馬先蒿類(lèi)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

吳歡，喻文韜，鐘國(guó)躍，黃文平，吳宗耀，占堆，次仁，才讓南加*，馮育林*

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330006；

2.西藏藏醫(yī)藥大學(xué)，西藏 拉薩 850000

馬先蒿類(lèi)藥材是玄參科（Scrophulariaceae）馬先蒿屬（PedicularisL.）植物，《中國(guó)植物志》記載馬先蒿屬植物為雙子葉植物中的大屬之一，分布于北半球，尤以北極和近北極地區(qū)最多，溫帶的高山地帶亦有一定量分布，馬先蒿屬植物有500種以上，記載入藥的50余種，在中國(guó)分布廣泛、資源豐富[1]。

藏族藥馬先蒿又名“露如”“美朵”等，在民間藥用歷史悠久，臨床常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛、疥瘡、尿路結(jié)石致小便排泄不暢等。但由于藏藥的命名復(fù)雜，不同地區(qū)使用藥材具有顯著的地域性特點(diǎn)，使得該類(lèi)藥材基原種類(lèi)繁多，市場(chǎng)出現(xiàn)一名多藥、一藥多物、地方用藥品種混亂等現(xiàn)象[2]。而且該類(lèi)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系目前極不完善，難以滿足市場(chǎng)需求。

目前，市場(chǎng)常用的馬先蒿品種為紫花馬先蒿、紅花馬先蒿和黃花馬先蒿。據(jù)《晶珠本草》記載，紫花馬先蒿花為紫紅色，莖長(zhǎng)、中空，一側(cè)有3片葉，從此側(cè)開(kāi)花，花狀如公綿羊角彎曲；紅花馬先蒿花為紅色，其他同紫花馬先蒿；黃花馬先蒿花為黃色，葉為綠色。紅花和黃花馬先蒿狀同，花莖中空而長(zhǎng)，氣味很香[3]。故本研究參照藏族醫(yī)典籍分類(lèi)選取市場(chǎng)常用的花為紫色的甘肅馬先蒿P.kansuensisMaxim.、花為紅色的蘚生馬先蒿P.muscicolaMaxim.及花為黃色的黃花馬先蒿P.flavaPall.，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)成分研究，建立合理的定性定量方法，為馬先蒿類(lèi)藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系構(gòu)建及合理應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20 AT 型高效液相色譜儀、AUW 220 D 型十萬(wàn)分之一電子天平（日本島津公司）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Cosmosil 公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品毛蕊花糖苷（批號(hào)：RSF-01101910014，純度＞98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；聚酰胺薄膜（10 cm×10 cm，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）；水為超純水；其他試劑為分析純和色譜純。

馬先蒿類(lèi)藥材樣品均由江西中醫(yī)藥大學(xué)鐘國(guó)躍教授鑒定為甘肅馬先蒿Pedicularis kansuensisMaxim.、黃花馬先蒿P.flavaPall.、蘚生馬先蒿P.muscicolaMaxim.，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 馬先蒿類(lèi)藥材樣品采集信息

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

2.1.1甘肅馬先蒿 參照《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版（一部）顯微鑒別法（通則2001）進(jìn)行粉末制片，根據(jù)觀察對(duì)象不同，滴加相應(yīng)試液，蓋片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。甘肅馬先蒿粉末深綠色或黃綠色；非腺毛2～6 個(gè)細(xì)胞，表面有小突起，頂端細(xì)胞尖，常有1～2 個(gè)細(xì)胞縊縮；花粉粒圓形，淡黃色，外壁光滑；導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管和網(wǎng)紋導(dǎo)管；葉上表皮細(xì)胞垂周壁微波狀彎曲，葉下表皮細(xì)胞垂周壁微波狀彎曲，氣孔不定式。顯微特征圖見(jiàn)圖1。

圖1 甘肅馬先蒿藥材粉末顯微圖（×40）

2.1.2黃花馬先蒿 參照《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）顯微鑒別法（通則2001）進(jìn)行粉末制片，根據(jù)觀察對(duì)象不同，滴加相應(yīng)試液，蓋片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。黃花馬先蒿粉末黃綠色；非腺毛2～4 個(gè)細(xì)胞，頂端細(xì)胞尖；花粉粒圓形，淡黃色，外壁光滑，導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管；腺毛呈棒狀。顯微特征圖見(jiàn)圖2。

