基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的經(jīng)典名方枸杞湯治療糖尿病作用機制分析△

周洪立，鄭慧麗，朱悅，尚爾鑫，宿樹蘭，段然，段金廒，許惠琴*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 南京 210023；

2.寧夏枸杞創(chuàng)新中心，寧夏 銀川 750000

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種慢性進行性疾病，發(fā)病率高且增長迅速，到2030 年全球DM 患病率預(yù)計將超過10.2%[1]。DM 的主要病理特點是胰島素分泌缺陷或其他生物學(xué)作用障礙引起的以高血糖為特征的代謝紊亂[2]?；颊哐情L期處于高水平狀態(tài)，大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經(jīng)、眼睛、足等，引發(fā)多種并發(fā)癥及隨之而來的生活質(zhì)量下降和死亡風(fēng)險增加[3]。一系列橫斷面和前瞻性分析也表明，血糖濃度升高與并發(fā)癥的發(fā)生呈正相關(guān)[4-7]。我國DM 患病人數(shù)位居世界首位，僅2015 年我國就有130 萬人死于DM 及其并發(fā)癥，給社會帶來嚴重的健康與經(jīng)濟負擔[7]?，F(xiàn)階段，DM 的主要治療措施包括口服降糖藥、注射胰島素、飲食管理、鍛煉等，這些措施在控制血糖方面表現(xiàn)出良好的效果，但無法從根本上治愈DM 及延緩其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。

中醫(yī)將DM 歸屬于“消渴”范疇，傳統(tǒng)觀點認為，其主要病機以陰液虧虛為本、燥熱偏勝為標、瘀血為患貫穿始終，針對該病機特點，以滋補肝腎、清熱生津、化瘀通絡(luò)為基本治法[2]。南朝齊陳延之[8]《小品方》中形成了消渴三消分治的雛形，并收載“枸杞湯”治療“內(nèi)消”，該方由枸杞枝葉、栝樓根、石膏、黃連、生甘草組成?！缎∑贩健吩瓡涊d“消渴者，原其發(fā)動，此則腎虛所致”“夫內(nèi)消之為病，皆熱中所作也，小便多于所飲，令人虛極短氣……治之枸杞湯”，是中醫(yī)治療消渴病的較早記載。該方以枸杞枝葉為君藥，符合《神農(nóng)本草經(jīng)》枸杞“主熱中消渴”[9]與《藥性論》枸杞“子、葉同說，味甘，平。補益精，諸不足，易顏色，變白，明目，安神，令人長壽”[10]的功效認識，補益肝腎兼能清熱；栝樓根（即天花粉）、石膏與黃連等藥材清熱生津，生甘草補氣兼能清熱，符合中醫(yī)對消渴癥“肝腎虧虛，陰虛內(nèi)熱”病機的認識。該方曾被唐代孫思邈收錄于《備急千金要方》[11]，足見其對該方組方與療效的認可。

基于血糖控制是臨床改善DM 進程的根本方法及對枸杞葉“主治虛勞煩渴”傳統(tǒng)功效的認識，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性與系統(tǒng)性，對枸杞湯改善DM 的作用機制進行初步探討，分析其可行性，為臨床DM治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 枸杞湯有效成分的篩選與整理

通過中國知網(wǎng)（CNKI）、PubMed數(shù)據(jù)庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/），以“枸杞葉”“枸杞芽”“枸杞葉化合物”為關(guān)鍵詞檢索枸杞葉有效成分信息，利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https://www.tcmsp-e.com/）[12]將所得化合物以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件篩選，獲得枸杞葉有效成分；通過TCMSP 分別收集黃連、石膏、天花粉、甘草4 味中藥的有效成分，同上述枸杞葉篩選條件獲得有效化學(xué)成分，記錄成分的編號和名稱。通過TCMSP、PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和ChemDraw 18.0 軟件獲得有效成分的分子結(jié)構(gòu)。

1.2 枸杞湯有效成分及DM疾病靶點的預(yù)測與收集

將篩選所得枸杞湯有效成分通過TCMSP、SwissTargetPrediction 平臺（http://www.swisstarget prediction.ch/）[13]預(yù)測對應(yīng)靶點。以“diabetes mellitus”為疾病關(guān)鍵詞，通過OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank（https://www.drugbank.ca/）數(shù)據(jù)庫檢索，并與枸杞湯靶點取交集，獲得枸杞湯改善DM 的潛在靶點信息。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物有效成分與疾病靶點取交集，并上傳至STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）構(gòu)建交集靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)，生物種類設(shè)定為人類，將最小相互作用閾值設(shè)為0.9。利用Cytoscape 3.7.2 軟件中的MCODE 和Network Analyzer插件進行聚類和拓撲分析，獲得枸杞湯調(diào)節(jié)DM的核心靶點。

