熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣組織菌群構(gòu)成及功能的比較分析

葉靜 ，戴文芳 ，劉圣 ，林志華 ，薛清剛 *

( 1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.浙江萬(wàn)里學(xué)院 寧海海洋生物種業(yè)研究院，浙江 寧海 315604；3.浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315100)

1 引言

動(dòng)物體內(nèi)定殖著數(shù)量龐大且種群構(gòu)成復(fù)雜的微生物。這些微生物與宿主互相依賴(lài)、彼此制約，形成一種相對(duì)穩(wěn)定的共生關(guān)系，從而維持宿主的健康狀態(tài)[1-2]。研究表明，共生微生物在宿主的消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、抗逆和抗菌等方面發(fā)揮著重要作用[3-5]。

牡蠣廣泛分布于沿海地區(qū)，是世界范圍內(nèi)養(yǎng)殖最廣、產(chǎn)量最高的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，也是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖種類(lèi)之一。同時(shí)，牡蠣在生物多樣性保護(hù)、凈化水體、修復(fù)生態(tài)系統(tǒng)的功能等方面發(fā)揮重要作用[6]。然而，受生長(zhǎng)環(huán)境和濾食習(xí)性的影響，牡蠣體內(nèi)的共生微生物構(gòu)成易受到養(yǎng)殖環(huán)境的影響，進(jìn)而會(huì)影響牡蠣的健康狀況[7]。因此，穩(wěn)定的細(xì)菌群落可能為牡蠣的健康生長(zhǎng)提供有利條件。研究表明，某些益生菌能夠降低宿主對(duì)疾病的易感性，這已經(jīng)在貝類(lèi)的養(yǎng)殖中得到證實(shí)[8-9]。例如，投喂益生菌短小芽孢桿菌RI06-95（Bacillus pumilusRI06-95）可 以 提 高 美 洲 牡 蠣（Crassostrea virginica）抵抗溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）的侵染，從而提高其存活率[10]。另一方面，牡蠣在養(yǎng)殖過(guò)程中易受細(xì)菌性疾病的影響。如燦爛弧菌（Vibrio splendidus）被證實(shí)是導(dǎo)致長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）幼體在育苗期間發(fā)生大規(guī)模死亡的主要病原菌之一[11]。此外，牡蠣還可能攜帶人類(lèi)致病性細(xì)菌，隨著人們食用進(jìn)入人體，從而影響人體的健康。如食用受副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染的貝類(lèi)是導(dǎo)致食物中毒的主要因素[12]。因此，探明牡蠣體內(nèi)細(xì)菌群落的構(gòu)成顯得尤為重要。

相比于傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法，Illumina高通量測(cè)序技術(shù)具有通量高、時(shí)間短以及能夠更全面地反映樣本間細(xì)菌群落的相關(guān)信息等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為研究微生物組學(xué)的重要手段。該技術(shù)目前已用于探究魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)和貝類(lèi)等多種水生動(dòng)物腸道細(xì)菌群落組成及其與宿主互作影響宿主健康的微生態(tài)學(xué)機(jī)制，進(jìn)而篩選潛在的益生菌或致病菌[13-16]。在高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用 PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）2工具能夠進(jìn)一步獲得細(xì)菌群落的功能信息。例如，Zhang等[17]利用PICRUSt2工具對(duì)腸道細(xì)菌群落介導(dǎo)的功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)燦爛弧菌感染刺參（Apostichopus japonicus）時(shí)導(dǎo)致其中腸的代謝功能途徑的相對(duì)豐度顯著高于后腸，而中腸中涉及信號(hào)分子及其相互作用、外源性生物降解和代謝等的功能途徑的相對(duì)豐度則均低于后腸，這進(jìn)一步解釋了刺參腐皮綜合征先發(fā)生于后腸的原因。郁維娜等[18]利用PICRUSt2分析健康和患病凡納濱對(duì)蝦（Litopenarus vannamei）腸道微生物的代謝功能途徑，發(fā)現(xiàn)與健康組相比，患病對(duì)蝦中參與弧菌侵染的過(guò)程顯著增強(qiáng)，而溶酶體和過(guò)氧化物酶等免疫功能代謝過(guò)程顯著減弱，這些功能途徑的豐度變化可能增加了對(duì)蝦患病的風(fēng)險(xiǎn)。因此，通過(guò)PICRUSt2可以很好地解釋細(xì)菌群落與其功能的相關(guān)性，這為闡述牡蠣組織菌群構(gòu)成與菌群功能的相關(guān)性提供了有利工具。

