大鼠腦外傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞及血清中相關(guān)蛋白隨時(shí)間表達(dá)變化研究

史文哲，羅文哲，宋漢君，李國良，王星凱，蔡 玉，盛延良

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 黑龍江省微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯154000；2.濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濰坊 261000)

彌漫性腦損傷(Diffuse brain injury，DBI)是一種閉合性腦外傷，是由交通事故、機(jī)械性暴力、摔跌及體育活動(dòng)所引起的突發(fā)性創(chuàng)傷，其致殘率及致死率均較高。隨著法治觀念的進(jìn)步，人們的維權(quán)意識(shí)也在不斷增強(qiáng)，加之腦組織自身結(jié)構(gòu)及功能的復(fù)雜性，使得腦損傷的治療一直以來都是臨床中的重點(diǎn)及難點(diǎn)問題[1]。DBI可造成即時(shí)性損傷和隨后病理生理過程中的延遲性損傷[2]。即時(shí)性損傷包括神經(jīng)元、彌漫性軸索損傷、血管破裂等，繼而發(fā)生廣泛的神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙介導(dǎo)的繼發(fā)性損傷[3]。星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocytes，AS)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中含量豐富，近期基于神經(jīng)退行性疾病的研究，有學(xué)者提出幼稚星形膠質(zhì)細(xì)胞在受到刺激后也會(huì)分化為不同表型，即神經(jīng)毒性反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(A1s)和神經(jīng)保護(hù)性反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞(A2s)[4-5],并確定了各自的特異性標(biāo)記物，即一種名為C3的補(bǔ)體成分(使用C3裂解產(chǎn)物C3d抗體標(biāo)記)和S100A10[5]。兩種不同分型的星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)表達(dá)，并發(fā)揮不同的作用。既有破壞性作用又有修復(fù)作用，這一概念取決于疾病的時(shí)間進(jìn)程[6]。明確其在損傷后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的表達(dá)變化，以期為法醫(yī)學(xué)中腦損傷的時(shí)間推斷及臨床治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 小鼠抗GFAP單克隆抗體(K200067),兔抗C3d多克隆抗體(430A-74-RUO),兔抗C3d多克隆抗體(K109325P),TritonX-100、驢正常非免疫血清(SL034),Cy3標(biāo)記的驢抗兔IgG，DAPI，抗熒光衰減封片劑(S2100),FITC標(biāo)記的驢抗小鼠IgG(D110081),大鼠神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)ELISA試劑盒，大鼠C3d ELISA試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制作 健康SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄鼠48只，8周齡，體重(250±20)g，購自佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(Control組)和DBI后4、8、12 h及1、3、5、7 d組(n=6)。采用改良的Marmarou方法[7]制造大鼠DBI模型，使打擊頭對(duì)準(zhǔn)大鼠兩耳與兩眼水平連線的中點(diǎn)。待大鼠稍清醒時(shí)(有刺痛反應(yīng))，使用500 g砝碼自1 m高度從透明PVC管中自由落體落下。Control組除麻醉外，不作任何處理。采用Longa評(píng)分法[8]評(píng)定動(dòng)物神經(jīng)功能缺損程度，模型建立后選取評(píng)分2～3分(共4分)的中型腦損傷大鼠進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。操作完成后清潔消毒籠具并做好標(biāo)識(shí)，及時(shí)觀察、記錄動(dòng)物的生命體征變化。此過程中因不符合Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)或各種原因造成的動(dòng)物死亡，均按照原標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充。