1.4 基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路分析

將篩選得到的枸杞湯調(diào)節(jié)DM 的靶點導(dǎo)入Metascape 3.5 平臺，將生物種類設(shè)定為人類，設(shè)置P＜0.001，分別進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，并將所得數(shù)據(jù)進行可視化分析。

1.5 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將所得枸杞湯有效成分、治療DM 相關(guān)靶點及通路富集分析結(jié)果進行映射，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件以構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接驗證

PDB 數(shù)據(jù)庫下載對接蛋白的PDB 結(jié)構(gòu)，PubChem 數(shù)據(jù)庫下載配體的SDF 結(jié)構(gòu)，利用Open Babel 軟件將SDF 配體小分子轉(zhuǎn)換為PDB 格式。然后通過PubChem 數(shù)據(jù)庫和Open Babel 3.1 軟件得到化合物PDB 格式文件，利用AutoDock Vina 1.5.6軟件進行分子對接，獲取其結(jié)合自由能信息。

2 結(jié)果

2.1 枸杞湯有效成分的收集

通過TCMSP篩選和查閱文獻[14-24]得到活性化合物數(shù)目分別為枸杞葉6 個、天花粉2 個、黃連6個、甘草80 個，石膏的主要成分CaSO4未檢索到相關(guān)靶點，故不計入統(tǒng)計。去除重復(fù)后，枸杞湯共有活性成分94個，見表1。

表1 枸杞湯活性成分拓撲信息

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 潛在治療靶點預(yù)測

通過TCMSP、SwissTargetPrediction 平臺預(yù)測靶點，共獲得枸杞湯靶點247 個。從GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫檢索疾病靶點，整合并刪除重復(fù)值，經(jīng)UniPort 數(shù)據(jù)庫規(guī)范化后得到1832 個疾病靶點。利用Venn 作圖取交集，如圖1 所示，得到211個枸杞湯改善DM的潛在靶點。

圖1 枸杞湯治療DM的藥物-疾病交集靶點

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將從STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫獲得的靶點PPI 圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，通過MCODE 聚類分析功能得到核心子網(wǎng)絡(luò)，如圖2～3 所示，靶點度值越大，形狀越大，表明靶點與網(wǎng)絡(luò)中其他靶點連接越緊密。熱休克蛋白90α家族成員A（HSP90AA1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、MAPK3、表皮生長因子受體（EGFR）等排名靠前的靶點為枸杞湯改善DM的核心靶點。

圖2 枸杞湯治療DM核心靶點PPI

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

圖3 枸杞湯治療DM核心靶點PPI子網(wǎng)絡(luò)

2.4.1GO 分析 利用Matescape 3.5 平臺對枸杞湯改善DM的潛在靶點進行GO分析，枸杞湯主要通過參與循環(huán)系統(tǒng)過程、對細胞外刺激的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、分泌調(diào)節(jié)、細胞化學(xué)穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)體液水平、小分子代謝過程的調(diào)節(jié)、腺體發(fā)育、離子傳輸?shù)恼{(diào)節(jié)、對細胞因子的反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞對壓力的反應(yīng)、老化等1996 個生物過程發(fā)揮改善DM 的作用；細胞組分條目共131 個，主要涉及膜筏、受體復(fù)合物、細胞質(zhì)核周區(qū)、神經(jīng)元細胞體、膜側(cè)、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）復(fù)合物、黏著斑、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)移含磷基團、細胞器外膜等；主要涉及蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、氧化還原酶活性、激酶結(jié)合、脂質(zhì)結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、激素結(jié)合、胰島素受體底物結(jié)合、絲氨酸水解酶活性、氧化還原酶活性等228 個分子功能。將P＜0.001 排名前10 的條目進行數(shù)據(jù)可視化處理，見圖4。

圖4 枸杞湯治療DM核心靶點GO分析

2.4.2KEGG 分析 利用Matescape 3.5平臺對枸杞湯調(diào)節(jié)DM 的潛在靶點進行KEGG 分析，枸杞湯主要通過參與調(diào)節(jié)PI3K/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、RAS 相關(guān)蛋白1（RAP1）信號通路、糖尿病并發(fā)癥（diabetic complications）中的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、內(nèi)分泌抵抗（endocrine resistance）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號通路、叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O（FoxO）信號通路、胰島素（insulin）信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路、2 型糖尿?。═2DM）等203 個通路發(fā)揮改善DM 的作用，將P＜0.001 排名前20 的條目運用R語言繪制氣泡圖，見圖5。

