基于ITS2的和田玫瑰分子進(jìn)化分析△

寧慧霞，鹿娟娟，2，魯春芳，文洪江，努爾波拉提·阿依達(dá)爾汗，海白爾·火加艾合買提，劉戈宇*

1.中國科學(xué)院 新疆理化技術(shù)研究所 中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點實驗室/省部共建新疆特有藥用資源利用重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；

2.中國科學(xué)院 新疆分院，新疆 烏魯木齊 830011；

3.烏魯木齊市技術(shù)創(chuàng)新研發(fā)與科技成果轉(zhuǎn)化中心，新疆 烏魯木齊 830002；

4.中國科學(xué)院大學(xué) 化學(xué)科學(xué)學(xué)院，北京 100190

和田地區(qū)的地理、光、熱及水資源等自然環(huán)境造就了和田玫瑰獨特的品質(zhì)，和田玫瑰花具有質(zhì)優(yōu)、肉厚、味純濃、含油量高和香味濃等優(yōu)勢，是新疆特色藥食同源植物，在新疆地區(qū)使用廣泛。和田玫瑰新鮮花蕾中多糖、黃酮含量顯著高于同地區(qū)栽培的紫枝玫瑰、苦水玫瑰和豐花玫瑰，多酚含量僅次于苦水玫瑰[1]。和田玫瑰花瓣總黃酮、總多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基均有不同程度的清除作用[2]。和田玫瑰性溫，味甘，具有行氣解郁、活血止痛等功效，多用來治療肝胃氣痛、食欲不振、月經(jīng)不調(diào)等疾病，是維吾爾族藥成方制劑玫瑰花糖膏、養(yǎng)心達(dá)瓦依米西克蜜膏、炎消迪娜兒糖漿、玫瑰花口服液和《國家基本藥物目錄》收載品種寒喘祖帕顆粒等使用的主要藥物。玫瑰花在和田栽培歷史悠久，近年來，隨著脫貧攻堅和鄉(xiāng)村振興工作的深入開展，和田地區(qū)玫瑰由房前屋后的庭院種植轉(zhuǎn)向大田規(guī)模化種植，目前栽培面積約6 萬畝（1 畝≈666.67 m2），主要分布在和田地區(qū)于田縣、策勒縣、墨玉縣、洛浦縣等[3-4]，已成為新疆和田地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)作物。種植和田玫瑰成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收致富的重要途徑和極具區(qū)域優(yōu)勢的特色產(chǎn)業(yè)。

陶弘景[5]的《本草經(jīng)集注》中記載：“諸藥所生，皆有境界”。此處境界指的便是藥用植物的生長環(huán)境，說明道地藥材與其產(chǎn)地有相當(dāng)密切的關(guān)系。根據(jù)《中華人民共和國中醫(yī)藥法》（2016 年12 月25 日通過），道地藥材是我國傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)藥材的代表，是指經(jīng)過中醫(yī)臨床長期優(yōu)選出來的，在特定地域，通過特定生產(chǎn)過程所產(chǎn)的，較其他地區(qū)所產(chǎn)的同種藥材質(zhì)量好、品質(zhì)佳、療效好，具有較高知名度的藥材。過去對中藥材道地性的研究主要停留在產(chǎn)地、性狀和生態(tài)環(huán)境等方面，其本質(zhì)及規(guī)律性方面的研究還不夠深入。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，目前許多學(xué)者采用分子手段評價道地藥材[6-8]，道地藥材具有道地性的根本原因是其基因型在特定時空表達(dá)的產(chǎn)物（即藥材基因型在特定環(huán)境中表達(dá)產(chǎn)生的次生代謝物）不同造成的。韓建萍等[9]應(yīng)用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)分析了不同產(chǎn)地梔子的親緣關(guān)系，證明道地性的產(chǎn)生是基因型和環(huán)境共同作用的結(jié)果。中藥材生態(tài)變異與生態(tài)型的分化和形成是物種對不同環(huán)境生態(tài)條件的長期適應(yīng)與自然選擇的結(jié)果，種內(nèi)變異是中藥材品質(zhì)優(yōu)劣和療效差異的實質(zhì)。

