微流控技術(shù)在機械工程-生命科學(xué)交叉領(lǐng)域的應(yīng)用

滿 佳 華澤升 夏 荷 李建勇 李方義 李劍峰

1.山東大學(xué)機械工程學(xué)院，高效潔凈機械制造教育部重點實驗室，濟南，250061 2.山東大學(xué)機械工程國家級實驗教學(xué)示范中心，濟南，250061

0 引言

生命科學(xué)涉及生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、生物工程制造等多個領(lǐng)域，伴隨著微流控技術(shù)的出現(xiàn)，相關(guān)學(xué)科蓬勃發(fā)展，以現(xiàn)代生物技術(shù)為基礎(chǔ)的生命科學(xué)也迅速進步，取得了諸多重大成就。

機械工程是涵蓋了多個自然學(xué)科和技術(shù)學(xué)科的工程學(xué)科。通過結(jié)合生產(chǎn)實踐中的經(jīng)驗，人們研發(fā)了各種不同的機械系統(tǒng)，解決了理論與實踐相脫離的問題。微流控(microfluidics)是在微機電加工技術(shù)(MEMS)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，是指在微尺度空間內(nèi)操控流體的一種技術(shù)，該技術(shù)可以將化學(xué)、生物等實驗室的基本功能微縮到一個幾平方厘米的芯片上，因此又被稱為芯片實驗室(Lab-on-a-chip)[1]。作為機械、生物、化學(xué)、材料等學(xué)科交叉領(lǐng)域研究的技術(shù)平臺，微流控技術(shù)具有傳統(tǒng)研究方法不可替代的優(yōu)勢，它把樣品反應(yīng)、制備、分離、檢測等生化實驗的基本操作集成到很小的芯片上，試劑消耗量小、檢測成本低、靈敏度高、效率高[2]。近年來，隨著微流控器件和制備工藝的發(fā)展，微流控技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的交叉應(yīng)用越來越廣泛。

本文主要闡述了微流控技術(shù)的工作原理及其近年來在機械工程-生命科學(xué)交叉領(lǐng)域國內(nèi)外研究成果，梳理了其在生命科學(xué)領(lǐng)域的交叉應(yīng)用現(xiàn)狀，主要從生物檢測、體外結(jié)構(gòu)仿生制造及可控釋放的藥物載體制備三方面展開介紹，最后對其應(yīng)用前景進行展望。

1 微流控技術(shù)的概述

20世紀90年代瑞士科學(xué)家MANZ等[3]最早提出了微流控的概念，將微機電與化學(xué)分析相結(jié)合，即微全分析系統(tǒng)(micro total analysis system，μTAS)，拉開了微流控技術(shù)發(fā)展的序幕。微流控是多學(xué)科融合的新興科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，與傳統(tǒng)機械制造技術(shù)相比，它是一場理論方法和制造技術(shù)的革命。微流控技術(shù)在生命科學(xué)上的交叉應(yīng)用是通過微流控芯片實現(xiàn)的，微流控芯片是通過設(shè)計和加工一定結(jié)構(gòu)的微通道，然后在微通道內(nèi)對液體進行操控和分析的平臺。微流控芯片的材料及制備工藝是提升芯片性能及功能的關(guān)鍵。

1.1 微流控芯片制備材料

微流控芯片的制備材料主要有硅質(zhì)材料、高聚物材料、陶瓷材料以及新興的紙基材料等，其中，硅質(zhì)材料主要包括硅、玻璃、石英等，來源廣泛。硅[4]具有良好化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性，是早期微流控芯片的主要材料，缺點是電絕緣性、透光性較差。近幾年，玻璃[5]和石英[6]由于透光性和電滲性良好、耐腐蝕等特點而逐步取代硅。高聚物材料主要指聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)[7]。PDMS是當前應(yīng)用最廣泛的芯片材料之一，具有良好的透光性和透氣性[8]。陶瓷材料，例如氧化鋁基[9]等適用于制造具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)微流控器件。新提出的紙基材料[10]由于具有良好的生物相容性，且成本低廉，主要用于生物檢測領(lǐng)域。

