗脫；再次加入1 mmol·L-1KCl 300μL刺激，以激發(fā)最大收縮活性，收縮幅度為100%。4個(gè)組分的起始質(zhì)量濃度均為5.0 mg·mL-1，采用累積加樣法在浴槽中加入腸吸收液，累計(jì)依次加樣至100、200、400、600、800、1600、2000μL，每10 min加入1 次。隨著劑量的增加，舒張血管效應(yīng)發(fā)揮時(shí)間越長，最后計(jì)量觀察延長至30 min。以加入受試藥物后的血管張力變化幅度與KCl 誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率作血管舒張反應(yīng)的量-效曲線，藥物引起的收縮幅度均以第2 次KCl 引起的最大收縮幅度為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)值，用百分比表示。

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

TCMSP 數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻(xiàn)查找蛭蛇通絡(luò)膠囊各藥材成分信息[8-13]，通過成藥性（DL）≥0.18，且口服生物利用度（OB）≥30%進(jìn)行活性成分篩選。篩選活性成分后，利用PubChem 數(shù)據(jù)庫查詢其InChI 號(hào)，導(dǎo)入BATMANTCM 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫分別以“inflammation”和“vasodilation”為關(guān)鍵詞檢索炎癥和血管舒張靶點(diǎn)。蛭蛇通絡(luò)膠囊和水蛭、烏梢蛇、紅花組靶點(diǎn)分別與炎癥和血管舒張靶點(diǎn)交集后得出韋恩圖（Venny），并將交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）生物過程分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路富集分析。STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建交集靶點(diǎn)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.1 進(jìn)行拓?fù)浞治觯靼悬c(diǎn)以Betweenness Centrality、Closeness Centrality 和Degree 均大于中位數(shù)篩選核心靶點(diǎn)，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組分及全方腸吸收液對(duì)LPS 刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響

預(yù)實(shí)驗(yàn)已先用MTT 比色法篩選并確定各組分和全方對(duì)RAW264.7 細(xì)胞無毒性的質(zhì)量濃度范圍，應(yīng)用于3 個(gè)組分及全方的所有質(zhì)量濃度經(jīng)驗(yàn)證均無細(xì)胞毒作用。抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組炎癥因子IL-1α、IL-1β和IL-6 的水平顯著升高（P＜0.05）。組分1只能抑制IL-6的表達(dá)，組分2、3，全方4 和潑尼松均能抑制IL-1α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)。與組分3的抑制濃度相比，組分2的炎癥抑制作用較好，但仍以全方4 的綜合抑制作用最佳（表1～5）。

表1 不同質(zhì)量濃度的組分1腸吸收液對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

表1 不同質(zhì)量濃度的組分1腸吸收液對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；表2～6同。

表2 不同質(zhì)量濃度的組分2腸吸收液對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

表2 不同質(zhì)量濃度的組分2腸吸收液對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

表3 不同質(zhì)量濃度的組分3腸吸收液對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

表3 不同質(zhì)量濃度的組分3腸吸收液對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

表4 不同質(zhì)量濃度的全方4腸吸收液對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

表4 不同質(zhì)量濃度的全方4腸吸收液對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

表5 不同質(zhì)量濃度的潑尼松對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

表5 不同質(zhì)量濃度的潑尼松對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的影響（, n=3）

3.2 各組分及全方腸吸收液對(duì)離體血管舒張活性的影響

離體血管舒縮活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，組分1、2 和全方4 均有顯著的舒張血管作用（P＜0.05），組分1和組分2在相同的質(zhì)量濃度下，組分2的血管舒張率普遍更高，但仍以全方4 的舒張作用更強(qiáng)，舒張作用強(qiáng)弱順序?yàn)槿?＞組分2＞組分1，而組分3 沒有舒張血管作用（表6）。

表6 不同質(zhì)量濃度的組分1、2及全方4腸吸收液對(duì)血管舒張活性的影響（, n=3）

表6 不同質(zhì)量濃度的組分1、2及全方4腸吸收液對(duì)血管舒張活性的影響（, n=3）

炎癥和血管舒張的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，拆方后以組分2 的抗炎和舒張血管作用為最佳，但仍以全方4 的綜合作用為最強(qiáng)。組分2 的組成中藥為水蛭、烏梢蛇和紅花，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡釋全方和組分2抗炎和舒張血管分子機(jī)制的異同。