雖然和田玫瑰的應(yīng)用與貿(mào)易歷史悠久，但是對其研究僅始于20 世紀(jì)，尤其是分子系統(tǒng)發(fā)育方面的研究在國內(nèi)外鮮見報道。文獻(xiàn)報道和田食用玫瑰栽培已有2000 多年的歷史[3-4,10]，但這種說法的分子進(jìn)化依據(jù)及和田玫瑰的道地性內(nèi)涵、親本起源、分子鑒定特征尚不明確。本研究以和田玫瑰為研究對象，通過DNA 條形碼方法獲得和田玫瑰內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）序列，分析其序列特點，與薔薇屬物種及《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版收錄的玫瑰花[11]的ITS2序列保守位點、差異位點及分子進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行比對，以了解和田玫瑰系統(tǒng)發(fā)育特點，探討和田玫瑰親本起源、進(jìn)化分歧時間，以期為和田玫瑰藥材道地性分子識別和評價、道地性產(chǎn)區(qū)認(rèn)證、綜合開發(fā)利用提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

樣品來源于新疆和田國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)、墨玉縣農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)、中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所藥材種植基地栽培的3年生和田玫瑰，每次采集3個點，每個點采集3個樣品，采集2次，合計采集18批樣品。樣品由石河子大學(xué)閻平教授鑒定為和田玫瑰Rosa damascena‘Hetian’Mill.，保存于中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所（憑證號：PS0338MT02）。從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank中，以序列長度完整、去除重復(fù)的單倍型、序列一致性為88.96%～94.33%檢索薔薇科薔薇屬（Rose）、委陵菜屬（Potentilla）、地榆屬（Sanguisorba）ITS2序列。統(tǒng)一拉丁名、不同GenBank 號的序列下載不超過3 條。共獲得薔薇屬植物ITS2 序列36 條、委陵菜屬12條、地榆屬4條（數(shù)據(jù)下載日期為2020年6月15日，表1）。

表1 和田玫瑰材料信息

1.2 試劑

DP305 植物基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；2×Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）Master Mix（含藍(lán)染料）、PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.3 儀器

5417R型離心機(jī)、Mastercycler nexus X2型梯度PCR 儀（德國Eppendorf 公司）；164-5052 型高電流電泳儀、Gel Doc XR+型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 樣品DNA提取和PCR擴(kuò)增

取硅膠干燥的和田玫瑰幼嫩葉片100～150 mg 于干凈的研缽中，加液氮迅速研磨成粉，取約35 mg置于滅菌的2.0 mL 離心管中，根據(jù)植物基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取總DNA，取獲得的DNA 3 μL，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，其余DNA 樣品放于1.5 mL 離心管，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物序列、PCR 反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序見參考文獻(xiàn)[12]，ITS2通用引物序列為ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′和ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR 反應(yīng)體積50.0 μL，體系包含Mix 25.0 μL、引物各2.0 μL（10 μmol·L-1）、總DNA 2.0 μL（約50 ng）、雙蒸水19 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在冰箱中-20 ℃保存。

2.2 電泳檢測和測序

由1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇明顯特異條帶樣品送到生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。測序均采用正反雙向，以保證準(zhǔn)確性。

2.3 序列分析、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用CodonCode Aligner V5.5 軟件校對拼接序列峰圖，去除引物和低質(zhì)量序列，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 相似度最高物種的序列邊界，截取序列邊界。使用軟件MEGA X 中的Align by ClustalW 比對分析，查看差異位點、保守位點、信息指數(shù)，采用鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹Kimura 2-parameter模型評估各物種之間的親緣關(guān)系，采用Bootstrap（1000 次重復(fù)）檢驗各分支的可信度和支持率。在ITS2 核糖體的DNA 數(shù)據(jù)庫（http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/）中，ITS2 序列基于隱馬爾可夫模型HMMer注釋方法，去除兩端5.8S和28S區(qū)段，獲得標(biāo)準(zhǔn)ITS2 序列，同樣使用該網(wǎng)站通過最小自由能原理及同源比對預(yù)測法預(yù)測目標(biāo)序列的ITS2 二級結(jié)構(gòu)[13]。