1.3 動(dòng)物組織取材 在預(yù)先設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行麻醉，取心血置于促凝管后，斷頭取腦；所有大鼠處死取出全腦后一分為二，一半迅速取海馬組織于凍存管中，置于-80 ℃冰箱備用；另一半置于10 %中性甲醛中固定約48 h，用于HE及免疫熒光染色。促凝管放置1 h后，經(jīng)1000 g離心10 min，取上清液分裝，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.4 免疫熒光雙重染色 GFAP/C3d、GFAP/S100A10進(jìn)行免疫熒光雙重染色，觀察海馬 GFAP+、C3d+、S100A10+細(xì)胞表達(dá)變化。以GFAP+C3d+雙陽性細(xì)胞代表A1s,以GFAP+S100A10+雙陽性細(xì)胞代表A2s。腦組織切片經(jīng)脫蠟水化、微波熱修復(fù)、1%TritonX-100透膜后，用10%驢血清封閉，隨后滴加相應(yīng)一抗，稀釋濃度如下：GFAP(1∶300)、C3d(1∶100)、S100A10(1∶200)，GFAP/C3d、GFAP/S100A10混勻后分別滴加于切片，4 ℃孵育過夜。次日取出濕盒恢復(fù)至室溫后，滴加FITC(1∶200)與Cy3(1∶300)混勻液，與暗盒中室溫孵育1 h，用DAPI染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色。用防淬滅封片劑封片，最后指甲油封固，置于熒光顯微鏡下觀察。以抗體稀釋液代替一抗作為空白對(duì)照。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 將血清從-80 ℃冰箱中取出，解凍回溫。將試劑盒從-4 ℃冰箱中取出，靜置30 min。此期間將20倍濃縮洗滌液稀釋20倍備用。根據(jù)操作步驟稀釋原倍標(biāo)準(zhǔn)品，加樣：分別設(shè)置空白對(duì)照孔(不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余步驟相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上準(zhǔn)確加標(biāo)準(zhǔn)品50 μl(樣品稀釋度為5倍)。溫育及洗滌、加酶(空白孔除外)，再次溫育洗滌后，37 ℃避光顯色15 min后終止反應(yīng)，此時(shí)液體由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色。終止后立即進(jìn)行測(cè)定，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測(cè)量各孔吸光度(OD值)。測(cè)量并計(jì)算結(jié)果：每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，使用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程r≥0.9900，將樣品OD值代入方程式計(jì)算樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)5，即得到樣品實(shí)際濃度。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 實(shí)驗(yàn)組大鼠可見頭皮下、帽狀腱膜下出血，顱腦未見骨折，大腦實(shí)質(zhì)表面可見蛛網(wǎng)膜下腔、腦組織腹側(cè)面少量出血，腦組織腫脹充血，未見局灶性腦挫傷及挫裂傷。Control組大鼠未見明顯異常。

2.2 HE染色 選取丘腦中1/3切面做連續(xù)切片、HE染色，分別觀察Control組及實(shí)驗(yàn)組各分組大鼠腦皮層及深部腦組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果示：Control組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞層次清晰，海馬區(qū)錐體細(xì)胞規(guī)則排列，胞體呈圓形或錐形分布，胞核淡藍(lán)染色，未見水腫及壞死的神經(jīng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組大鼠與Control組大鼠相比，腦組織出現(xiàn)不同程度損傷，大腦、小腦、腦干可見局部蛛網(wǎng)膜下腔出血，蛛網(wǎng)膜下腔散在分布大量紅細(xì)胞，并伴有少量炎細(xì)胞反應(yīng)及纖維蛋白滲出，部分伴有局灶性淺表性腦挫傷，側(cè)腦室、腦室內(nèi)脈絡(luò)叢也可見出血并伴少量炎細(xì)胞浸潤。部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在大腦皮質(zhì)、皮質(zhì)下腦白質(zhì)、腦干、小腦及近海馬回區(qū)腦實(shí)質(zhì)內(nèi)可見散在性分布的點(diǎn)、灶狀腦挫傷出血，挫傷灶周圍伴炎性細(xì)胞反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增多，并可見噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象和衛(wèi)星現(xiàn)象。挫傷灶及海馬周圍還可見不同程度神經(jīng)元變性，并可見不同程度神經(jīng)細(xì)胞壞死，錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，排列疏松，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞周圍間隙增寬，并可見蛋白水腫液。以上結(jié)果表明，大鼠腦組織損傷后具有DBI特征，且DBI后12 h海馬回區(qū)神經(jīng)元變性開始明顯，以1 d左右最為顯著，細(xì)胞核固縮深染，胞漿嗜酸性增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)胞膜破裂、細(xì)胞解體消失，細(xì)胞、小血管周圍間隙顯著增大，DBI后3 d組神經(jīng)元壞死減輕，水腫減輕，7 d時(shí)逐漸恢復(fù)。

2.3 各組腦組織中A1s、A2s細(xì)胞表達(dá)比較 分別以GFAP+C3d+/GFAP+、GFAP+S100A10+/GFAP+陽性細(xì)胞率代表A1s、A2s的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果提示，與Control組相比，A1s 在DBI 4 h后表達(dá)增多，此后呈上升趨勢(shì)，1 d左右達(dá)高峰，隨后下降；正常大鼠腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞大部分以A2s形式存在，DBI后4 h表達(dá)減少，1 d左右其表達(dá)最低，隨后逐漸升高，各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 大鼠海馬組織中A1s、A2s細(xì)胞表達(dá)比較(%)

