長(zhǎng)鏈非編碼RNA-kcnq1重疊轉(zhuǎn)錄物1通過(guò)負(fù)性調(diào)控miR-19a表達(dá)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能影響實(shí)驗(yàn)研究

張 媛，馬 媛，魯 楊，劉穎燕，周露秋，劉 芳

(1.樂(lè)山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 樂(lè)山 614000；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710038)

子癇前期(Preeclampsia，PE)是以高血壓、蛋白尿等多系統(tǒng)器官功能紊亂為主要表現(xiàn)的全身性疾病，是妊娠期導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及胎兒不良結(jié)局的常見(jiàn)疾病[1]，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究提示PE為多種因素共同導(dǎo)致的疾病[2]，其中，螺旋動(dòng)脈重鑄不足而導(dǎo)致的胎盤(pán)功能障礙是該疾病的主要病因?qū)W說(shuō)；胎盤(pán)源性因素作用于全身系統(tǒng)，引發(fā)的包括血管內(nèi)皮功能障礙、炎性反應(yīng)激活等一系列病理表現(xiàn)可能為PE發(fā)生的潛在機(jī)制。相關(guān)研究[3-4]表明，非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)等在PE患者胎盤(pán)組織中差異性表達(dá)，這些ncRNA能夠通過(guò)交互調(diào)控，影響下游靶基因，在調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞功能、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄等過(guò)程中發(fā)揮作用，從而參與PE發(fā)病。定位人類(lèi)染色體11p15.5 位置的lncRNA-kcnq1重疊轉(zhuǎn)錄物1(lncRNA-kcnq1ot1)被發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展、心肌缺血再灌注等領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮重要作用[5-6]。其中，lncRNA-kcnq1ot1在PE患者胎盤(pán)組織中低表達(dá)，并能夠間接影響滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[7]。此外，lncRNA-kcnq1ot1能夠直接參與脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[8]，提示其具有對(duì)上皮類(lèi)細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能。在人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞模型中，lncRNA-kcnq1ot1能夠負(fù)性調(diào)控miR-19a，通過(guò)發(fā)揮內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA (competing endogenous RNA,ceRNA)作用[9]。而miR-19a與PE具有相關(guān)性已得到驗(yàn)證[10]。因此，進(jìn)一步明確lncRNA-kcnq1ot1與PE的相關(guān)程度，及其能否通過(guò)對(duì)miR-19a發(fā)揮相關(guān)作用，影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)功能參與PE疾病發(fā)病過(guò)程，值得探究。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2019年10月至2020年8月在樂(lè)山市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科住院行剖宮產(chǎn)分娩的15例PE晚孕患者(PE組)，診斷標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格依據(jù)第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[8]，該組患者除PE外無(wú)其他妊娠期合并癥，孕周(38.1±1.1)周，年齡(29.1±4.3)歲，體重指數(shù)(Body Mass Index，BMI)(26±1.9)kg/m2。同時(shí)收集同期住院分娩的正常孕婦15例作為對(duì)照組，該組患者無(wú)妊娠期合并癥，孕周(38.4±1.2)周，年齡(28.4±4.6)歲，BMI(26.1±2.3)kg/m2。兩組孕婦均為單胎初產(chǎn)婦，入院前均未接受任何治療，既往無(wú)遺傳性、傳染性疾及代謝性疾病病史；無(wú)慢性病藥物使用、放射線及毒物接觸史，無(wú)家族性遺傳病史。兩組孕婦孕周、年齡、BMI比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員同意并批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要細(xì)胞、試劑和材料 HUVEC購(gòu)自ATCC中國(guó)細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素(美國(guó)Gibco公司)；F12K培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(武漢普諾賽科技有限公司)；Prime Script RT Reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit(日本Takara公司)；Lipofectamine 2000(美國(guó)Thermo Fisher公司)；pcDNA3.1-kcnq1ot1、siRNA-kcnq1ot1質(zhì)粒(廣州吉賽生物科技股份有限公司)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；PCR引物序列(中國(guó)擎科生物有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(中國(guó)碧云天公司)；CDKN2B、Cyclin D1、β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；PVDF膜(美國(guó)Millipore公司)；ECL底物液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清及胎盤(pán)標(biāo)本收集：入院后在接受藥物及手術(shù)治療前，分次采集、收集納入的兩組患者晨起空腹肘靜脈血共計(jì)5 ml。所有血漿樣本均在采集后置促凝管中，4 ℃靜置過(guò)夜后2000 r/min離心5 min，吸取上層血清至EP管中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。于胎盤(pán)娩出后迅速收集兩組患者胎盤(pán)組織標(biāo)本，取1 cm×1 cm×1 cm大小組織若干塊，PBS液中迅速漂洗后，置入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：將HUVEC取出后解凍，接種于含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，用RPMI 1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞量，均勻的接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜；待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%左右時(shí)按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)要求行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：過(guò)表達(dá)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-kcnq1ot1)、抑制組(轉(zhuǎn)染siRNA-kcnq1ot1)、對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染組)。轉(zhuǎn)染48 h 后qRT-PCR檢測(cè)三組HUVEC中miR-19a表達(dá)情況。