熊本牡蠣（Crassostrea sikamea）、葡萄牙牡蠣（Crassostrea angulata）和長(zhǎng)牡蠣分別是我國(guó)浙江、福建和北方沿海地區(qū)主要養(yǎng)殖的牡蠣品種。然而，目前對(duì)于這3種牡蠣體內(nèi)的微生物組成及是否攜帶潛在病原菌并沒(méi)有全面的認(rèn)識(shí)。此外，這3種牡蠣體內(nèi)的微生物構(gòu)成是否因其宿主遺傳和養(yǎng)殖環(huán)境不同而有差異尚未獲知。鑒于此，本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣不同組織的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，比較分析這3種牡蠣不同組織間的細(xì)菌群落組成特征、多樣性及功能差異。本研究為整體了解熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣組織內(nèi)的細(xì)菌群落構(gòu)成特征以及牡蠣的健康養(yǎng)殖提供了數(shù)據(jù)支持。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

選取健康的二齡雌性熊本牡蠣（記為Cs）、葡萄牙牡蠣（記為Ca）和長(zhǎng)牡蠣（記為Cg）作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。其中，熊本牡蠣采自浙江省寧波市寧?？h西店鎮(zhèn)養(yǎng)殖區(qū)（海水鹽度為 22.7±3.2、水溫為（26.2±2.5）℃、溶解氧濃度為（8.4±0.2）mg/L、pH 為 7.7±0.3）；葡萄牙牡蠣采自福建省漳州市漳浦縣舊鎮(zhèn)鎮(zhèn)養(yǎng)殖區(qū)（海水鹽度為 20.5±3.0、水溫為（21.3±4.1）℃、溶解氧濃度為（8.5±0.5）mg/L、pH 為 7.4±0.2）；長(zhǎng)牡蠣采自山東省青島市即墨區(qū)鰲山衛(wèi)鎮(zhèn)養(yǎng)殖區(qū)（海水鹽度為19.5±3.0、水溫為（20.3±2.1）℃、溶解氧濃度為（8.0±0.5）mg/L、pH為7.5±0.2）。采集的3種牡蠣照片如圖1所示。使用滅菌海水清洗牡蠣外殼，再用酒精進(jìn)行擦拭，接著用解剖刀在絞合部撬開(kāi)小口，沿殼緣切開(kāi)牡蠣兩側(cè)閉殼肌，在無(wú)菌操作條件下使用2 mL注射器從牡蠣圍心腔內(nèi)抽取血淋巴液，置于無(wú)菌離心管中，立即于?80℃保存。接著使用無(wú)菌手術(shù)剪刀取牡蠣的鰓、外套膜、肝胰腺和性腺組織，分別置于無(wú)菌離心管中。每種牡蠣各取6組重復(fù)樣本。采集的組織樣品置于液氮速凍后，于?80℃保存，直至DNA提取。

圖1 本研究采集的長(zhǎng)牡蠣、葡萄牙牡蠣和熊本牡蠣樣品圖片F(xiàn)ig.1 The pictures of Crassostrea gigas, Crassostrea angulata and Crassostrea sikamea collected in this study

2.2 DNA提取

將收集的組織樣本（約500 mg/樣本）分別用勻漿機(jī)勻漿后，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（MOBIO Laboratories, Carlsbad, CA, 美國(guó)）按照操作說(shuō)明書(shū)提取DNA。隨后用NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。DNA置于?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR擴(kuò)增和Illumina高通量測(cè)序

取每個(gè)樣品純化后的40～60 ng gDNA作為PCR擴(kuò)增模板，使用16S rRNA基因引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′）對(duì)細(xì)菌 16S rRNA 的 V3?V4 可變區(qū)作PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）包括Premix Taq TM 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，gDNA 模板 1 μL以及 ddH2O 22 μL。按照如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。每個(gè)樣品重復(fù)3次以減少擴(kuò)增過(guò)程造成的偏差。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR片段純化試劑盒（TaKaRa Biotech，日本）純化，使用 Agilent 2100（Agilent，美國(guó)）生物測(cè)定儀檢測(cè)片段大小。每個(gè)樣品取等量的PCR產(chǎn)物，于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序。

