藏族藥小葉棘豆藥材質(zhì)量標準研究△

夏夢棋，歐陽輝，吳宗耀，格桑頓珠，鐘國躍，格桑次仁，楊世林，頓珠*，馮育林*

1.江西中醫(yī)藥大學 中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330006；

2.西藏藏醫(yī)藥大學，西藏 拉薩 850000

1 材料

1.1 試藥

13 批小葉棘豆藥材樣品收集自西藏自治區(qū)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學鐘國躍教授鑒定為小葉棘豆Oxytropis microphylla（Pall.）DC.，樣品來源及批號見表1；對照品2′,4′-二羥基查耳酮（批號：wkq21011101，純度：97%，四川維克奇生物公司）；色譜純乙腈、甲酸（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；其余試劑均為分析純；水為超純水。

表1 13批小葉棘豆來源信息

1.2 儀器與耗材

LC-20 AT 型高效液相色譜儀、AUW 220 D 型十萬分之一電子天平（日本島津公司）；COSMOSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本Nacalai Tesque 公司）；KQ-5200 DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CLA 00001142 C 型超純水機（英國ELGA 公司）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；Reprostar 3 型薄層色譜攝像儀（瑞士卡瑪公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀鑒別

本品多皺縮，碎斷，長可達15 cm。根圓錐狀，有分枝，表面黑褐色，質(zhì)韌，斷面纖維狀。莖極短，叢生，基部殘存密被白色綿毛的托葉。輪生羽狀復葉，多破碎，完整者展開長5～15 cm；托葉卵狀披針形，近革質(zhì)，與葉柄基部合生，背面被稠密的白色綿毛，具腺點；葉柄與葉軸密被白色綿毛，具腺點；小葉多數(shù)輪生，每輪2～4（6）枚，小葉片長橢圓形或卵形，長3～5 mm，寬約2 mm，邊緣內(nèi)卷，上面疏被柔毛，兩面密生腺點。氣臭，味微苦、澀。小葉棘豆與來源于鐮莢棘豆藥材的性狀差異主要在于后者為奇數(shù)羽狀復葉，小葉呈鐮狀披針形，長7～12 mm[7]。

2.2 顯微鑒別

按照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（四部）顯微鑒別法（通則2001）進行粉末制片，根據(jù)觀察對象不同，滴加相應試液，蓋片，顯微鏡下觀察并拍照記錄，見圖1。

圖1 小葉棘豆粉末顯微圖（×40）

灰白色粉末。非腺毛眾多，長100～600 μm，莖15～46 μm，無色，雙細胞，頂端銳尖，基部細胞短且壁較薄。導管多見，具螺紋和梯紋2 種，以梯紋導管為主，莖21～41 μm，紋孔呈窄縫。纖維少見，常碎斷，莖10～41 μm，頂端尖，壁厚有少數(shù)單紋孔。

2.3 薄層色譜法（TLC）鑒別

取小葉棘豆藥材粉末（過二號篩）1 g，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取小葉棘豆對照藥材（批號：20200923）1 g，同法制成對照藥材溶液。按照《中國藥典》2020 年版通則0502，吸取上述2 種溶液各3 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。見圖2。

圖2 小葉棘豆藥材TLC圖

2.4 水分、浸出物、灰分測定

按照《中國藥典》2020 年版通則0832 水分測定法第一法烘干法測定樣品中水分，結(jié)果見表2。

以60%乙醇為溶劑，按照《中國藥典》2020 年版通則2201 醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定樣品中浸出物，結(jié)果見表2。

按照《中國藥典》2020 年版通則2302 灰分測定法對樣品中總灰分和酸不溶性灰分進行測定，結(jié)果見表2。

根據(jù)測定結(jié)果并結(jié)合《中國藥典》2020 年版中藥材的標準，水分、總灰分及酸不溶性灰分均以平均值的120%設限，浸出物以平均值的80%設限[20]，見表2。

表2 小葉棘豆藥材檢查項考察結(jié)果

2.5 高效液相色譜法（HPLC）含量測定

小葉棘豆含有黃酮類成分，研究表明，2′,4′-二羥查耳酮是其主要成分之一，具有抗炎鎮(zhèn)痛活性[22-23]，故選擇其作為含量測定的指標性成分。

2.5.1對照品溶液的制備 取2′,4′-二羥查耳酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成0.583 mg·mL-1的溶液。精密吸取上述溶液2 mL，加甲醇制成0.046 6 mg·mL-1的溶液，即得。