圖2 黃花馬先蒿粉末顯微圖（×40）

2.1.3蘚生馬先蒿 參照《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）顯微鑒別法（通則2001）進(jìn)行粉末制片，根據(jù)觀察對(duì)象不同，滴加相應(yīng)試液，蓋片，顯微鏡下觀察并拍照記錄。蘚生馬先蒿粉末深綠色；非腺毛2～3 個(gè)細(xì)胞，頂端細(xì)胞尖，常有1～2 個(gè)細(xì)胞縊縮；花粉粒圓形，淡綠色，外壁光滑，導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管和網(wǎng)紋導(dǎo)管；葉上表皮細(xì)胞垂周壁微波狀彎曲；腺毛呈棒狀。顯微特征圖見(jiàn)圖3。

圖3 蘚生馬先蒿粉末顯微圖（×40）

2.2 薄層鑒別

取馬先蒿類(lèi)藥材粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min（200 W，40 kHz），濾過(guò)，濾液蒸干后殘?jiān)蛹状? mL 溶解，即得供試品溶液。另取甘肅馬先蒿（1907122）藥材粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min（200 W，40 kHz），濾過(guò)，濾液蒸干后殘?jiān)蛹状? mL 溶解即得對(duì)照藥材溶液。參照《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）薄層色譜法（通則0502）吸取上述溶液各1μL，分別點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（1∶7∶2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜和對(duì)照藥材色譜在相應(yīng)位置上顯示相同顏色斑點(diǎn)（圖4），該方法分離效果良好，比移值（Rf）適中，能有效快速地區(qū)分不同品種馬先蒿。

圖4 15批馬先蒿類(lèi)藥材薄層色譜圖

2.3 高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定毛蕊花糖苷含量

通過(guò)前期對(duì)馬先蒿類(lèi)藥材進(jìn)行成分分析和文獻(xiàn)調(diào)研[4]，發(fā)現(xiàn)該類(lèi)藥材毛蕊花糖苷含量較高，該成分具有抗炎、抗腫瘤等藥理作用[5]。故選擇毛蕊花糖苷為馬先蒿類(lèi)藥材指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

2.3.1色譜條件 色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑Cosmosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-1%冰乙酸水溶液（16∶84），檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.3.2對(duì)照品溶液制備 精密稱取毛蕊花糖苷對(duì)照品10.68 mg，加流動(dòng)相制成0.1 mg·mL-1對(duì)照品溶液[6]，即得。

2.3.3供試品溶液制備 取藥材粉末0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提?。?00 W，40 kHz）30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)[7-8]，即得。

2.3.4專(zhuān)屬性考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀。結(jié)果見(jiàn)圖5～6。液相色譜儀，以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，線性回歸方程為Y=14 288 765.06X-6 129.44（r=1.000），毛蕊花糖苷在10.70～214.00μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

圖5 空白溶劑、對(duì)照品溶液和馬先蒿類(lèi)藥材供試品溶液HPLC圖

2.3.6精密度試驗(yàn) 精密稱取甘肅馬先蒿（1907122）粉末0.5 g，按照供試品溶液制備方法制備，樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定毛蕊花糖苷峰面積，計(jì)算得峰面積RSD 為0.19%，表明該儀器精密度良好。

2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取甘肅馬先蒿（1907122）粉末0.5 g，按照供試品溶液制備方法制備，分別在0、2、4、6、10、12 h 將樣品注入液相色譜儀，測(cè)定毛蕊花糖苷峰面積，計(jì)算得峰面積RSD為1.23%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取甘肅馬先蒿（1907122）粉末0.5 g，按照供試品制備方法制備6份，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算毛蕊花糖苷含量（以干燥品計(jì)）。計(jì)算得毛蕊花糖苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.56%，RSD為1.05%，表明該方法重復(fù)性好。