1.2 微流控芯片制備工藝

微流控芯片可通過多種機械加工工藝制備得到，包括：微銑削、微光刻、蝕刻法、激光燒灼法、LIGA法、軟光刻及3D打印等。微銑削[11]是利用微銑刀對基底表面進行加工的方法，具有極高的加工精度，適用于結(jié)構(gòu)多變且具有階梯深度的微凹槽結(jié)構(gòu)加工，如圖1所示。微光刻是利用光膠、掩膜、紫外光來進行微制造，包括薄膜沉淀、光刻、刻蝕三個工序。薄膜沉積[12]是通過氧化、沉積等方法將軟材料覆蓋在基片表面形成薄膜，薄膜作為犧牲層；光刻和蝕刻過程是將掩膜通過曝光成像轉(zhuǎn)移到薄膜上并在基底上加工特定微結(jié)構(gòu)的工藝。與微光刻法相似，蝕刻法[13]主要有薄膜沉淀、光刻、刻蝕三個工序，不同之處是刻蝕過程采用腐蝕性液體進行處理。硅質(zhì)材料一般采用光刻和蝕刻方法加工。激光燒灼法[14]是將紫外激光作用在可光解聚合物上，使其發(fā)生激光濺射，通過控制濺射位置，可得到具有特定結(jié)構(gòu)的微芯片。該方法能制備具有大深寬比的芯片，但加工效率低且成本高。LIGA技術(shù)是基于X射線光刻的微機電加工技術(shù)[15]，包括X光深層光刻、微電鑄和微復(fù)制三個工藝步驟，適合加工具有高深寬比的芯片，因而能夠制備復(fù)雜的圖形結(jié)構(gòu)，精度高，缺點是成本較高且無法加工曲面。軟光刻法[16-17]是20世紀90年代末出現(xiàn)的制備方法，大多數(shù)PDMS微流控芯片是用該方法制備的，其工藝特點在于利用軟材料制作出微通道陽模，然后通過圖案復(fù)制制備出微流控芯片，該方法能夠制作出具有復(fù)雜三維微通道結(jié)構(gòu)的芯片，并能在不同化學(xué)性質(zhì)表面上應(yīng)用，應(yīng)用范圍更廣。圖2所示為利用軟光刻法制備微流控芯片工藝流程。3D打印法[18]是近年來新興的微流控芯片制備工藝，與傳統(tǒng)制備方法相比，3D打印法不僅有更高的分辨率，還能夠制備特殊的多孔結(jié)構(gòu)。

圖1 微銑削法制備微流控芯片[11]

圖2 軟光刻法制備PDMS芯片[17]

2 微流控技術(shù)在生命科學(xué)中的交叉應(yīng)用

近年來，隨著微機電加工技術(shù)的不斷進步，以微流控芯片為核心的微尺度制造技術(shù)取得了長足的發(fā)展，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[19]。

2.1 微流控技術(shù)在生物檢測方面的應(yīng)用

生物檢測是一種用于檢測目標生物分子(蛋白質(zhì)、酶、抗體、核酸等)的技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)、醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測及食品安全等領(lǐng)域。與傳統(tǒng)化學(xué)檢測相比，微流控技術(shù)在減少樣品使用劑量、實現(xiàn)高通量和高效檢測方面有顯著優(yōu)勢。

2.1.1DNA分析和測序

微流控技術(shù)由于其特殊的功能，在疾病檢測方面有廣闊的應(yīng)用前景。在應(yīng)對新型冠狀病毒過程中，人們意識到快速檢測在病毒性傳染病的預(yù)防和控制過程中所發(fā)揮的重要作用。目前病毒DNA的檢測方法有傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR[20]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(LAMP)[21]等技術(shù)。由于DNA濃度很低，在檢測前需要對DNA進行擴增，再用熒光或者化學(xué)發(fā)光方法檢測。傳統(tǒng)的檢測方法所需的試劑量較多，檢測靈敏度相對較低，為此，研究人員將微流控技術(shù)與上述檢測技術(shù)相結(jié)合，對DNA分析和測序進行了大量研究。

微液滴數(shù)字PCR(dd PCR)[22]是基于液滴微流控的數(shù)字PCR技術(shù)，與其他PCR技術(shù)相比，具有更高的分辨率和檢測靈敏度，是一種單分子水平的核酸定量分析技術(shù)。利用微流控芯片將待測樣品制備成微米尺度的液滴，微液滴中只含有待測樣品的單分子DNA，然后對微液滴中的DNA進行PCR擴增反應(yīng)，完成DNA熒光標記[22]，最后通過微液滴分析儀進行熒光信號檢測，有熒光信號的表示存在初始DNA分子，沒有熒光信號的意味著沒有初始DNA分子，這樣就能夠得到待測樣品中的DNA數(shù)目。ZHU等[23]采用“準共聚焦”方法來構(gòu)建微液滴檢測儀的光路，如圖3所示。由于激發(fā)光路中的激發(fā)光斑與微液滴的尺寸相匹配，因而能夠最大限度地激發(fā)整個微液滴內(nèi)的熒光信號，提高微液滴之間的信號對比度。該方法的相對誤差小于5%，線性度r2>0.998，解決了微液滴檢測過程中的假陽性問題，實現(xiàn)了高精準檢測。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于北京新弈生物科技有限公司開發(fā)的新羿TD-1 數(shù)字 PCR 平臺，在生物醫(yī)學(xué)的基因檢測、微生物檢測等方面應(yīng)用廣闊。

圖3 “準共聚焦”液滴檢測裝置[23]