2.4 分化時間推斷

用MEGA X 的CLOCKS RelTime 方法推斷進(jìn)化時間，展示界面需要導(dǎo)入的文件有序列信息和樹文件，選擇外類群（outgroup）和校準(zhǔn)點。

在推斷前需要準(zhǔn)備以下文件：1）序列信息文件。包含外類群及校準(zhǔn)點的.FASTA 格式序列分析文件；以與薔薇屬相近的委陵菜屬、地榆屬作為外類群。2）樹文件。由MEGA X 通過Align by ClustalW 建立的MEGA Format 格式比對文件，隨后此文件通過MEGA-X PHYLOGENY 建立的.Newick格式的系統(tǒng)發(fā)育樹文件。

確定校準(zhǔn)點：用MEGA X 的TIMETREE，在TimeTree 顯示框輸入大于屬水平的一類物種，推斷物種之間分化的時間節(jié)點。用TIMETREE Node Time 輸入2 個物種，推斷之間分化的時間節(jié)點，以分化時間最小的定為第1 個校準(zhǔn)點、分化時間最大的定為第2 個校準(zhǔn)點。打開MEGA X 軟件，依次點擊CLOCKS、Compute Timetree，選擇RelTime-ML，依據(jù)提示上傳相應(yīng)文件；點擊Set Options，選擇默認(rèn)參數(shù)OK；點擊Launch Analysis即可建立具有分化時間的系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 和田玫瑰序列特點

基于ITS2 引物，去除引物區(qū)后獲得長度為409 bp序列，基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法，去除5′端5.8S 和3′端28S 區(qū)段，獲得和田玫瑰標(biāo)準(zhǔn)的ITS2 序列204 bp，提交NCBI 獲得GenBank號為MZ015569。18 批樣品測序結(jié)果基本一致，選用其中1 個序列做后續(xù)分析。將和田玫瑰409 bp序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLASTN 比對分析，發(fā)現(xiàn)前100個序列是薔薇屬、委陵菜屬和地榆屬，其序列覆蓋度為85%～94%，序列一致性為88.96%～94.33%。而對ITS2 204 bp 序列進(jìn)行BLASTN 比對分析，發(fā)現(xiàn)前100 個序列都是薔薇屬，序列覆蓋度為100%，序列一致性為88.21%～91.39%。

獲得的409 bp 和田玫瑰序列：1～39 bp 為小亞基核糖體核糖核酸基因和ITS1 部分序列；40～64 bp 為5.8S 核糖體核糖核酸基因全序列；65～268 bp 為ITS2 全序列；269～409 bp 為大亞基核糖體核糖核酸基因部分序列。

3.2 和田玫瑰與薔薇屬物種ITS2 序列差異位點、信息位點分析

對表1 中的序列用MEGA X 選擇單倍型后做后續(xù)分析。變異位點及信息位點數(shù)可反映所分析材料的堿基變異程度。將和田玫瑰ITS2 序列與在GenBank 下載的26 條薔薇屬物種單倍型序列經(jīng)MEGA X 進(jìn)行比對分析，總長度422 bp（包括Gaps），保守位點（conserved sites）388 個，變異位點（variable sites）31 個，信息位點（parsim-info sites）7個（圖1）。