1.3.3 lncRNA- kcnq1ot1及miR-19a mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：轉(zhuǎn)染48 h 后，Trizol法分別提取血清標(biāo)本、胎盤(pán)組織中以及三組HUVEC細(xì)胞中總RNA；檢測(cè)RNA質(zhì)量后，按照Prime Script RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、15 s，40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)。每次檢測(cè)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)3次。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，使用 2-△△Ct法計(jì)算目的基因lncRNA- kcnq1ot1、miR-19a mRNA水平的表達(dá)情況。

表1 目的基因引物序列

1.3.4 CDKN2B、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平檢測(cè)：轉(zhuǎn)染48 h后，RIPA裂解液分別提取三組HUVEC中總蛋白；檢測(cè)蛋白濃度后，Western blot檢測(cè)外泌體特征性蛋白：配膠后十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；將目的條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜；一抗4 ℃孵育過(guò)夜[抗體濃度CDKN2B 1∶1500、Cyclin D1 1∶1000、β-actin(內(nèi)參)1∶500]；HRP標(biāo)記二抗(1∶10000)室溫孵育2 h；ECL顯影、定影，Band Scan分析膠片灰度值。

1.3.5 HUVEC成管能力檢測(cè)：轉(zhuǎn)染48 h后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC，用F12K培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按每孔2×105個(gè)細(xì)胞量，接種到6孔板中，37 ℃、5% CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜；實(shí)驗(yàn)分組同1.3.2中細(xì)胞分組。培養(yǎng)48 h后，使用0.25%胰酶消化HUVEC，用無(wú)血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，按照每孔1×105/個(gè)細(xì)胞，均勻的接種到預(yù)鋪有基質(zhì)膠的24孔板中，37 ℃、5% CO2過(guò)夜培養(yǎng)；培養(yǎng)8～12 h后拍照觀察，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清、胎盤(pán)組織中l(wèi)ncRNA-kcnq1ot1及HUVEC中miR-19a mRNA表達(dá)水平比較 qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組孕婦血清及胎盤(pán)組織中l(wèi)ncRNA-kcnq1ot1表達(dá)水平相比，PE組孕婦血清及胎盤(pán)組織中l(wèi)ncRNA-kcnq1ot1的表達(dá)降低(均P<0.05)，見(jiàn)表2。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組HUVEC中miR-19a在mRNA水平表達(dá)降低，而抑制組HUVEC細(xì)胞中miR-19a在mRNA水平表達(dá)增高(均P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 兩組血清、胎盤(pán)組織lncRNA-kcnq1ot1mRNA表達(dá)水平比較

表3 各組HUVEC中miR-19a mRNA表達(dá)水平比較

2.2 各組HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1在蛋白水平表達(dá)增高，而抑制組HUVEC細(xì)胞中CDKN2B、Cyclin D1在蛋白水平表達(dá)降低(均P<0.05)，見(jiàn)圖1(表4)。

圖1 各組HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1蛋白表達(dá)情況

表4 各組HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較

2.3 管樣形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HUVEC功能 管樣形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組HUVEC的管腔形成能力，包括總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)均增高(均P<0.05)，抑制組HUVEC的管腔形成能力，包括總分支長(zhǎng)度及管腔數(shù)均降低(均P<0.05)，見(jiàn)表5(圖2)。

圖2 各組HUVEC管形成能力(×200)