2.5.2供試品溶液的制備 取小葉棘豆（批號：20201120）藥材粉末（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（100 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3色譜條件 色譜柱為COSMOSIL C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B），等度洗脫（0.01～48.00 min，40%B；48～55 min，95%B；55～65 min，40%B）；流速為1 mL·min-1；檢測波長為345 nm[22]；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.5.4方法學考察

2.5.4.1專屬性試驗 精密吸取空白溶液、2′,4′-二羥查耳酮對照品和供試品溶液注入色譜儀，并按2.5.3 項下色譜條件進行測試，理論板數(shù)不低于5000，色譜圖見圖3。小葉棘豆提取物中2′,4′-二羥查耳酮與相鄰色譜峰的分離度＞1.5，說明該方法專屬性良好。

圖3 小葉棘豆樣品、2′,4′-二羥查耳酮對照品HPLC圖

2.5.4.2線性關系考察 將配制的2′,4′-二羥查耳酮對照品溶液按不同的倍數(shù)稀釋，得到7 個不同質(zhì)量濃度（0.009 3、0.023 3、0.037 3、0.046 6、0.069 9、0.093 3、0.139 9 μg·mL-1）的溶液。精密吸取上述7 份對照品溶液注入液相色譜儀，并以色譜峰面積和2′,4′-二羥查耳酮對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y）進行線性關系考察，其線性關系為Y=5×107X-44 171（r=1.000）。結(jié)果表明，2′,4′-二羥查耳酮在0.009 3～0.139 9 μg·mL-1質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.4.3精密度試驗 精密吸取2′,4′-二羥查耳酮對照品溶液，按2.5.3 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，計算得到2′,4′-二羥查耳酮色譜峰面積的RSD 為0.57%，表明儀器精密度良好。

2.5.4.4重復性試驗 取同一批（批號：20201120）樣品，按2.5.2 項下方法制備供試品溶液，平行6份，并按2.5.3 項下色譜條件進行測試。小葉棘豆提取物中2′,4′-二羥查耳酮平均質(zhì)量分數(shù)為1.17%，RSD為1.88%，說明該方法重復性較好。

2.5.4.5穩(wěn)定性試驗 取小葉棘豆（批號：20201120）供試品溶液，按2.5.3 項下色譜條件分別在0、2、4、6、10、17、24 h 進樣測定，計算得到2′,4′-二羥查耳酮色譜峰面積的RSD 為0.47%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4.6加樣回收率試驗 取小葉棘豆（批號：20201120）供試品溶液6 份，分別精密加入相同體積的對照品（0.105 2 mg·mL-1），按2.5.2 項下方法制備供試品溶液，按2.5.3 項下色譜條件進樣測定，計算平均加樣回收率，2′,4′-二羥查耳酮平均回收率為100.49%，RSD為2.99%，具體結(jié)果見表3。

表3 小葉棘豆中2′,4′-二羥查耳酮加樣回收率試驗結(jié)果

2.6 樣品含量測定

取13 批小葉棘豆樣品，按2.5.2 項下方法制備樣品溶液，按2.5.3 項下色譜條件進行測定，計算樣品中2′,4′-二羥查耳酮成分的含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，13 批小葉棘豆樣品的2′,4′-二羥查耳酮質(zhì)量分數(shù)為0.75%～1.72%，均值為1.34%，取均值的80%設限，其質(zhì)量分數(shù)不得少于1.0%，13 批藥材中有11 批合格，合格率為84.6%，故規(guī)定2′,4′-二羥查耳酮質(zhì)量分數(shù)不得低于1.0%。

表4 13批小葉棘豆中2′,4′-二羥查耳酮質(zhì)量分數(shù) %

3 結(jié)果與討論

本研究考察了13 批小葉棘豆浸出物、水分、總灰分、酸不溶性灰分含量，根據(jù)測定結(jié)果并結(jié)合《中國藥典》2020 年版中藥材的標準，建議規(guī)定小葉棘豆的醇溶性浸出物不得少于16%、水分不得超過7%、總灰分不得超過32%、酸不溶性灰分不得超過26%，以干燥品計算，2′,4′-二羥基查耳酮質(zhì)量分數(shù)不得少于1.0%。

“莪大夏”為藏醫(yī)臨床常用特色藥材，本課題組調(diào)查表明小葉棘豆O.microphylla為其主流商品之一（共收集“莪大夏”藥材18 批，經(jīng)基原鑒定，其中13 批為該種），而有關標準中并未收載該種。同時該種的資源較為豐富，具有利用的價值。本研究建立的方法準確度好、靈敏度較高，可為后續(xù)小葉棘豆藥材質(zhì)量標準的建立及質(zhì)量控制提供參考。