2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

16S rRNA基因原始測(cè)序數(shù)據(jù)以FASTQ文件形式提交到Dix-seq平臺(tái)分析[19]。使用FastQC對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控。利用FLASH軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接[20]，USEARCH法[21]去除嵌合體序列，并利用MOTHUR軟件將相似性大于97%的序列聚類(lèi)成操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units, OTU）。隨后選取豐度和覆蓋度最高的序列作為每個(gè)OTU的代表序列，用PyNAST[22]在Silva123數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)獲得物種注釋?zhuān)瑫r(shí)，利用每個(gè)樣本的相對(duì)豐度對(duì)特征豐度進(jìn)行歸一化。為了提高數(shù)據(jù)的可靠性，序列數(shù)據(jù)分析時(shí)刪除了古菌、葉綠體、不屬于細(xì)菌的序列和僅檢測(cè)到1次的序列。各樣本的α-多樣性指標(biāo)和β-多樣性距離均采用Dix-seq平臺(tái)計(jì)算。

2.5 功能預(yù)測(cè)

PICRUSt2是用來(lái)評(píng)估預(yù)測(cè)細(xì)菌群落功能通路的重要工具。為了獲得細(xì)菌群落功能的特征信息，將每個(gè)OTU的豐度均一化后，利用PICRUSt2分析獲得KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）細(xì)菌群落功能信息，并用熱圖顯示其在不同牡蠣組織間的分布情況。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用韋恩圖比較3種牡蠣相同組織間和同種牡蠣不同組織間細(xì)菌OTU的差異性。使用 SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way Variance Analysis,ANOVA）評(píng)估3種牡蠣相同組織間和同種牡蠣不同組織間細(xì)菌群落α-多樣性和OTU數(shù)的差異。采用基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析（Non-Metric Multidimensional Analysis, NMDS）和相似性分析（Analysis of Similarity, ANOSIM）評(píng)估3種牡蠣整體間及同種牡蠣5種組織間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。在Rv3.6.3軟件中用基于“vegan”包的多元置換方差分析（Permutational Multivariate Analysis of Variance,PERMANOVA）定量評(píng)估牡蠣種類(lèi)和組織類(lèi)型對(duì)細(xì)菌群落變化的影響程度。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌群落組成特征

原始測(cè)序下機(jī)序列經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后共獲得了5 502 202條優(yōu)質(zhì)序列，所得序列經(jīng)細(xì)菌分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后歸為6 020個(gè)OTUs。其中在熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的5種組織中分別鑒定到4 610、4 382和3 915個(gè)OTUs。利用韋恩圖比較3種牡蠣相同組織間及同種牡蠣不同組織間細(xì)菌群落的組成差異。結(jié)果表明，熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣整體間共有細(xì)菌OTU數(shù)為2 554個(gè)（占總OTU數(shù)的42.4%），而對(duì)應(yīng)在3種牡蠣中特有的OTU數(shù)分別占總OTU數(shù)的11.3%、9.8%和7.0%（圖2a）。對(duì)3種牡蠣相同組織中的細(xì)菌進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)5種組織中的細(xì)菌OTU數(shù)存在差異，其中鰓、肝胰腺、外套膜、性腺和血淋巴中的共有OTU數(shù)分別占3種牡蠣對(duì)應(yīng)相同組織總OTU數(shù)的19.8%、11.8%、19.1%、16.3%和20.9%。此外，在熊本牡蠣的肝胰腺中細(xì)菌的特有OTU數(shù)最高，占熊本牡蠣所有組織總OTU數(shù)的21.6%；而在葡萄牙牡蠣的血淋巴中細(xì)菌的特有OTU數(shù)最多，占葡萄牙牡蠣所有組織總OTU數(shù)的12.4%；在長(zhǎng)牡蠣外套膜中細(xì)菌的特有OTU數(shù)最多，占長(zhǎng)牡蠣所有組織總OTU數(shù)的7.2%（圖2b）。這些結(jié)果表明，3種牡蠣整體間及同種牡蠣5種組織間細(xì)菌的OTU數(shù)存在顯著差異（p＜0.05）。