3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

3.3.1藥物化學(xué)成分和靶點(diǎn)與炎癥和血管舒張靶點(diǎn)預(yù)測 通過DL≥0.18 和OB≥30%篩選后，蛭蛇通絡(luò)膠囊中符合條件的化學(xué)成分分布在人參26 個(gè)、黃芪23 個(gè)、天麻3 個(gè)、丹參69 個(gè)、紅花27 個(gè)、葛根6個(gè)、川芎9 個(gè)、石菖蒲5 個(gè)、郁金15 個(gè)、水蛭3 個(gè)、冰片4 個(gè)、烏梢蛇3 個(gè)，共得到蛭蛇通絡(luò)膠囊985 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，水蛭、烏梢蛇和紅花組分390 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。炎癥相關(guān)靶點(diǎn)10 498 個(gè)，血管舒張相關(guān)靶點(diǎn)499 個(gè)，蛭蛇通絡(luò)膠囊與炎癥、血管舒張交集靶點(diǎn)分別為778、181 個(gè)，水蛭、烏梢蛇和紅花組分與炎癥、血管舒張交集靶點(diǎn)分別為312、82個(gè)（圖1）。

圖1 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花組分抑制炎癥和舒張血管靶點(diǎn)的韋恩圖

3.3.2PPI 網(wǎng)絡(luò)和“藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，蛭蛇通絡(luò)膠囊抑制炎癥靶點(diǎn)以Betweenness Centrality≥0.000 565 835，Closeness Centrality≥0.404 288 7 和Degree≥23 篩選獲得核心靶點(diǎn)281 個(gè)，水蛭、烏梢蛇和紅花抑制炎癥靶點(diǎn) 以Betweenness Centrality≥0.001 561 12，Closeness Centrality≥0.395 532 875 和Degree≥12 篩選獲得核心靶點(diǎn)102 個(gè)（圖2）。蛭蛇通絡(luò)膠囊舒張血管以Betweenness Centrality≥0.001 559 14，Closeness Centrality≥0.469 973 89 和Degree≥17 篩選獲得核心靶點(diǎn)71 個(gè)，水蛭、烏梢蛇和紅花舒張血管靶點(diǎn) 以Betweenness Centrality≥0.005 389 19，Closeness Centrality≥0.465 116 28 和Degree≥9 篩 選獲得核心靶點(diǎn)31 個(gè)（圖3）。蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花組分抑制炎癥共有88個(gè)相同核心靶點(diǎn)，舒張血管共有26 個(gè)相同核心靶點(diǎn)，并以核心靶點(diǎn)構(gòu)建藥物-化學(xué)成分-核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖4～5）。

圖2 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花組分抑制炎癥核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花組分舒張血管核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花組分抑制炎癥的藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖5 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花組分舒張血管的藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

3.3.3富集分析 通過Metascape 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物過程分析和KEGG 通路富集分析（P＜0.01）。蛭蛇通絡(luò)膠囊和水蛭、烏梢蛇、紅花組分抑制炎癥的生物學(xué)過程共同涉及激素水平（regulation of hormone levels）和有機(jī)羥基化合物代謝過程（organic hydroxy compound metabolic process）等（圖6），舒張血管共同涉及血液循環(huán)（blood circulation）和分泌調(diào)節(jié)（regulation of secretion）（圖7）。蛭蛇通絡(luò)膠囊和水蛭、烏梢蛇和紅花組分抑制炎癥KEGG 通路富集共同包括環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號(hào)通路和鈣（calcium）信號(hào)通路等（圖8），舒張血管共同與低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路和cAMP 信號(hào)通路等有關(guān)（圖9）。