LAMP法是由NOTOMI等[24]提出的。首先，DNA模板在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下，恒溫(60～65 ℃)培養(yǎng)15～60 min，實現(xiàn)109～1010倍的核酸擴增，擴增過程中產(chǎn)生的白色渾濁可作為擴增結(jié)果的觀察依據(jù)。FANG等[25]開發(fā)了一種基于LAMP技術(shù)的即時檢測細菌的微流控芯片。該芯片由DNA釋放腔室、多網(wǎng)路的LAMP放大腔室以及兩腔室之間的螺桿閥和虹吸閥構(gòu)成，如圖4所示。通過在DNA釋放腔室內(nèi)設(shè)置高溫，使DNA快速釋放并溶于緩沖液中，然后通過開啟螺桿閥控制芯片內(nèi)部的蒸汽壓力進而將DNA溶液輸送到放大室，在LAMP放大室內(nèi)可實現(xiàn)DNA指數(shù)級的擴增。檢測結(jié)果可以通過肉眼直接觀察，簡便快捷，可應(yīng)用于核酸快速檢測領(lǐng)域[25]。近期，博奧生物集團聯(lián)合清華大學(xué)、四川大學(xué)華西醫(yī)院共同開發(fā)了包括新冠病毒在內(nèi)的六項呼吸道病毒核酸檢驗試劑盒，該試劑盒是基于LAMP的微流控擴增技術(shù)研發(fā)的，目前已獲得CE-IVD認證，為新冠疫情防控工作提供了強有力的高效檢測工具[26]。

圖4 多網(wǎng)絡(luò)LAMP擴增芯片的結(jié)構(gòu)示意圖[25]

DNA測序[27]包括樣品分離、放大、擴增、提純、電泳分析五個步驟。MADSEN等[28]設(shè)計了一種可定向測序的微流控芯片，它能將單個樣品細胞的DNA直接轉(zhuǎn)化為堿基序列，通過后續(xù)放大、擴增、電泳分析完成DNA樣品的測序，分析時間可減少一個數(shù)量級，且準確率在99%以上。

2.1.2蛋白質(zhì)分析

DNA僅僅是遺傳信息的載體，在DNA水平上難以獲知其表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)的組成和活動規(guī)律，在此背景下誕生了研究細胞中蛋白質(zhì)組成和活動規(guī)律的蛋白質(zhì)組學(xué)?；谖⒘骺丶夹g(shù)的蛋白質(zhì)芯片使用幾微升甚至幾納升的蛋白質(zhì)溶液便可以將特定蛋白質(zhì)從細胞中分離出來并進行相應(yīng)的檢測，高效且試劑消耗少。

CHIKKAVEERAIAH等[29]基于PDMS芯片制造了用于癌癥蛋白質(zhì)生物標記物多重檢測的微流體分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括微量注射泵和PDMS通道發(fā)生裝置，在微通道下方裝有電極微陣列以及對稱放置的參照電極和對比電極(圖5)。這種微流體電化學(xué)分析系統(tǒng)利用酶標記的1 μm超順磁性抗體生物結(jié)合物顆粒離線捕獲分析物，然后通過測量電極捕獲抗體，能夠有效檢測前列腺特異性抗原(PSA)血清中的白細胞介素水平。

圖5 8電極陣列的微流控電化學(xué)分析設(shè)備[29]

徐波[30]搭建了一套基于二維電泳分離的微流控?zé)晒鈾z測系統(tǒng)，對常見的20種標準氨基酸進行了定量分析，如圖6所示。該系統(tǒng)在進樣和分離切換上引入雙電動閥系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)電勢分配，使樣品在電滲流的驅(qū)動下交替進入樣品廢物收集通道和分離通道，基于該方法檢測的氨基酸線性相關(guān)數(shù)大于0.99，系統(tǒng)的線性范圍超過常規(guī)方法 3個數(shù)量級[30]。

(a)蛋白質(zhì)芯片微通道結(jié)構(gòu)示意圖

2.1.3免疫分析

基于微流控芯片的免疫分析具有擴散距離小、空間比表面積大的優(yōu)勢，解決了傳統(tǒng)免疫分析方法效率低、操作繁瑣、分析時間長、試劑消耗大的問題。

HERRMANN等[31]設(shè)計了一種在截流條件下實現(xiàn)平行酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)的微流控檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)由8個獨立的微通道組成，用于在相同的實驗條件下實現(xiàn)并行檢測，如圖7所示。該系統(tǒng)在PDMS微通道內(nèi)通入了順磁性微珠，磁珠既用作固相，以支持反應(yīng)性免疫復(fù)合物的形成，又可在通道內(nèi)部實現(xiàn)磁混合。

圖7 平行ELISA微流控檢測芯片[31]