圖2 韋恩圖展示3種牡蠣相同組織間（a）和同種牡蠣不同組織間（b）共有和特有的細(xì)菌OTU數(shù)Fig.2 Venn diagram displaying the numbers of unique and shared OTU among same tissues from three oysters (a) and different tissues from individual oyster (b)

在細(xì)菌（亞）門(mén)水平上，3種牡蠣組織中的優(yōu)勢(shì)菌主要隸屬于 γ-變形菌綱（γ-proteobacteria）、柔壁菌門(mén)（Tenericutes）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes）（圖3a）。其中，γ-變形菌綱在熊本牡蠣外套膜中的豐度（平均相對(duì)豐度為86.0%）顯著高于其他4個(gè)組織，而在葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的血淋巴中豐度最高（平均相對(duì)豐度分別為32.8%和39.0%）。柔壁菌門(mén)在熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的肝胰腺中的豐度顯著高于同種牡蠣中的其他組織，平均相對(duì)豐度分別為25.6%、36.2%和22.4%。厚壁菌門(mén)在熊本牡蠣的鰓、葡萄牙牡蠣的血淋巴和長(zhǎng)牡蠣的肝胰腺中豐度最高，平均相對(duì)豐度分別為14.6%、26.7%和37.7%，顯著高于對(duì)應(yīng)牡蠣的其他組織（p＜0.05）。

在細(xì)菌屬水平上，熊本牡蠣5個(gè)組織中的優(yōu)勢(shì)菌主要隸屬于假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、弧菌屬（Vibrio）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和支原體菌屬（Mycoplasma）；葡萄牙牡蠣5個(gè)組織中的優(yōu)勢(shì)菌主要隸屬于支原體菌屬、嗜冷桿菌屬和弧菌屬；長(zhǎng)牡蠣5個(gè)組織中的優(yōu)勢(shì)菌主要隸屬于支原體菌屬、假交替單胞菌屬、芽胞桿菌屬（Anoxybacillus）和弧菌屬（圖3b）。其中，假交替單胞菌屬在熊本牡蠣的血淋巴中豐度（平均相對(duì)豐度為37.4%）最高，而在其肝胰腺的豐度（平均相對(duì)豐度為0.3%）最低。支原體菌屬在葡萄牙牡蠣的鰓中豐度（平均相對(duì)豐度為36.0%）最高，且顯著高于其他兩種牡蠣的5種組織。芽胞桿菌屬在長(zhǎng)牡蠣的肝胰腺豐度（平均相對(duì)豐度為22.4%）最高，且顯著高于其他兩種牡蠣的5種組織。嗜冷桿菌屬在熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣的血淋巴中豐度（平均相對(duì)豐度分別為17.7%和15.3%）高于對(duì)應(yīng)同種牡蠣的其他4個(gè)組織，但均在3種牡蠣的肝胰腺中豐度最低?；【鷮僭谛鼙灸迪牭啮w、外套膜、性腺和血淋巴中的相對(duì)豐度均顯著高于其在葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的各個(gè)組織中的豐度。其中，對(duì)于熊本牡蠣，弧菌屬在其外套膜中的豐度顯著高于鰓、性腺、肝胰腺和血淋巴中的豐度。就葡萄牙牡蠣來(lái)看，弧菌則是在其血淋巴中的豐度最高，而在長(zhǎng)牡蠣中弧菌則是在其性腺中豐度最高，但均在3種牡蠣的肝胰腺中豐度最低（圖3b）。

圖3 3種牡蠣5種組織中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)（變形菌門(mén)歸類(lèi)到綱）（a）和細(xì)菌屬（b）的平均相對(duì)豐度Fig.3 Average relative abundances of the dominant bacterial phyla (Proteobacteria were assigned to the class level) (a) and genus (b) in the five tissues form three oysters