圖6 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花組分抑制炎癥的GO生物過程分析

圖7 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花舒張血管的GO生物過程分析

圖8 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花抑制炎癥的KEGG信號(hào)通路富集分析

圖9 蛭蛇通絡(luò)膠囊與水蛭、烏梢蛇、紅花舒張血管的KEGG信號(hào)通路富集分析

4 討論

在我國，腦血管疾病是繼癌癥和心臟病之后的第三大導(dǎo)致死亡的原因[14]，死亡人數(shù)約占全球腦血管疾病死亡人數(shù)的1/3，而缺血性腦卒中屬于較為常見的腦血管疾病，占腦卒中發(fā)生率和死亡率的首位[15]，有研究發(fā)現(xiàn)，隨年齡增長農(nóng)村地區(qū)居民的患病率高于城市居民，且不同年齡段男性患病率均高于女性[16]。西醫(yī)治療通常采用外科手術(shù)，常伴有再出血和神經(jīng)損傷等風(fēng)險(xiǎn)。而大量研究表明，中藥可通過調(diào)控體內(nèi)炎癥、氧化、凋亡、抑制血管痙攣和自噬等相關(guān)信號(hào)通路治療腦卒中，并達(dá)到減少不良反應(yīng)的目的[17]。炎癥在腦卒中的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用，是治療干預(yù)的一個(gè)重要指標(biāo)[18]。急性炎癥導(dǎo)致缺血性損傷，由血流停滯、血管中白細(xì)胞活化及缺血內(nèi)皮和腦實(shí)質(zhì)釋放促炎介質(zhì)引起的炎癥反應(yīng)，還可能增加組織損傷[19]。腦血管舒縮反應(yīng)性（VMR）是指在給予強(qiáng)有力的血管舒張刺激前后腦血流（CBF）或腦血流速度（BFV）之間的變化，提供關(guān)于腦自動(dòng)調(diào)節(jié)和腦血管儲(chǔ)備能力的信息[20]。較低的腦血管舒縮反應(yīng)性反映了血管系統(tǒng)普遍受損，預(yù)示死亡風(fēng)險(xiǎn)增加[21]。因此，腦血管舒縮反應(yīng)性在腦卒中疾病治療方面發(fā)揮著不可忽略的作用[22]，有效抑制炎癥和舒張血管對(duì)腦卒中的治療至關(guān)重要。

蛭蛇通絡(luò)膠囊方中以人參和黃芪為君藥，兩者是中醫(yī)藥中著名的補(bǔ)氣藥，黃芪善補(bǔ)脾肺之氣，益氣養(yǎng)血[23]，人參補(bǔ)中益氣[24]，其主要成分人參皂苷Rg1可通過抗炎和促增殖等機(jī)制調(diào)控血管生成，保護(hù)血管免受損傷。以丹參、紅花、川芎、郁金、水蛭和烏梢蛇為臣藥，丹參活血化瘀，廣泛用于各種心腦血管疾病，可協(xié)同川芎擴(kuò)張血管、增加腦血流量，在治療缺血性腦卒中患者方面療效確切[25]。紅花活血通經(jīng)、祛瘀止痛；郁金疏肝解郁、清心涼血、行氣祛瘀，其化學(xué)成分莪術(shù)內(nèi)酯已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)可抑制由LPS 誘發(fā)的炎癥[26]，莪術(shù)二酮可以調(diào)節(jié)血管功能、抑制血小板凝集[27]。水蛭逐瘀破血，其成分可發(fā)揮凝血酶抑制劑的作用，從而預(yù)防和治療血栓性疾病[28]。烏梢蛇祛風(fēng)通絡(luò)，助天麻、紅花等活血化瘀，熄風(fēng)鎮(zhèn)痙[29]。天麻、葛根及石菖蒲為佐藥，天麻熄風(fēng)止痙；葛根生津退熱；石菖蒲養(yǎng)心安神，諸藥合用，共奏祛風(fēng)通絡(luò)之功效[30]。臨床研究表明，蛭蛇通絡(luò)膠囊治療腦梗死恢復(fù)期較化學(xué)藥效果更好，對(duì)于改善患者神經(jīng)損傷程度具有明顯作用[31]，但關(guān)于蛭蛇通絡(luò)膠囊的作用機(jī)制及有效組分辨識(shí)尚未見報(bào)道。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究蛭蛇通絡(luò)膠囊抗炎和舒張血管的主要有效組分。將具有12 味中藥的大復(fù)方按照制備工藝路線的組分先進(jìn)行拆解，再結(jié)合體外抗炎和舒張血管的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)水蛭、烏梢蛇和紅花組分抗炎和舒張血管效果最佳。水蛭的主要成分有直接作用于凝血系統(tǒng)的水蛭素等，蛋白酶抑制劑如水蛭透明質(zhì)酸酶等，以及甾體類、蝶啶類、糖脂類和羧酸酯類等小分子化合物和微量元素[32]，具有抗炎、清除自由基、抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷、增強(qiáng)梗死區(qū)血管新生、改善側(cè)支循環(huán)和抑制血小板活化與聚集等作用[33]。烏梢蛇含有多種氨基酸、蛋白質(zhì)（22.1%）、脂肪（1.7%）、核苷類成分和無機(jī)元素[34]，臨床常采用水煎和酒浸方法入藥，通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹和腹腔毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)研究表明烏梢蛇水溶性和醇溶性部位均有較好的抗炎作用[35]。烏梢蛇常配伍出現(xiàn)于治療腦卒中的中藥復(fù)方中，但其單獨(dú)或有效成分用于治療腦卒中的實(shí)驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。紅花含有生物堿、黃酮、聚炔、亞精胺、甾醇、木脂素和多糖等多種化學(xué)成分[36]，其中紅花黃色素和羥基紅花黃色素A等主要成分具有改善血液循環(huán)、降血壓、擴(kuò)血管、抗凝、抑制血栓形成、鎮(zhèn)痛和免疫抑制等作用[37]。羥基紅花黃色素A通過調(diào)節(jié)以核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）為核心的信號(hào)通路，抑制炎癥和氧化應(yīng)激、調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、拮抗血小板活化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)血腦屏障等[38]。