COSTANTINI等[32]開發(fā)了將微流控芯片和非晶硅光敏傳感器結(jié)合的ELISA裝置，該裝置由PDMS芯片、玻璃基底、光敏陣列片、非晶硅光電傳感器等組成，如圖8所示。裝置基于GPs抗體和辣根過氧化物酶Ig-HRP標記的二次抗體進行免疫分析，二次抗體攜帶的HRP酶能催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，而非晶硅光敏傳感器能檢測光強并轉(zhuǎn)換成電信號，通過電信號強弱便可篩選出特異性抗體，目前該系統(tǒng)已能夠?qū)崿F(xiàn)對腹腔疾病的診斷。

圖8 微流控芯片和非晶硅光敏傳感器結(jié)合的ELISA裝置示意圖[32]

微流控技術(shù)檢測精度高、用時少、操作方便、可靠性高，在臨床診斷、藥物分析等基礎(chǔ)研究領(lǐng)域都可能大有作為，但不同的檢測目標往往需要選擇不同結(jié)構(gòu)及尺寸的微流控芯片，普適性較差。如果該問題得不到有效解決，生物檢測芯片的應(yīng)用范圍將大受影響。

2.2 微流控技術(shù)在體外仿生制造的應(yīng)用

2.2.1微流控技術(shù)在細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

細胞是生物結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，細胞不是單獨存在的，只有通過細胞間的相互作用，才能維持和協(xié)調(diào)生物體內(nèi)有序的生命活動，因此研究細胞結(jié)構(gòu)及其生物行為對探索生命的奧秘具有深遠意義。細胞在人體內(nèi)處于復(fù)雜的微環(huán)境中，傳統(tǒng)的研究分析方法難以模擬細胞所處的微環(huán)境，而且細胞樣品量小、體系復(fù)雜、價格昂貴等使廣大科研工作者望而卻步。與傳統(tǒng)方法相比，微流控細胞培養(yǎng)技術(shù)有獨特的優(yōu)勢，如芯片通道尺寸與細胞大小相適應(yīng)、可操縱少數(shù)或單個細胞等。因此，細胞培養(yǎng)芯片能夠模擬細胞所受的細胞外基質(zhì)以及細胞間的相互作用，從而精確研究細胞的生理狀態(tài)，在藥物研發(fā)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。

根據(jù)培養(yǎng)方式的不同，微流控細胞培養(yǎng)主要分為二維細胞培養(yǎng)[33]和三維細胞培養(yǎng)[34]。二維細胞培養(yǎng)與傳統(tǒng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)方式較為相似，細胞懸浮液流經(jīng)微流控芯片后，細胞貼附在微通道內(nèi)壁上，培養(yǎng)基或者其他溶液從細胞上方經(jīng)過，以靜態(tài)方式為細胞提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)[35]，該方式操作簡單，易于觀察，但所得到的數(shù)據(jù)往往是細胞群體的平均值，不能充分反映細胞個體的差異性。三維細胞培養(yǎng)是將細胞培養(yǎng)在利用生物相容性材料構(gòu)建的三維微流控系統(tǒng)中，細胞可以對外部環(huán)境和刺激做出反應(yīng)。與二維培養(yǎng)相比，三維微流控系統(tǒng)能夠最大程度地模擬體內(nèi)細胞生長環(huán)境，不僅可以促進細胞聚集和組織形成，還可以促進細胞增殖、分化、遷移等生物行為[35]。

LEI等[36]研制了一種三維灌流細胞培養(yǎng)微流控芯片，該芯片由灌注層、培養(yǎng)層、電極層組成，如圖9所示。在該研究中，人類口腔癌細胞(OEC-M1)被包裹在三維瓊脂糖支架中，并在培養(yǎng)室中進行灌流培養(yǎng)。在培養(yǎng)室的側(cè)壁埋入一對垂直電極進行現(xiàn)場阻抗測量，平行的垂直電極可產(chǎn)生均勻的電場，使得封裝在不同位置的細胞可以得到相同的電場，通過阻抗變化可監(jiān)測細胞增殖情況，并可以對不同濃度抗癌藥物灌流下的細胞活力進行實時阻抗監(jiān)測。研究表明，阻抗大小與細胞活力直接相關(guān)，通過阻抗測量實現(xiàn)了細胞增殖狀況和化學(xué)敏感性的實時監(jiān)測，在癌癥藥物研發(fā)方向有巨大的潛力。

(a)微流控芯片設(shè)計 (b)微流控芯片實物

ZHAO等[37]提出了一種基于液滴的三維細胞培養(yǎng)方法來培養(yǎng)人肝癌細胞，如圖10所示。將液滴陣列貼附在PDMS片的側(cè)壁上，不僅避免了細胞貼附在芯片表面，實現(xiàn)了三維細胞培養(yǎng)，而且還利于對液滴內(nèi)的細胞執(zhí)行多種操作，包括細胞懸液液滴生成，藥物治療及細胞染色等。

圖10 三維液滴細胞培養(yǎng)分析過程及芯片結(jié)構(gòu)[37]