3.2 細(xì)菌群落多樣性差異

進(jìn)一步比較熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣5種組織中的細(xì)菌群落α-多樣性，多樣性指數(shù)包括Chao1指數(shù)、物種豐富度（Species richness）和香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）。結(jié)果表明，Chao1指數(shù)、物種豐富度指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均隨牡蠣種類(lèi)和組織類(lèi)型的不同而有所差異（圖4）。對(duì)同種牡蠣不同組織的細(xì)菌群落α-多樣性進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)Chao1指數(shù)和物種豐富度指數(shù)在熊本牡蠣的鰓中最高而在血淋巴中最低，在葡萄牙牡蠣的外套膜中最高而在性腺中最低，但在長(zhǎng)牡蠣的鰓中最高而在肝胰腺中最低（圖4a，圖4b）。相反，香農(nóng)指數(shù)在熊本牡蠣的肝胰腺、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的血淋巴中最高，而分別在熊本牡蠣的血淋巴、葡萄牙牡蠣的鰓和長(zhǎng)牡蠣的肝胰腺中最低（圖4c）。對(duì)3種牡蠣的相同組織進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)Chao1指數(shù)和物種豐富度指數(shù)在長(zhǎng)牡蠣肝胰腺中的細(xì)菌群落多樣性顯著低于熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣；香農(nóng)指數(shù)在葡萄牙牡蠣的鰓、性腺和肝胰腺中菌群多樣性低于熊本牡蠣和長(zhǎng)牡蠣，而在熊本牡蠣的血淋巴中細(xì)菌群落多樣性低于葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣（圖4）。這些發(fā)現(xiàn)表明，3種牡蠣的相同組織間除外套膜外，細(xì)菌群落α-多樣性存在不同程度的差異性。

圖4 比較3種牡蠣5種組織中的細(xì)菌群落α-多樣性差異Fig.4 Comparison of bacterial community α-diversity in five tissues from three oysters

3.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異

在細(xì)菌OTU水平上，利用NMDS分析了3種牡蠣5種組織間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，圖中各樣品間的相對(duì)距離能夠反映其菌群的相似程度，距離越近，相似性越高。結(jié)果表明，在不區(qū)分組織的情況下，熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的菌群結(jié)構(gòu)沿NMDS軸1從左至右明顯分離（圖5a，圖5b）；反之，在區(qū)分組織情況下，熊本牡蠣和葡萄牙牡蠣5種組織內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)沿NMDS軸2從下至上明顯分離，而長(zhǎng)牡蠣5種組織內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)沿NMDS軸1分離（圖5c）。這些結(jié)果也進(jìn)一步通過(guò)相似性分析得到證實(shí)，表明3種牡蠣5種組織內(nèi)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)整體存在顯著差異（表1）。其中，熊本牡蠣除了血淋巴、鰓和外套膜樣本之間以及葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣除鰓和性腺樣本之間的差異不顯著外，同種牡蠣的其他組織樣品之間均具有顯著差異（表2）。多元置換方差分析結(jié)果表明，牡蠣種類(lèi)和組織類(lèi)型分別導(dǎo)致細(xì)菌群落發(fā)生25.8%和26.6%的變異（表3）。

表1 基于Bray-Curtis距離比較3種牡蠣不同組織間細(xì)菌群落的整體差異性Table 1 Comparison of overall differences in bacterial communities among different tissues of the three oysters based on Bray-Curtis distance

表2 基于 Bray-Curtis 距離比較同種牡蠣不同組織間細(xì)菌群落的差異性Table 2 Comparison of difference in bacterial communities among different tissues from the same oyster based on Bray-Curtis distance

表3 基于非參數(shù)的多元置換方差分析牡蠣種類(lèi)和組織類(lèi)型對(duì)細(xì)菌群落的定量影響Table 3 Quantitative effects of oyster species and tissue types on the variations in bacterial community based on nonparametric permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA)

圖5 非度量多維尺度分析（NMDS）展示3種牡蠣5種組織間（a）、3種牡蠣整體間（b）和同種牡蠣5種組織間（c）的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異Fig.5 Non-metric multidimensional scaling analysis (NMDS) showed the difference in bacterial community structures among five tissues(a), all tissues of three oysters (b), and five tissues of same oyster (c)