表5 各組HUVEC中管形成能力情況

3 討 論

PE是導(dǎo)致母胎死亡的重要因素之一[1,10]。在臨床中發(fā)現(xiàn)，PE患者一旦胎盤(pán)娩出，其癥狀即可緩解或消失[11-12]，提示胎盤(pán)功能異常與PE發(fā)病的直接相關(guān)性。而正常的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能則在胎盤(pán)建立以及螺旋動(dòng)脈重塑等過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用，如存在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，會(huì)成為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、PE等疾病的直接誘因[13]。

lncRNA-miRNA構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)能夠參與多種病理生理過(guò)程[14-15]，已經(jīng)在PE病因研究領(lǐng)域中得到了明確[16-17]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常孕婦相比，lncRNA-kcnq1ot1在PE患者血清及胎盤(pán)組織中均表達(dá)降低，提示從局部胎盤(pán)組織到母體全身循環(huán)系統(tǒng)，lncRNA-kcnq1ot1均存在差異性表達(dá)，lncRNA-kcnq1ot1可能與胎盤(pán)功能障礙、血管內(nèi)皮損傷等PE相關(guān)的病理過(guò)程存在相關(guān)性。我們?cè)赑E胎盤(pán)中發(fā)現(xiàn)的lncRNA-kcnq1ot1表達(dá)趨勢(shì)與陳芳榮等[7]文章中報(bào)道一致。lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平以及表觀遺傳層面均可發(fā)揮生理作用，但是卻無(wú)法直接編碼功能性蛋白，其大多通過(guò)發(fā)揮ceRNA等作用方式調(diào)控miRNA從而實(shí)現(xiàn)其功用[18]。張妮紅等[9]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)lncRNA-kcnq1ot1能夠下調(diào)miR-19a水平，并進(jìn)一步在人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞中驗(yàn)證了上述兩者間的負(fù)向調(diào)控關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)抑制lncRNA-kcnq1ot1的條件下，高表達(dá)的miR-19a能夠通過(guò)抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3表達(dá)，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在HUVEC中過(guò)表達(dá)與抑制lncRNA-kcnq1ot1后，miR-19a的表達(dá)也呈現(xiàn)出被負(fù)性調(diào)控的趨勢(shì)。這與張妮紅等[9]的發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致。

既往研究發(fā)現(xiàn)miR-19a在PE患者胎盤(pán)組織[11]血清中均高表達(dá)[19]，并可在人絨毛癌細(xì)胞中靶向調(diào)控人類(lèi)白細(xì)胞抗原G( Human leukocyte antigen G，HLA-G) 參與PE發(fā)病。此外，在不同的細(xì)胞或組織平臺(tái)中，miR-19a還被驗(yàn)證和CDKN2B[18]、Cyclin D1[19]也具有靶向結(jié)合關(guān)系，與血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移功能、血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)能力等相關(guān)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)抑制lncRNA-kcnq1ot1表達(dá)后，miR-19a表達(dá)增高，并且HUVEC的管腔形成能力降低；且HUVEC中CDKN2B、Cyclin D1在蛋白水平也呈現(xiàn)低表達(dá)。相關(guān)研究表明，miR-19a過(guò)表達(dá)時(shí)，由于CDKN2B的作用，能夠減輕miR-19a對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的抑制[19]，這一過(guò)程與CDKN2B調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶2、9的表達(dá)相關(guān)。Cyclin D1作為細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶的調(diào)節(jié)性因子，主要在細(xì)胞增殖功能中發(fā)揮重要作用；而相關(guān)研究[20]已發(fā)現(xiàn)Cyclin D1與miR-19a間具有負(fù)性調(diào)控關(guān)系，過(guò)表達(dá)miR-19a會(huì)引起Cyclin D1表達(dá)降低，抑制HUVEC增殖能力。通過(guò)上述研究提示：PE時(shí)，低表達(dá)的lncRNA-kcnq1ot1可能通過(guò)對(duì)miR-19a發(fā)揮ceRNA樣作用，進(jìn)一步影響了miR-19a靶基因CDKN2B、Cyclin D1的表達(dá)，誘發(fā)HUVEC功能異常；一方面導(dǎo)致了螺旋動(dòng)脈重鑄障礙、胎盤(pán)形成異常，而另一方面，母體血液中低表達(dá)的lncRNA-kcnq1ot1也可能加重了PE時(shí)母體血管內(nèi)皮損傷及全身炎性反應(yīng)的進(jìn)展。但是，上述過(guò)程涉及的具體機(jī)制還需在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探索。

綜上，lncRNA-kcnq1ot1在PE患者胎盤(pán)組織、血清中具有一致的低表達(dá)趨勢(shì)，明確了其與PE的相關(guān)性；lncRNA-kcnq1ot1可能通過(guò)負(fù)性調(diào)控miR-19a從而抑制HUVEC成管能力，參與PE發(fā)病過(guò)程。本研究，為進(jìn)一步探討ncRNA在PE發(fā)病過(guò)程中的具體作用方式、以及ncRNA能否具有成為PE疾病標(biāo)志物的潛力等方面提供了一定理論依據(jù)。