2.4 ELISA實(shí)驗(yàn) ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中GFAP、C3d蛋白濃度，結(jié)果示：DBI后4 h，兩者濃度均升高，此后呈上升趨勢(shì)，于DBI后1 d表達(dá)呈現(xiàn)高峰，后逐漸下降，7 d時(shí)濃度仍明顯高于Control組；而S100A10在DBI 4 h后也呈上升趨勢(shì)，3 d左右達(dá)高峰，后逐漸下降，DBI后7 d仍高于Control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 大鼠DBI后血清中GFAP、C3d、S100A10濃度比較

3 討 論

GFAP為星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，有學(xué)者提出，敲除GFAP基因或抑制其相關(guān)信號(hào)可促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生。并通過實(shí)驗(yàn)證明，缺乏GFAP和波形蛋白的小鼠發(fā)育正常，且在腦外傷后神經(jīng)發(fā)生和軸突均增多[9]。盡管GFAP對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和在急性應(yīng)激情況下是必不可少的，這可能是由于GFAP基因缺失時(shí)，未定位的神經(jīng)前體細(xì)胞的分化向神經(jīng)元分化方向傾斜的緣故。最近，李炳譞等[10]通過免疫熒光技術(shù)觀測(cè)了A1s在大鼠腦挫傷模型中的表達(dá)，并分析了其表達(dá)時(shí)間及樹突的數(shù)目、長度及復(fù)雜程度等形態(tài)學(xué)變化，該實(shí)驗(yàn)表明A1s在腦挫傷后3 d開始出現(xiàn)，7 d達(dá)高峰，隨后逐漸下降；何芳等[11]應(yīng)用免疫組化法觀測(cè)大鼠重型腦挫傷模型，傷后1 h GFAP+細(xì)胞表達(dá)增加，至傷后7 d達(dá)高峰；吳茂旺等[12]通過對(duì)大鼠DBI模型的研究發(fā)現(xiàn)，GFAP于傷后6 h開始增加，隨時(shí)間進(jìn)展GFAP+細(xì)胞數(shù)量增加、范圍擴(kuò)大，4 d左右達(dá)高峰；本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，DBI后4 h，大鼠海馬區(qū)域GFAP+細(xì)胞數(shù)量開始增加，1 d后達(dá)高峰，此后呈下降趨勢(shì)。ELISA實(shí)驗(yàn)表明，血清中GFAP表達(dá)趨勢(shì)與免疫熒光相同。之所以出現(xiàn)上述時(shí)間表達(dá)的差異，可能是由于損傷模型、損傷程度及實(shí)驗(yàn)觀察區(qū)域選取的不同所致。

早期的一些關(guān)于人類、動(dòng)物模型的研究表明，A1s是阿爾茲海默病、多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)退行性疾病中主要的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型[5]，考慮到上述原因，我們選取8周齡大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，避免大鼠年齡產(chǎn)生的影響。后期有實(shí)驗(yàn)證明A1s在頭部創(chuàng)傷中起重要作用[13]。研究顯示，在創(chuàng)傷性腦損傷患者中，神經(jīng)毒性補(bǔ)體蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體中表達(dá)增多，這些補(bǔ)體蛋白會(huì)導(dǎo)致突觸和神經(jīng)元損傷[14]。重要的是，CNS損傷后A1s可被迅速誘導(dǎo)產(chǎn)生，并使得CNS的神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞迅速死亡。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在疾病或損傷后被激活，分化為A1s、A2s兩種表型，近期有通過缺血性脊髓損傷模型證明，給予適當(dāng)?shù)闹委煾深A(yù)，可以使星形膠質(zhì)細(xì)胞由A1s轉(zhuǎn)化為A2s，從而有利于損傷的修復(fù)。然而，本實(shí)驗(yàn)通過通過C3d+/GFAP+和S100A10+/GFAP+免疫熒光雙重染色對(duì)A1s、A2s的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，A1s、A2s均呈單峰表達(dá)模式，且趨勢(shì)相反，在致傷后1 d左右表達(dá)分別達(dá)到峰值和谷值。表明在腦組織損傷前期，A1s占據(jù)主要優(yōu)勢(shì)，對(duì)顱腦損傷后炎癥起到一定促進(jìn)作用，從而使損傷程度加重。在損傷后1 d左右，兩者達(dá)到各自峰值，此后A2s又表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，而A1s降低，此后A2s則占據(jù)優(yōu)勢(shì)，在抗炎和損傷修復(fù)方面起到一定作用，因此，根據(jù)以上可大致對(duì)損傷時(shí)間做出推斷，當(dāng)表達(dá)數(shù)量A1s>A2s時(shí)，損傷時(shí)間在1 d內(nèi)，當(dāng)A1s