3.3 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

將下載的26 條薔薇屬單倍型序列與和田玫瑰的ITS2 標(biāo)準(zhǔn)序列作為內(nèi)系群（ingroup），6 條委陵菜屬和2 條地榆屬ITS2 單倍型序列作為外類群（outgroup），經(jīng)MEGA X 進(jìn)行分子系統(tǒng)聚類分析，由圖2 可知，自展支持率為100%明顯聚為3 類：和田玫瑰與26 條薔薇屬序列聚為一類、6 條委陵菜屬聚為一類、2 條地榆屬聚為一類。在薔薇類中，英國和意大利產(chǎn)玫瑰聚為一類，屬于歐洲（區(qū)）系玫瑰；北京、新疆烏魯木齊、西藏聚產(chǎn)玫瑰為一類，屬于亞洲（區(qū)）系玫瑰，歐洲（區(qū)）系玫瑰和亞洲（區(qū)）系玫瑰在北半球，又聚為一大類；加拿大產(chǎn)玫瑰聚為一類，屬于北美洲（區(qū)）系玫瑰。和田玫瑰與歐洲（區(qū)）產(chǎn)玫瑰Rosa sherardii距離最近，親緣關(guān)系也最近。

圖2 和田玫瑰系統(tǒng)發(fā)育樹

用MEGA-X 的TIMETREE TimeTree 推斷薔薇屬、委陵菜屬、地榆屬物種之間分化的大約時間節(jié)點（圖3），由TIMETREE 現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫可知，薔薇屬早在24.3 MYA（百萬年）開始分化，最近分化時間是13 MYA，見圖4。用TIMETREE Node Time 推斷出薔薇屬最小分化時間大約為13 MYA、最大分化時間約為28 MYA，見圖4。由MEGA X 的CLOCKS Rel Time推斷和田玫瑰大致分化時間（圖5），圓點標(biāo)記為和田玫瑰花的進(jìn)化起始時間是大約0.029 MYA前，即29 000年前和田玫瑰開始出現(xiàn)。

圖3 薔薇屬、委陵菜屬、地榆屬物種之間分化時間推斷

圖4 薔薇屬物種最小、最大分化時間推斷

圖5 和田玫瑰分化時間推斷

3.4 和田玫瑰與《中國藥典》2020 年版收載玫瑰ITS2差異分析

《中國藥典》2020 年版收載的玫瑰為薔薇科植物玫瑰R.rugosaThunb.的干燥花蕾，ITS2 序列GenBank 號為KF454162，長度為417 bp（包括Gaps），標(biāo)準(zhǔn)ITS2 序列總長度為211 bp；經(jīng)與和田玫瑰MEGA X 進(jìn)行比對分析，保守位點為388，變異位點為21 個（圖6），無信息位點。在ITS2 序列數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站預(yù)測和田玫瑰與玫瑰的ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩者有高度相似的（high quality model，all helices，percentages 100/100/100/80）二級結(jié)構(gòu)模型，但也有一定的差異，主要在Ⅲ螺旋區(qū)部位，見圖7。

圖6 和田玫瑰與玫瑰ITS2序列差異位點

圖7 和田玫瑰與玫瑰ITS2序列二級結(jié)構(gòu)