3.4 細(xì)菌群落功能差異

將熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的肝胰腺、鰓和血淋巴中的細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，并將相關(guān)功能途徑的豐度分布特征繪制成熱圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3種牡蠣的鰓、肝胰腺和血淋巴中的菌群功能存在顯著差異（圖6）。其中由細(xì)菌參與的膜轉(zhuǎn)運(yùn)、復(fù)制和修復(fù)、信號(hào)通路、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和消化與吸收等功能途徑在熊本牡蠣的肝胰腺、葡萄牙牡蠣的肝胰腺和鰓、長(zhǎng)牡蠣的血淋巴中豐度顯著高于對(duì)應(yīng)牡蠣的其他組織。此外，參與溶酶體和過(guò)氧化物酶等具有抗菌免疫能力的功能途徑在3種牡蠣的鰓、肝胰腺和血淋巴中均具有一定豐度，而參與碳水化合物消化吸收、胰腺分泌、礦物質(zhì)吸收和蛋白質(zhì)消化吸收等消化過(guò)程以及細(xì)菌性感染疾病的功能過(guò)程在3種牡蠣的血淋巴中豐度顯著高于其他組織（圖6）。這些結(jié)果表明，細(xì)菌介導(dǎo)的功能途徑在3種牡蠣的不同組織中存在差異。

圖6 熱圖展示3種牡蠣的肝胰腺、鰓、血淋巴中細(xì)菌群落功能途徑的豐度（平方根轉(zhuǎn)換）分布Fig.6 Heatmap showing the abundance (sqrt (x) transformed) distribution of functional pathways of bacterial communities in the gill, hepatopancreas, and hemolymph from three oysters

4 討論

共生微生物在宿主生理、營(yíng)養(yǎng)吸收和消化及維持宿主健康等方面具有重要作用[1,3-4]。然而，目前關(guān)于探究牡蠣內(nèi)部整體菌群構(gòu)成特征的研究甚少。本研究首次對(duì)熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣不同組織中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究，分析比較3種牡蠣5種組織間細(xì)菌群落的整體差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣中不同組織的細(xì)菌OTU數(shù)存在顯著差異。類(lèi)似的研究表明，紫貽貝（Mytilus edulis）腸道內(nèi)的核心細(xì)菌OTU數(shù)高于美洲牡蠣腸道內(nèi)的細(xì)菌OTU數(shù)[23]。這些發(fā)現(xiàn)提示牡蠣組織內(nèi)的核心菌群可能因其種類(lèi)不同而有所差異。值得注意是的，這種差異性在不同分類(lèi)水平上的細(xì)菌組成中也較為明顯。例如，本研究發(fā)現(xiàn)熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣組織中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要隸屬于γ-變形菌綱、柔壁菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，但其豐度在對(duì)應(yīng)牡蠣的不同組織間存在顯著差異。前人研究表明，這些細(xì)菌也是縊蟶內(nèi)臟團(tuán)、皺紋盤(pán)鮑腸道和美洲牡蠣鰓中的優(yōu)勢(shì)菌[24-26]。這些發(fā)現(xiàn)表明，γ-變形菌綱、柔壁菌門(mén)和厚壁菌門(mén)可能是在貝類(lèi)中普遍共生的細(xì)菌。進(jìn)一步的研究表明，這些細(xì)菌在水生動(dòng)物的生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2,27]。例如，Semova等[3]發(fā)現(xiàn)厚壁菌（Firmicutes）在細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成中起著重要作用，可以促進(jìn)斑馬魚(yú)腸道吸收脂肪。變形菌能夠降解纖維素和瓊脂，促進(jìn)雙殼貝類(lèi)的消化吸收[28-29]。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬、芽胞桿菌屬、支原體菌屬、嗜冷桿菌屬和弧菌屬是3種牡蠣5種組織內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬，但其豐度在對(duì)應(yīng)牡蠣的不同組織間存在差異。類(lèi)似的研究發(fā)現(xiàn)，假交替單胞菌屬、嗜冷桿菌屬和弧菌屬是蝦夷扇貝（Patinopecten yessoensisis）和巖扇貝（Rock scallop）體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌屬[15,30]。研究表明，假交替單胞菌屬能夠產(chǎn)生多種具有抗菌活性的化合物[31]；芽孢桿菌屬可分泌多種胞外酶，在宿主的食物消化、營(yíng)養(yǎng)代謝和抵御病原菌入侵中起著重要的作用[32]；而支原體菌屬有益于縊蟶（Sinnovacula constricta）的健康生長(zhǎng)[33]。因此，這些富集在牡蠣組織中的優(yōu)勢(shì)菌屬可能在促進(jìn)牡蠣的生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮了積極作用，而其具體的生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