LI等[38]基于3D打印、微流控芯片技術(shù)和共培養(yǎng)技術(shù)，開發(fā)了一種新的體外藥物篩選微流控芯片3DPF。在該研究中，微流控芯片由兩個微通道和通道之間的單排微結(jié)構(gòu)組成(圖11)。A通道用于血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)和給藥，B通道用于肝癌細胞培養(yǎng)，利用A通道和B通道之間的單排微結(jié)構(gòu)進行物質(zhì)傳遞，從而實現(xiàn)細胞培養(yǎng)。在美妥珠單抗的藥效學(xué)測試中，發(fā)現(xiàn)3DPF模型對藥物濃度更敏感，該模型不僅為美妥珠單抗的開發(fā)提供了參考，將來還可用于評估各種藥物的毒性。

(a)芯片內(nèi)部結(jié)構(gòu)

2.2.2微流控技術(shù)在組織工程中的應(yīng)用

在人體微環(huán)境中，組織是由細胞和細胞間質(zhì)組成的，隨著細胞共培養(yǎng)研究的不斷進步，組織工程引發(fā)了越來越多的關(guān)注和研究。組織工程通過模擬生物體內(nèi)微環(huán)境來構(gòu)建生物系統(tǒng)，為醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的研究提供了更好的平臺。微流控技術(shù)具有集成化程度高、結(jié)構(gòu)多樣化的特點，可以精確操縱細胞與細胞外微環(huán)境?；谖⒘骺丶夹g(shù)的組織工程通過精確控制系統(tǒng)中的化學(xué)梯度、流體應(yīng)力和細胞生態(tài)位，能夠有效適應(yīng)組織結(jié)構(gòu)的形貌變化，且具備良好的功能穩(wěn)定性，是制備組織工程結(jié)構(gòu)和研究組織相互作用的有利手段。

現(xiàn)有的微流控組織工程的實現(xiàn)大多是采用灌流培養(yǎng)的方式。微流控灌注培養(yǎng)系統(tǒng)通過各層“紙芯片”的疊加和拆分，結(jié)合微通道主動灌流與芯片間的被動擴散，實現(xiàn)芯片內(nèi)基質(zhì)與外界物質(zhì)相互交換?！凹埿酒奔夹g(shù)是MARTINEZ等[39]提出的，即在微流控芯片中引入具有良好通透性和生物相容性的薄膜材料[40]。組織工程芯片利用微通道網(wǎng)絡(luò)將不同的細胞培養(yǎng)單元串聯(lián)，同時結(jié)合灌流培養(yǎng)的方式，精確模擬了三維組織培養(yǎng)微環(huán)境，實現(xiàn)了從細胞到組織的轉(zhuǎn)換。

SHAO等[41]提出了組織/血管同軸3D打印方法，實現(xiàn)了血管和組織同步制造。該方法利用同軸針頭將預(yù)凝膠化的甲基丙烯酸化凝膠(GelMA)墨水(載有組織細胞)和預(yù)凝膠化明膠墨水(載有內(nèi)皮細胞)同時擠出，明膠墨水在打印時形成復(fù)雜的流道網(wǎng)絡(luò)，與此同時，內(nèi)皮細胞黏附在流道內(nèi)壁進行血管化，兩者相互結(jié)合進而生成血管化組織，如圖12所示。通過該方法，能夠打印大塊組織結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了骨組織的體外長時間培養(yǎng)。

(a)同軸生物3D打印 (b)GelMA永久光交聯(lián) (c)凝膠溶解和細胞自增殖

2.2.3微流控技術(shù)在器官芯片中的應(yīng)用

在生命科學(xué)的研究領(lǐng)域中，基于微流控器件的器官芯片作為一種新型的體外器官模型，近年來得到了廣泛的研究。微流控芯片可以精確地模擬體外培養(yǎng)微環(huán)境，維持細胞功能和形態(tài)，彌補了傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)模式難以實現(xiàn)人體組織器官復(fù)雜生理功能的局限，解決了動物實驗周期長、成本高、難以預(yù)測人體對各種藥物響應(yīng)的問題，為研究人類的生理學(xué)和病理學(xué)提供了很好的技術(shù)手段[42]。到目前為止，肺、肝、心臟等各種器官功能已在微流控器官芯片上成功實現(xiàn)。

肺芯片是最著名的器官芯片，HUH[43]設(shè)計了雙層夾膜結(jié)構(gòu)的肺器官芯片，芯片由上下兩層PDMS框架和中間層的PDMS多孔膜組成，在PDMS膜上下兩側(cè)分別培養(yǎng)上皮細胞和內(nèi)皮細胞，同時，在芯片兩側(cè)腔室連接周期性工作的氣泵，通過兩側(cè)腔室的規(guī)律性抽吸帶動細胞產(chǎn)生周期性形變，模擬肺非真空/真空的循環(huán)狀態(tài)，實現(xiàn)細胞的動態(tài)培養(yǎng)，如圖13所示。