4 討論

4.1 和田玫瑰親本起源分析

玫瑰是一種很古老的植物。據(jù)古生物學(xué)家和地質(zhì)學(xué)家對薔薇葉片化石鑒定證明，3000 萬年前在地球的北半球，玫瑰就曾有過繁榮時期。有資料報道，在撫順地區(qū)發(fā)現(xiàn)葉片化石，距今約6000 萬年，其化石標(biāo)本與玫瑰R.rugosa相似[14]?；谛螒B(tài)和染色體數(shù)目推測，大馬士革玫瑰R.damascene、白玫瑰R.alba和百葉玫瑰R.centifolia都有共同的最初始的親本，即法國玫瑰R.gallica，而在三者中大馬士革玫瑰是比較早的[15]。據(jù)《新疆植物志》第2 卷第2 分冊記載[16]，薔薇屬（RosaL.）包含5 組21 種，其中法國薔薇組（Sect.Gallicanae DC.ex Ser.）有法國薔薇R.gallicaL.、突厥薔薇R.damasceneMill.、百葉薔薇R.centifoliaL.3 個種，其中突厥薔薇即大馬士革玫瑰。大馬士革玫瑰從中東引入西歐，并在16 世紀(jì)后期重新引入，廣泛用于歐洲薔薇的改良。微衛(wèi)星基因分型結(jié)果表明，大馬士革玫瑰遺傳多樣性高，保加利亞、伊朗和印度的玫瑰和大馬士革玫瑰具有相同的微衛(wèi)星圖譜，表明其有一個共同的起源[17]。王輝[18]從11 個主要油用玫瑰基地收集了栽培種28份，其中有和田基地的和田玫瑰，基于葉綠體matK基因序列比對和聚類分析，和田玫瑰與湖州大馬士革、格拉斯R.centifolia_1、平陰大馬士革R.damascena_3、渭南大馬士革R.damascene、渭南百葉R.centifolia_2、羅崗R.centifolia‘Luogang’、云南百葉R.centifol_3、蘇聯(lián)香水玫瑰2 號R.centifolia_4 聚為一類，說明新疆和田玫瑰與大馬士革類玫瑰、百葉類玫瑰淵源上有相同的祖先。

本研究結(jié)果顯示，在自展支持率為100%時，和田玫瑰ITS2 序列與26 條薔薇屬序列聚為一類，6 條委陵菜屬聚為一類，2 條地榆屬聚為一類。在薔薇類中，歐洲（區(qū)）系英國和意大利產(chǎn)玫瑰聚為一類，亞洲（區(qū)）系北京、新疆烏魯木齊、西藏產(chǎn)玫瑰聚為一類；北半球歐洲（區(qū)）系玫瑰和亞洲（區(qū)）系玫瑰又聚為一大類；北美洲（區(qū)）系加拿大產(chǎn)玫瑰聚為一類，而和田玫瑰與歐洲（區(qū)）系產(chǎn)玫瑰距離最近，親緣關(guān)系最近。說明玫瑰分布具有地理分布特點，即區(qū)域性特點，不同產(chǎn)地玫瑰親緣關(guān)系與地理分布具有一定相關(guān)性，采用ITS2 序列能將不同產(chǎn)地玫瑰樣品區(qū)分開。分子系統(tǒng)發(fā)育分析表明，和田玫瑰起源于歐洲的玫瑰系，而歐洲的玫瑰系最初親本是大馬士革玫瑰。由此從分子進(jìn)化系統(tǒng)發(fā)育推斷出，和田玫瑰追根溯源屬于大馬士革玫瑰，是大馬士革玫瑰自然優(yōu)化的品種，從分子角度進(jìn)一步印證了形態(tài)學(xué)分類的正確性、有效性。

4.2 和田玫瑰進(jìn)化分歧時間分析

地球上所有生物都從上一代體內(nèi)繼承DNA 遺傳基因，且這種遺傳基因會隨著時間的變化而逐漸改變（即按一定的速率發(fā)生堿基突變）。運(yùn)用分子鐘技術(shù)，通過直接對比不同物種間基因的堿基排列順序，便可推測生物進(jìn)化的起始時間。ITS2 遺傳信息在解決系統(tǒng)發(fā)育位置和不同物種間的親緣關(guān)系方面做出了重要貢獻(xiàn)，同時也廣泛用于揭示物種起源和估計各譜系間的分歧時間。在本研究中選擇了與薔薇屬內(nèi)類群在演化關(guān)系上最為接近、具有最相近的祖先、進(jìn)化程度上低于薔薇屬內(nèi)類群的委陵菜屬和地榆屬ITS2 序列作為外類群，采用分子鐘模型估算和田玫瑰進(jìn)化分歧時間，推導(dǎo)出和田玫瑰約在29 000 多年前分化出來，至今存在20 000 多年。從而印證了和田玫瑰從西方傳到塔克拉瑪干，在沙漠邊緣扎根，經(jīng)過20 000 多年的自然馴化與人工選育，培育成了如今的和田玫瑰，成為遷徙玫瑰品種中的上品玫瑰[4]。和田玫瑰于2016 年12 月20 日經(jīng)新疆林木品種審定委員會審定，正式命名為“和田”玫瑰，良種編號為新S-SV-RD-002-2016。