圖5 枸杞湯治療DM核心靶點KEGG通路分析

2.5 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過CytoScape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖6 所示，該網(wǎng)絡(luò)共有155 個節(jié)點（包括4種藥材、94 個活性成分、57 個靶點）。拓撲分析結(jié)果如表2所示，鱗葉甘草素A、3′-甲氧基光甘草定、甘草查耳酮B 等節(jié)點度值排名靠前，可能為枸杞湯中的主要活性成分。

圖6 枸杞湯治療DM藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)分析

2.6 分子對接結(jié)果

分析枸杞湯的藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)可知，鱗葉甘草素A、3′-甲氧基光甘草定、甘草查耳酮B 等成分的節(jié)點度值排名靠前，可能為枸杞湯的主要活性成分。選擇核心化合物中的鱗葉甘草素A 與甘草查耳酮B對應(yīng)核心靶點中的細胞色素P450家族19亞家族A 肽1（CYP19A1）、雌激素受體2（ESR2）、蛋白酪氨酸性磷酸酶非受體型1（PTPN1）、EGFR 進行分子對接，結(jié)合自由能結(jié)果見表2，可視化對接結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，枸杞湯中鱗葉甘草素A與甘草查耳酮B 均能與對應(yīng)靶點自發(fā)結(jié)合，且鱗葉甘草素A 與CYP19A1、ESR2、PTPN1 之間的結(jié)合自由能較低，甘草查耳酮B 與EGFR 之間的結(jié)合自由能較低，表明鱗葉甘草素A 和甘草查耳酮B 與對應(yīng)靶點之間有較好的結(jié)合活性，側(cè)面驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果。

圖7 枸杞湯治療DM核心成分和靶點分子對接模式圖

表2 枸杞湯核心成分與靶點蛋白分子對接結(jié)果

3 討論

DM 的西醫(yī)治療以控制血糖及生活管理為主。血糖的控制包括口服降糖藥及注射胰島素，在降糖方面效果顯著，但長期高血糖所伴隨的并發(fā)癥給疾病的治療帶來了諸多的挑戰(zhàn)，如DM 臨床一線治療藥物二甲雙胍因其使用禁忌中明確包含了糖尿病腎?。―KD），給DKD 患者降糖藥物的選擇帶來了困擾。在糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）等并發(fā)癥的治療中，在控制血糖的基礎(chǔ)上多以對癥治療為主，以降低疾病進一步發(fā)展所帶來的風(fēng)險，對已發(fā)生的病理改變多采用對癥治療，如部分糖尿病性黃斑水腫（DME）患者經(jīng)抗VEGF 療法治療后微血管瘤、滲出、靜脈串珠、新生血管、出血等病變有所改善，但這并未解決其本質(zhì)問題，即視網(wǎng)膜毛細血管周細胞凋亡、內(nèi)皮細胞增殖和繼發(fā)的毛細血管閉塞，以及缺血缺氧導(dǎo)致的VEGF 釋放與進一步的眼底損傷。DM 的疾病機制探究和臨床治療方法開發(fā)是亟須解決的醫(yī)學(xué)問題[25-26]。生活管理亦是DM 患者疾病控制的重要手段，當前對DM 患者的管理包括營養(yǎng)治療原則，并參與規(guī)律、適量的體育鍛煉。DM 患者的自我管理早在隋唐時期就有記載，巢元方提出“消渴”患者“先行一百二十步，多者千步，然后食之”，孫思邈提出“消渴”三慎:“一飲酒，二房事，三咸食及面”[27-28]。