圖13 仿生肺芯片模擬呼氣和吸氣過程[43]

肝臟是與藥物代謝相關(guān)的主要靶器官，因此在制備新藥過程中準確預(yù)測肝臟的代謝能力和毒性至關(guān)重要。HE等[44]利用PDMS構(gòu)建了類肝臟血管結(jié)構(gòu)的微流控器官芯片，然后將含有肝細胞的水凝膠注入芯片微通道中，以形成肝小葉樣結(jié)構(gòu)；同時用蠕動泵連續(xù)灌注來模擬人體內(nèi)血液流動，達到模擬肝臟代謝功能的效果。

在仿生心臟研究方面，F(xiàn)U等[45]開發(fā)了具有微生理可視化功能的“心臟芯片”，該芯片能夠進行可視化和定量分析，這是傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)和動物實驗無法實現(xiàn)的。芯片由基底和表面具有微槽的反蛋白石結(jié)構(gòu)水凝膠彈性薄膜組成。心臟的搏動過程伴隨著細胞的伸長和收縮，使得水凝膠膜內(nèi)部晶格中衍射平面間距改變，進而改變了水凝膠膜結(jié)構(gòu)色，實現(xiàn)了心肌細胞的力學(xué)傳感檢測，如圖14所示。

(a)仿生心臟芯片構(gòu)建過程

由于人體代謝環(huán)境的復(fù)雜性，器官芯片的應(yīng)用仍然存在一定的局限性，如單器官芯片無法全面反映機體器官功能的復(fù)雜性、多變性和完整性。為適應(yīng)人體結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，多器官微流控芯片系統(tǒng)應(yīng)運而生。MASCHMEYER等[46]提出了四器官芯片，這種芯片包括腸道、肝臟、腎臟、皮膚四個器官以及提供血液循環(huán)和排泄循環(huán)的微泵，芯片結(jié)構(gòu)如圖15所示。研究發(fā)現(xiàn)，細胞在芯片內(nèi)具有較高的活性并能夠自發(fā)形成功能化的結(jié)構(gòu)。多器官芯片將不同器官細胞在芯片上進行共培養(yǎng)，能夠模擬不同器官之間的相互作用，在毒性檢測和代謝評估方面具有顯著優(yōu)勢。

圖15 多器官微流控芯片設(shè)計示意圖[46]

微流控技術(shù)強大的細胞操控以及精確的微環(huán)境調(diào)控能力使其成為體外仿生制造研究中的重要手段，但體外仿生制造的發(fā)展與應(yīng)用仍存在細胞來源少、可利用材料種類少等問題亟待解決。在未來發(fā)展中，在組織-器官水平上模擬仿生環(huán)境，對促進不同器官細胞之間的相互作用和藥物風(fēng)險評估研究意義重大。

2.3 微流控技術(shù)在藥物載體制備中的應(yīng)用

由上文可知，微流控技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)體外結(jié)構(gòu)仿生制造，可應(yīng)用于生物制造研究，除此之外該技術(shù)還可以用于體內(nèi)給藥，通過微流控芯片高效地封裝藥物，實現(xiàn)藥物的控釋和緩釋。在傳統(tǒng)的給藥方式中，藥物在體內(nèi)釋放后，會造成血藥濃度迅速升高，隨著體內(nèi)代謝，血藥濃度又迅速降低，這樣的過程容易產(chǎn)生毒副作用，降低療效。而藥物的緩釋與控釋能夠減少用藥次數(shù)，穩(wěn)定血藥濃度，提高藥物利用率。微流控技術(shù)可以制備粒徑均一、結(jié)構(gòu)可控、可緩慢釋放藥物的微球，為藥物傳遞和釋放建立了一個強有力的平臺，近年來引起許多研究人員的關(guān)注。

形成載藥微球的微通道類型包括三種基本結(jié)構(gòu)：同向結(jié)構(gòu)[47]、微流匯聚結(jié)構(gòu)[47]及T型結(jié)構(gòu)[48]。通過組合不同類型的通道結(jié)構(gòu)，可以形成用于制備多種復(fù)合結(jié)構(gòu)微液滴的微流控芯片[49-52]，如圖16所示。雖然微流控芯片的形式和結(jié)構(gòu)多種多樣，但其乳化機理十分相似，即分散相流在連續(xù)相的作用下被打破，形成單分散液滴。

(a)同向結(jié)構(gòu)單乳化芯片[47] (b)微流匯聚型單乳化芯片[47]

2.3.1核殼結(jié)構(gòu)的載藥微球

在微流控通道中，利用連續(xù)相和分散相互不相溶的特性，可形成水包油包水以及油包水包油或者更加復(fù)雜的液滴結(jié)構(gòu)，液滴經(jīng)熱固化、光固化等手段后便可得到相應(yīng)的固體顆粒。殼層或內(nèi)核能夠包裹生物分子、藥物或其他生物相容性物質(zhì)，由不同材料制備得到的微球其性質(zhì)也不同。