2.3.9加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的甘肅馬先蒿（1907122）6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置于100 mL 具塞錐形瓶中，每份加入毛蕊花糖苷3.0 mg，按供試品溶液制備方法制備加樣供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，樣品平均回收率為102.75%，RSD 為1.69%，表明該方法測(cè)定準(zhǔn)確、可靠。

表2 馬先蒿類(lèi)藥材中成分毛蕊花糖苷的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

圖6 馬先蒿類(lèi)藥材HPLC圖

2.3.5線性關(guān)系考察 取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，配制成質(zhì)量濃度分別為10.70、21.40、53.50、107.00、160.50、214.00 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，注入高效

2.3.10 樣品含量測(cè)定 按照2.3.1 項(xiàng)下色譜條件對(duì)馬先蒿屬樣品中的毛蕊糖苷含量進(jìn)行測(cè)定，以干燥品計(jì)算含量測(cè)定結(jié)果，見(jiàn)表3?；跇悠樊a(chǎn)地、采集時(shí)間不同，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，參考其他藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)以均值下浮20%暫定馬先蒿屬植物中毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)按干燥品計(jì)算不得少于0.70%。

表3 馬先蒿類(lèi)藥材中毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水分、總灰分、酸不溶灰分、浸出物檢測(cè)結(jié)果

2.4 馬先蒿類(lèi)藥材水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物檢測(cè)

參照《中國(guó)藥典》2020 年版（四部），對(duì)馬先蒿類(lèi)藥材水分（通則0832 第一法）、總灰分（通則2302）、酸不溶灰分（通則2302）、浸出物（通則2201）進(jìn)行考察[9-10]。根據(jù)考察結(jié)果選擇以50%乙醇為溶劑，以熱浸法進(jìn)行浸出物的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮藥材的采收加工、貯藏方式等因素，以均值上浮20%將馬先蒿類(lèi)藥材水分限度暫定為不超過(guò)12%，總灰分限度不超過(guò)11%，酸不溶灰分限度不超過(guò)2%。根據(jù)浸出物考察結(jié)果，選用50%乙醇為溶劑，以熱浸法測(cè)定多品種馬先蒿藥材，將浸出物限度暫定為醇溶性浸出物不少于24%。

3 討論

結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)樣本進(jìn)行成分分析，發(fā)現(xiàn)3 種馬先蒿類(lèi)藥材均以毛蕊花糖苷為主要成分，故將3 種馬先蒿類(lèi)藥材納入同一標(biāo)準(zhǔn)下進(jìn)行質(zhì)量屬性研究。

通過(guò)顯微鑒別建立了馬先蒿類(lèi)藥材薄層色譜方法，參考相關(guān)文獻(xiàn)并結(jié)合實(shí)際情況，考察了不同展開(kāi)體系，摸索了多種展開(kāi)劑比例，結(jié)果顯示，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（1∶7∶2）為展開(kāi)劑薄層分離度好、Rf 適中、專(zhuān)屬性強(qiáng)，能有效快速地區(qū)分不同品種的馬先蒿藥材，所以將此方法定為馬先蒿類(lèi)藥材的薄層鑒別方法。

在毛蕊花糖苷的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比了超聲和回流的提取方式，選擇了水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇為提取溶劑，考察了超聲提取20、30、40 min 等方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇以甲醇為溶劑，超聲提取30 min（200 W，40 kHz）為樣品提取方法。含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，考察了2 種流動(dòng)相比例，乙腈-1%冰乙酸水溶液（20∶80）和乙腈-1%冰乙酸水溶液（16∶84），結(jié)果表明，乙腈-1%冰乙酸溶液（16∶84）作為流動(dòng)相所得色譜峰分離度最優(yōu)，保留時(shí)間適中。實(shí)驗(yàn)還對(duì)柱溫、色譜柱耐用性進(jìn)行了考察，最終確立了本研究所用色譜方法。

本研究從鑒別、含量測(cè)定等方面對(duì)馬先蒿類(lèi)藥材進(jìn)行多方位全面的質(zhì)量研究，首次建立了多種馬先蒿藥材的薄層鑒別、HPLC 含量測(cè)定方法，實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，為馬先蒿類(lèi)藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供了有力依據(jù)，為規(guī)范馬先蒿藥材的品種劃分及開(kāi)發(fā)利用提供了參考。