近年來(lái)，由弧菌引起的傳染性疾病給牡蠣的養(yǎng)殖帶來(lái)了嚴(yán)重的危害[34]?；【鷱V泛存在于海洋環(huán)境中，是一種條件致病菌，且極易引起貝類(lèi)感染弧菌病[35-38]，嚴(yán)重影響貝類(lèi)的健康生長(zhǎng)，而攜帶弧菌病原體的牡蠣還可能進(jìn)一步影響人體的健康[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，與葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣相比，弧菌在熊本牡蠣的組織中豐度最高，這提示熊本牡蠣可能在養(yǎng)殖過(guò)程中由弧菌引發(fā)的疾病風(fēng)險(xiǎn)更高。值得注意的是，弧菌在肝胰腺組織中的豐度顯著低于其他組織，這與肝胰腺微生物參與疾病感染的功能途徑豐度較低是一致的。然而，在環(huán)境適宜時(shí)，弧菌會(huì)成為優(yōu)勢(shì)菌，尤其是在夏季高溫季節(jié)，極易造成牡蠣死亡[34]。因此，在牡蠣組織中富集較高豐度的弧菌可能對(duì)其后期的養(yǎng)殖起著不容忽視的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，這3種牡蠣組織間的細(xì)菌群落多樣性隨著組織不同而存在差異。這可能歸因于牡蠣體內(nèi)微生物間的相互競(jìng)爭(zhēng)。類(lèi)似的研究發(fā)現(xiàn)，美洲牡蠣的外套膜、鰓和腸道中細(xì)菌群落多樣性具有高度多樣化特征[25]。細(xì)菌群落多樣性有助于維持宿主內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1-2]，高的細(xì)菌群落多樣性可能是維持宿主健康生長(zhǎng)的重要指標(biāo)。也就是說(shuō)，細(xì)菌群落多樣性與宿主的健康狀態(tài)正相關(guān)[1]。這樣看來(lái)，在熊本牡蠣中鰓存在高的菌群多樣性可能對(duì)其健康有一定的指示作用。此外，細(xì)菌群落多樣性在葡萄牙牡蠣的外套膜中較高，而在長(zhǎng)牡蠣的5種組織間也存在不同的變化。這些發(fā)現(xiàn)表明，熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣組織內(nèi)的細(xì)菌群落多樣性存在顯著差異。類(lèi)似的研究也發(fā)現(xiàn)，同一養(yǎng)殖環(huán)境下的美洲牡蠣和紫貽貝間的菌群多樣性存在明顯不同[23]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣整體組織間存在顯著差異，且同種牡蠣的5種組織間也存在不同程度的差異性。已有研究表明，同一親本孵育的牡蠣苗放在不同的養(yǎng)殖環(huán)境中生長(zhǎng)，其體內(nèi)的細(xì)菌群落構(gòu)成會(huì)隨著宿主生長(zhǎng)差異越來(lái)越明顯[40]，類(lèi)似的結(jié)果也在海參腸道微生物研究中被發(fā)現(xiàn)[41]，這表明養(yǎng)殖環(huán)境可能是影響細(xì)菌群落構(gòu)成的原因。Fernández 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在同一養(yǎng)殖環(huán)境下的長(zhǎng)牡蠣和美洲牡蠣體內(nèi)的細(xì)菌群落也存在差異，這表明宿主遺傳也可能是影響細(xì)菌群落構(gòu)成的原因。值得注意的是，本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是3種不同的牡蠣，且分別采自3個(gè)不同的省份，其養(yǎng)殖水質(zhì)存在一定的差異。特別是牡蠣長(zhǎng)期生活在海水環(huán)境中，水體中的微生物可能會(huì)影響牡蠣體內(nèi)的微生物構(gòu)成[7]。由此看來(lái)，宿主遺傳和養(yǎng)殖環(huán)境可能是導(dǎo)致3種牡蠣組織內(nèi)細(xì)菌群落構(gòu)成差異的原因，但其各自對(duì)菌群的貢獻(xiàn)程度仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