LI等[53]以油溶性藥物作為內(nèi)相，以含有溫敏性材料聚N-異丙基丙烯酰胺微凝膠(PNIPAm)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)的納米四氧化三鐵混合液為外相，利用同向型雙乳化微流控芯片制備得到藥物為核、聚合物為殼的核殼結(jié)構(gòu)載藥微球，如圖17a所示。當氧化鐵納米顆粒被遠程觸發(fā)的感應(yīng)熱場加熱時，熱敏性的PNIPAm 殼收縮，同時形成微/納米空隙和通道，內(nèi)核油相藥物得到釋放；取消感應(yīng)加熱時，該微球又恢復(fù)到初始狀態(tài)，停止藥物釋放過程，實現(xiàn)了藥物的可控釋放，如圖17b所示。

(a)微流控技術(shù)制備核殼微球原理示意圖

由于人體內(nèi)不同的位置具有不同的pH環(huán)境，如胃的酸性環(huán)境和腸、結(jié)腸的堿性環(huán)境，pH響應(yīng)微球有靶向給藥的潛力。LIU等[54]將阿托伐他汀(AVA)和塞來昔布(CEL)作為模型藥物，以含有AVA藥物的有機溶液為分散相，以含有CEL藥物的水溶液作為連續(xù)相，利用微流匯聚型微流控芯片制備出負載兩種藥物的復(fù)合微球，實現(xiàn)了不同pH條件下AVA藥物的多級釋放，如圖18所示。該微球在pH值為1.2～5.5時保持結(jié)構(gòu)完整性，而在pH值為6.0～6.5時部分溶解，2小時內(nèi)釋放出50%的藥物；pH值6.5以上時微球會完全坍塌，在半小時內(nèi)便會釋放出所有藥物。由于該微球能在酸性條件下保護藥物，在堿性條件下逐漸釋放，因而是胃腸道靶向釋放藥物的優(yōu)良載體。

圖18 微流控技術(shù)制備載有阿托伐他汀(AVA)和塞來昔布(CEL)的核殼結(jié)構(gòu)微球[54]

LI等[55]將親水性藥物鹽酸阿霉素溶解在光敏材料GelMA中，將疏水性藥物喜樹堿溶解在聚乙丙交脂(PLGA)溶液中，通過改變內(nèi)外相液體的流速得到雙乳化液滴；在紫外燈的照射下，內(nèi)核固化，使內(nèi)核鹽酸阿霉素藥物得到良好封裝，從而制備了載藥凝膠為核，PLGA為殼的核殼結(jié)構(gòu)微球，如圖19所示。該微球?qū)崿F(xiàn)了親水性藥物和疏水性藥物的同時封裝，且核殼材料均為生物可降解性的，隨著殼核材料的降解，藥物逐漸釋放。進一步研究表明，將肝癌細胞和藥物同時封裝在該微球中，能夠顯著降低肝癌細胞存活率，提高治療效果，這些特性表明了該微球作為藥物傳遞系統(tǒng)的潛在價值。

(a)用于生成核殼結(jié)構(gòu)微球的毛細管微流控芯片示意圖

2.3.2多孔結(jié)構(gòu)的載藥微球

利用微流控技術(shù)制備的多孔微球具有大的比表面積和孔體積，藥物可吸附在多孔微球的表面或進入微球內(nèi)部，通過調(diào)整孔結(jié)構(gòu)可實現(xiàn)藥物緩慢釋放[56]。此外，多孔微球還具有載藥量大、釋藥速率可調(diào)等優(yōu)點，因此廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

ZHANG等[57]受到豆腐形成機理的啟發(fā)，通過微流控芯片制備了大豆蛋白多孔微球。該方法以鹵水為內(nèi)相，以豆?jié){為中相，大豆油為外相，將中相管道與加熱板集成，通過合理調(diào)控內(nèi)、中、外三相的流速形成大豆蛋白微球，將微球凍干可形成多孔結(jié)構(gòu)，如圖20所示。由于大豆蛋白多孔微球有良好的生物相容性，抗癌藥物能夠被有效封裝在微球中，因此在藥物載體方面有良好的應(yīng)用前景。

圖20 微流控技術(shù)制備大豆蛋白多孔微球[57]

AMOYAV等[58]首先將含碳酸氫銨的水溶液加入到PLGA的有機溶液中，均質(zhì)化后得到油包水初乳液，再以該初乳液為分散相，以聚乙烯醇(PVA)溶液為連續(xù)相，利用單乳化微流控芯片制備了尺寸均一的微球。隨著有機相溶劑蒸發(fā)，碳酸氫銨分解產(chǎn)生二氧化碳和氨氣，微球表面形成了多孔結(jié)構(gòu)，如圖21所示。體外釋放研究表明，與非多孔顆粒相比，多孔微球的高比表面積能夠增強分子擴散，從而加速微球降解和藥物釋放。