分子鐘系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，和田玫瑰與分化時間較早的絨毛薔薇和狗薔薇聚類較近，玫瑰與分化時間較晚的多花薔薇聚類較近。

4.3 ITS2序列及其二級結(jié)構(gòu)用于和田玫瑰鑒定分析的可行性

ITS2 序列適合物種鑒定和構(gòu)建植物類群系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，已得到國內(nèi)外學(xué)者的肯定[19-23]，鑒定方法被納入《中國藥典》2020 年版，成為藥用植物鑒定必不可少的分子標(biāo)記之一。

除核酸序列外，ITS2 的二級結(jié)構(gòu)也被認(rèn)為可以提供遺傳信息。ITS2二級結(jié)構(gòu)是由RNA單鏈自身回折而形成的配對和未配對堿基交替而成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[24]，在真核生物中均為“一環(huán)四臂”模型[25-27]，“一環(huán)”指未配對的環(huán)區(qū)部分，“四臂”指4 條配對堿基組成的螺旋區(qū)（Helix），分別記為螺旋Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[28]。大量數(shù)據(jù)比對分析發(fā)現(xiàn)，在ITS2 的4 條螺旋中，螺旋Ⅱ最短且保守性最高，螺旋Ⅲ最長，螺旋Ⅰ和螺旋Ⅳ都較短且保守性低；螺旋Ⅱ沒有分支，常有嘧啶-嘧啶錯配形成的凸環(huán)；螺旋Ⅲ偶見分支，而且在5′端近頂端部位序列保守性最高，包含UGGU（或UGGGU、UGG、GGU）序列；在螺旋Ⅰ和螺旋Ⅳ之間的環(huán)上嘌呤含量較高；ITS2 形狀的保守性規(guī)律為環(huán)區(qū)形狀比螺旋區(qū)保守，中間部位比兩邊部位保守[29]。而不同的物種其螺旋區(qū)的莖環(huán)數(shù)目、大小、位置及螺旋發(fā)出的角度有差異，在不考慮堿基的情況下，其形狀信息具有可比性。

二級結(jié)構(gòu)信息的加入使得ITS2 序列在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中末端分支變多、分辨率與支持率有所提高[30]，二級結(jié)構(gòu)已用于紫菀族的鑒定和親緣關(guān)系研究[31]。楊美青等[32]提出，在基于ITS2 序列及其二級結(jié)構(gòu)對防己及其混偽品的鑒定中，雖然ITS2 可以作為防己及其混偽品的DNA條形碼，但是若包含ITS2二級結(jié)構(gòu)所蘊(yùn)含的系統(tǒng)發(fā)育信息，鑒定結(jié)果更加精準(zhǔn)。在木通植物的鑒定中，加入ITS2 二級結(jié)構(gòu)信息，系統(tǒng)樹的物種分辨率提高了33%，且成功地將木通與其混偽品分開；在茄屬藥用植物類群中，加入二級結(jié)構(gòu)信息后，很好地解決了茄屬幾種藥用植物的鑒定問題[33]。

和田玫瑰與其他薔薇屬玫瑰相比，有其自身的序列特點、二級結(jié)構(gòu)特征等。在ITS2 序列數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站預(yù)測和田玫瑰ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)符合上述規(guī)律，并與《中國藥典》2020 年版記載玫瑰的ITS2 序列二級結(jié)構(gòu)對比發(fā)現(xiàn)，兩者有高度相似的二級結(jié)構(gòu)模型，螺旋Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ都一樣，只有在Ⅲ螺旋區(qū)部位存在差異。綜上，和田玫瑰ITS2 序列及二級結(jié)構(gòu)特點可用于和田玫瑰的鑒定。