共生微生物在宿主中執(zhí)行著不同的功能，而宿主內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡可能影響微生物的功能潛力，進(jìn)而影響宿主的健康狀況[17-18]。鑒于此，本研究進(jìn)一步比較了熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣不同組織的細(xì)菌群落功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參與氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、碳水化合物代謝以及消化和吸收的功能途徑均在牡蠣的肝胰腺中豐度較高。肝胰腺是牡蠣重要的消化器官[43]，較高豐度的功能途徑表明微生物可能在牡蠣的營(yíng)養(yǎng)吸收方面起著重要作用。此外，溶酶體和過(guò)氧化物酶等具有抗菌免疫能力的功能途徑在熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣的鰓、肝胰腺和血淋巴中具有一定豐度。這些發(fā)現(xiàn)表明，在抵抗外界菌群的入侵時(shí)，牡蠣的各種組織共同協(xié)助，從而維持宿主體內(nèi)穩(wěn)定的微生態(tài)環(huán)境。值得注意的是，細(xì)菌性感染疾病主要在牡蠣的血淋巴中富集，這提示血淋巴中的微生物可能在宿主的免疫防御中起著重要作用[1,4]。綜上所述，3種牡蠣不同組織中的微生物可以影響其不同功能，在維持牡蠣生長(zhǎng)、抗菌和營(yíng)養(yǎng)吸收等方面起著關(guān)鍵的作用。

5 結(jié)論

熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣5種組織中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)整體存在顯著差異，而細(xì)菌群落α-多樣性和群落組成在同種牡蠣的5種組織間和3種牡蠣相同組織間也存在不同程度的差異性，這些發(fā)現(xiàn)提示宿主遺傳和養(yǎng)殖環(huán)境可能是導(dǎo)致3種牡蠣組織內(nèi)菌群構(gòu)成差異的主要原因，但哪個(gè)是決定性因素還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。假交替單胞菌屬、芽胞桿菌屬和支原體菌屬在3種牡蠣組織中的豐度分布情況與其對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能相一致，可能作為益生菌促進(jìn)牡蠣健康生長(zhǎng)。值得注意的是，弧菌屬在3種牡蠣5種組織中存在不同程度的豐度分布，特別是在熊本牡蠣外套膜、葡萄牙牡蠣血淋巴和長(zhǎng)牡蠣性腺中豐度分布最高，可能作為潛在病原菌影響后期牡蠣生長(zhǎng)。然而，由于目前16S注釋數(shù)據(jù)庫(kù)信息有限，無(wú)法獲得細(xì)菌種水平上的分類(lèi)信息，因此不能確定哪些弧菌菌株以及這些弧菌屬中是否存在人的潛在致病菌，建議在今后的研究中利用宏基因組手段進(jìn)一步明確3種牡蠣組織中弧菌屬在種水平上的構(gòu)成特征及其基因功能組成。在熊本牡蠣肝胰腺、葡萄牙牡蠣鰓和長(zhǎng)牡蠣血淋巴中由菌群介導(dǎo)的代謝功能途徑如氨基酸、碳水化合物和脂質(zhì)的代謝等豐度顯著高于對(duì)應(yīng)牡蠣的其他組織，提示微生物在促進(jìn)宿主營(yíng)養(yǎng)吸收方面發(fā)揮著重要作用且具有一定的組織特異性。特別是參與細(xì)菌性感染疾病過(guò)程的功能通路主要在3種牡蠣的血淋巴中富集，表明微生物可能在宿主的免疫防御中起著重要作用。本研究豐富了我們對(duì)熊本牡蠣、葡萄牙牡蠣和長(zhǎng)牡蠣組織內(nèi)細(xì)菌群落構(gòu)成特征的認(rèn)識(shí)，這也為利用微生物調(diào)控牡蠣生長(zhǎng)，促進(jìn)牡蠣的健康養(yǎng)殖提供了理論基礎(chǔ)。