蛭蛇通絡(luò)膠囊全方和水蛭、烏梢蛇、紅花組分抑制炎癥篩選核心靶點(diǎn)時(shí)有胰島素受體（INS）、腫瘤壞死因子（TNF）、SRC 原癌基因、非受體酪氨酸激酶（SRC）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）等88 個(gè)共同靶點(diǎn)，舒張血管篩選出核心靶點(diǎn)INS、TNF、IL-1β和PPARA 等26 個(gè)相同靶點(diǎn)。PPAR屬于激素和脂質(zhì)激活核受體家族，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和發(fā)育，在炎癥及血管生成過程中發(fā)揮作用[39]?；罨腜PAR通過拮抗腦損傷相關(guān)的氧化或炎癥抑制神經(jīng)元死亡，保護(hù)血管，抑制缺血后內(nèi)皮功能的障礙，并誘導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)和內(nèi)皮再生[40]。SRC 蛋白是SRC 家族的重要成員，也是目前研究最多的成員，廣泛存在于組織細(xì)胞中，參與生長、代謝、發(fā)育和分化等過程，與腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系[41]。微小核糖核酸（miR-137）通過靶向SRC 蛋白抑制炎癥因子的分泌，并通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元損傷和認(rèn)知障礙，最終抑制大腦中動(dòng)脈栓塞小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[42]。蛭蛇通絡(luò)膠囊全方和水蛭、烏梢蛇、紅花組分均可能通過影響PPAR 和SRC 等靶點(diǎn)的活性影響炎癥和血管活性，治療腦卒中。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，蛭蛇通絡(luò)膠囊全方和水蛭、烏梢蛇、紅花組分抑制炎癥與舒張血管KEGG通路富集均包括cAMP 信號(hào)通路和鈣信號(hào)通路等，舒張血管均與HIF-1信號(hào)通路和cAMP信號(hào)通路等有關(guān)。cAMP是重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，可激活cAMP依賴性蛋白激酶A（PKA），cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）是一種轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)元興奮性中起關(guān)鍵作用[43]。人參皂苷Rb1上調(diào)cAMP/PKA/CREB 通路的表達(dá)，刺激軸突再生和神經(jīng)修復(fù)，改善大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠的神經(jīng)功能[44]。白藜蘆醇抑制磷酸二酯酶（PDE）的生成，并調(diào)節(jié)cAMP/AMPK/SIRT1通路，減少腦缺血期間的ATP 能量消耗，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[45]。HIF-1 是缺氧誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要的信號(hào)分子，作為磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、MAPK、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和p38 激酶途徑的底物[46]，有助于糖酵解和炎癥基因的誘導(dǎo)，同時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞活化也至關(guān)重要[47]。小鼠敲除HIF-1α基因后，炎癥增加，促炎因子表達(dá)水平升高，因此HIF-1α是控制炎癥所必需的[48]。且通過PI3K/Akt/HIF 依賴性信號(hào)通路可上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的表達(dá)，從而改善內(nèi)皮依賴性血管舒張[49]。HIF-1α通過NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎性體復(fù)合物調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，影響腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[50]。以上說明cAMP 信號(hào)通路和HIF-1 信號(hào)通路在腦卒中的發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要作用，蛭蛇通絡(luò)膠囊全方和水蛭、烏梢蛇和紅花組分均可能通過這2 條信號(hào)通路最終發(fā)揮治療腦卒中的作用。

綜上所述，蛭蛇通絡(luò)膠囊可有效抑制炎癥因子IL-1α、IL-1β和IL-6 的表達(dá)，促進(jìn)離體血管舒張活性，表明其通過抗炎和舒張血管發(fā)揮治療腦卒中的作用。拆方組分中，水蛭、烏梢蛇和紅花是發(fā)揮抗炎和舒張血管作用的主要有效藥味組合。雖然水蛭、烏梢蛇和紅花組方可能無法反映全方拮抗炎癥和舒張血管的全部活性，但根據(jù)制備工藝路線對(duì)中藥大復(fù)方進(jìn)行快速和簡便拆解，辨識(shí)發(fā)揮關(guān)鍵藥效的有效組分，有利于發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，控制中藥復(fù)方的質(zhì)量，并有利于闡釋分子作用機(jī)制。