近年來，隨著中醫(yī)藥治療DM 研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)復(fù)方及單味中藥在改善DM 及其并發(fā)癥中療效顯著，而用藥局限性及不良反應(yīng)相對較小。中藥具有多成分多靶點的優(yōu)勢，可干預(yù)疾病的不同靶點與信號通路，表現(xiàn)出多種藥理學(xué)活性。枸杞湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑，為“治渴而利者方”，方中枸杞葉清熱止渴、祛風(fēng)明目、生津補肝，主治虛勞發(fā)熱、煩渴、目赤昏痛、障翳夜盲等證，為君藥；天花粉清熱瀉火、生津止渴，黃連泄火解毒，石膏清熱瀉火、除煩止渴共為臣藥；甘草為使，調(diào)和諸藥。諸藥合用共奏滋陰清熱、生津補虛之效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，枸杞葉中富含多糖、酚酸、黃酮等活性成分，包括蘆丁、咖啡酸、綠原酸、新綠原酸、槲皮素-3-O-槐糖-7-O-鼠李糖苷等，且枸杞葉提取物可調(diào)節(jié)血糖和血脂水平，降低蛋白尿、轉(zhuǎn)氨酶水平和減輕胰島素抵抗，對糖尿病大鼠腎小球、腎小管和胰島細胞起到保護作用[29-31]。亦有研究表明，枸杞葉提取物通過抑制高血糖介導(dǎo)的腎臟氧化應(yīng)激和炎癥改善糖尿病腎病，治療后，糖尿病大鼠血清肌酐、尿素氮顯著降低，白蛋白水平升高，而尿蛋白水平明顯降低，肌酐清除率明顯升高[32]。《名醫(yī)別錄》記載：“黃連止消渴?！逼渌幮镔|(zhì)基礎(chǔ)為黃連素，在DM及其并發(fā)癥的治療中應(yīng)用已久[33-34]。黃連素能夠增加葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）的表達及活性，從而增加細胞對葡萄糖的攝取，起到降糖效應(yīng)[35]，并可抑制高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）和纖維連接蛋白（FN）的表達，發(fā)揮抗DKD的重要作用[36]。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞湯中的關(guān)鍵化合物光甘草定具有降糖作用，能顯著提高小鼠體質(zhì)量，糖耐量，肝、腎、胰組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低肝、腎、胰腺組織中纖維蛋白原（FBG）水平和丙二醛（MDA）含量[37]。而甘草查耳酮具有抗氧化活性，能增強細胞本身抗氧化能力[38]。

由成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)可知，枸杞湯中94 個活性成分主要通過HSP90AA1、SRC、STAT3、MAPK1、MAPK3、EGFR、磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（PIK3R1）、PIK3CA、Akt1 等靶點，影響PI3K-Akt、cAMP、FoxO、AGE-RAGE、RAP1、HIF-1、VEGF、內(nèi)分泌抵抗、胰島素抵抗等信號通路，可能通過改善胰島素抵抗、糖異生、葡萄糖轉(zhuǎn)運、炎癥及免疫反應(yīng)來發(fā)揮改善DM 的作用。FoxO1 參與了β細胞的增殖、分化與凋亡、胰島素抵抗及肝臟葡萄糖生成，且在脂質(zhì)代謝和脂肪組織調(diào)節(jié)方面具有重要作用，未來可能成為糖脂代謝性疾病的治療靶點[39]。VEGFA 是視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的關(guān)鍵物質(zhì)，DM 患者視網(wǎng)膜的長期缺血缺氧狀態(tài)會引發(fā)VEGF 表達上調(diào)，并激活下游PI3K/Akt 信號通路，加速視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞形成新生微血管腔這一過程[40]。HIF-1α是細胞內(nèi)重要的缺氧信號蛋白，參與血管形成、糖代謝、紅細胞生成及細胞的存活和凋亡等過程，而VEGF 主要受HIF-1α的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在高血糖和缺血缺氧狀態(tài)下會誘導(dǎo)HIF-1α的表達上調(diào)，作為其下游重要的靶基因，VEGF 也隨之上調(diào)[41-42]。AGEs 在糖尿病及其并發(fā)癥中占有重要位置，陳玉萍等[43]認為，AGEs是糖尿病“腎陰虧虛、內(nèi)熱傷陰津”的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

“陰虛為本，燥熱為標”為消渴病的基本病機，貫穿“消渴”的疾病始終。近年來，通過生物信息學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、基因芯片等技術(shù)發(fā)現(xiàn)陰虛火旺證候主要涉及cAMP、花生四烯酸（arachidonic acid）、鞘脂（sphingolipid）等差異代謝產(chǎn)物，JAK/STAT、胰島素、MAPK、腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）、色氨酸代謝（tryptophan metabolism）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）等信號通路[44-47]。cAMP 作為信號分子參與活性氧（ROS）產(chǎn)生與應(yīng)激反應(yīng)，可促進下游cAMP 依賴性蛋白激酶（PKA）和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）蛋白磷酸化，清除ROS，降低氧化應(yīng)激水平，減輕2型糖尿病誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[48]。而枸杞湯對上述部分信號通路及代謝產(chǎn)物具有干預(yù)作用，可能是其改善“陰虛火旺”證候的作用靶點。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建了藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，為枸杞湯治療DM 作用機制的深入研究提供了參考，同時也為DM 的中醫(yī)臨床治療提供了借鑒。