圖21 PLGA多孔微球制備示意圖[58]

2.3.3各向異性結(jié)構(gòu)的載藥微球

各向異性顆粒是指在同一個顆粒中具有非對稱的形狀或不均勻的性質(zhì)，與其他類型顆粒的理化性質(zhì)不同，各向異性粒子在生物醫(yī)用材料、固體表面活性劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。各向異性顆粒主要分為Janus型顆粒[59]、Patchy型顆粒和多組分顆粒，其中，最常見的是Janus顆粒。Janus顆粒是指在同一個顆粒上有兩個不同性質(zhì)的部分，并且具有非中心對稱結(jié)構(gòu)。液滴微流控技術(shù)可以制備結(jié)構(gòu)可控的單分散顆粒，是制備Janus粒子的重要手段。

SUN等[60]設(shè)計了一種流動聚焦微流控芯片，將PLGA和氫化椰油甘油酯溶解在二氯甲烷中作為分散相，PVA溶液作為連續(xù)相，生成水包油液滴，通過溶劑蒸發(fā)誘導(dǎo)相分離，使液滴固化形成Janus微球。如圖22所示，每個微球都有PLGA和脂質(zhì)材料兩個腔室，通過調(diào)節(jié)兩個腔室的比例，微球結(jié)構(gòu)也可靈活地改變?yōu)槠瑺?、三層、四層或核殼式。所選擇的脂質(zhì)材料在生理溫度下會從固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)，使藥物快速釋放；而PLGA腔室會緩慢降解，從而實現(xiàn)了藥物快速和持續(xù)釋放的結(jié)合。WANG等[61]利用微流控芯片中流體為層流的特點成功地制備了具有pH響應(yīng)特性的PAA-ETPTA Janus微球。通過調(diào)節(jié)流速比和表面活性劑在連續(xù)油相中的濃度，可以調(diào)節(jié)微球結(jié)構(gòu)和形貌。在不同pH條件下，包封的羅丹明B染料和PS納米顆粒的裝載率和釋放率不同，緩釋率隨pH值的增加而增大，且得到的Janus微球具有較高的穩(wěn)定性。

圖22 制備Janus微球的芯片結(jié)構(gòu)示意圖[60]

相對于傳統(tǒng)的藥物載體制備方法，微流控技術(shù)不僅可以構(gòu)建各種結(jié)構(gòu)的微球，還能封裝不同性質(zhì)的藥物，豐富和拓展了微球的應(yīng)用領(lǐng)域。然而，該制備技術(shù)存在制備效率較低、難以大批量化生產(chǎn)的缺點。如何提高載藥微球的制備效率、實現(xiàn)高效率的批量生產(chǎn)是未來可控釋放的藥物載體制備研究的主要方向。

3 總結(jié)與展望

微流控技術(shù)由于具備優(yōu)異的微尺度界面調(diào)控性能，近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。本文以微流控技術(shù)為研究對象，從生物檢測、體外結(jié)構(gòu)仿生制造及可控釋放的藥物載體制備三方面介紹了微流控技術(shù)在機械工程-生命科學(xué)交叉領(lǐng)域的研究成果及應(yīng)用現(xiàn)狀。微流控技術(shù)能夠減少樣品使用劑量、實現(xiàn)高通量和高效檢測，而且能夠體外培養(yǎng)細胞、模擬人體組織和器官功能以及制備載藥微顆粒，為藥物和疫苗研發(fā)、生物安全性評估等生物醫(yī)學(xué)研究提供了新的研究思路。

目前微流控技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的交叉應(yīng)用仍存在諸多挑戰(zhàn)，主要來自于以下幾個方面：首先是芯片的加工，超精密的微流控芯片加工難度大、成本極高，專用加工設(shè)備種類少，因此開發(fā)面向微流控芯片的加工設(shè)備依然任重而道遠；其次，在生命科學(xué)過程中既要構(gòu)建個體化外形和可控內(nèi)部結(jié)構(gòu)，還需形成與人體組織器官相匹配的生物力學(xué)性能，同時保證材料表面或內(nèi)部的信息傳遞等。伴隨著先進制造技術(shù)的不斷革新，未來微流控技術(shù)會朝向智能化、集成自動化發(fā)展。

(1)智能化：將人工智能與微流控技術(shù)相結(jié)合，通過環(huán)境感知，實現(xiàn)智能動態(tài)監(jiān)測，可有效提高生物檢測過程的質(zhì)量和效率。

(2)集成自動化：探究新材料、新工藝，開發(fā)各類模塊化單元，將模塊化的功能單元與控制系統(tǒng)集成于一體，進而實現(xiàn)自動化操作。

相信在不久的將來，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以微流控技術(shù)為核心的微機電系統(tǒng)技術(shù)將不斷革新，更加廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。