而血清中的含量與海馬組織中趨勢(shì)則不同，DBI 4 h后呈上升趨勢(shì)，3 d左右達(dá)高峰，后逐漸下降，DBI后7 d仍高于Control組。這可能是由于，S100A10在星形膠質(zhì)細(xì)胞中含量較高，DBI后S100A10通過受損的血腦屏障或通過腦脊液循環(huán)入血，使得血液中S100A10濃度升高。目前已經(jīng)在多種疾病，如癌癥、精神疾病和神經(jīng)變性等，均發(fā)現(xiàn)S100A10表達(dá)異常，并通過數(shù)據(jù)表明，血液中S100A10濃度具有生物標(biāo)志物的潛力[15]。本研究通過檢測(cè)血清中S100A10也發(fā)現(xiàn)其在DBI后表達(dá)異常，且隨時(shí)間表達(dá)呈先降低后升高的趨勢(shì)，具有一定規(guī)律性。因此，其在DBI中損傷時(shí)間推斷中具有一定潛力，今后還應(yīng)探索其表達(dá)與患者預(yù)后是否存在相關(guān)性。

對(duì)于顱腦損傷，學(xué)者們已通過多種方法探索其治療對(duì)策，尤其是對(duì)腦損傷后的炎性反應(yīng)。其中包括中醫(yī)針灸法對(duì)相關(guān)穴位進(jìn)行干預(yù)，使得腦損傷模型大鼠的神經(jīng)功能及炎性反應(yīng)得到明顯改善[16]，并且可通過影響PI3K/AKT通路關(guān)鍵蛋白，發(fā)揮對(duì)腦損傷的治療作用[17]。此外，最近還有研究稱，參芍口服液、益生菌等均可抑制腦損傷后的炎性反應(yīng)[18-19]。益生菌對(duì)脂多糖誘發(fā)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥及認(rèn)知功能障礙具有保護(hù)作用，脂多糖可誘導(dǎo)神經(jīng)炎性A1s的分化，因此，益生菌可能會(huì)通過改善顱腦損傷病人腸道菌群，從而促進(jìn)腦損傷的修復(fù)[18]。我們已知，腦損傷后的炎性反應(yīng)在腦損傷后修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用，因此，通過損傷時(shí)間的推斷，可了解炎性反應(yīng)的時(shí)間，并有助于醫(yī)務(wù)人員在恰當(dāng)時(shí)機(jī)采取相應(yīng)治療措施。

該實(shí)驗(yàn)存在不足但也在意料之中的是，C3的補(bǔ)體成分C3d并不是A1s的一個(gè)完全特異性的標(biāo)記物，偶爾也可在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，同樣，S100A10也同樣如此。因此我們通過C3d與GFAP的免疫熒光雙重染色來糾正這個(gè)問題，以GFAP+C3d+雙陽性細(xì)胞作為A1s，以GFAP+S100A10+雙陽性細(xì)胞作為A2s。我們知道，C3d是C3的補(bǔ)體成分之一，因此，還有實(shí)驗(yàn)證明，通過C3和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD68進(jìn)行免疫熒光雙重染色，并未發(fā)現(xiàn)兩者共存的細(xì)胞，因此，這降低了C3存在于小膠質(zhì)細(xì)胞的可能性[20]。并且，通過形態(tài)學(xué)，我們觀測(cè)到C3d+細(xì)胞和S100A10+細(xì)胞在很大程度上與星形膠質(zhì)細(xì)胞相似。接下來的任務(wù)，可能需要通過更多的標(biāo)記物來識(shí)別不同分型的星形膠質(zhì)細(xì)胞，以增加其確定性，并且應(yīng)從多方面加以考慮，包括轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、形態(tài)學(xué)和特定的細(xì)胞功能，并證明不同的物質(zhì)對(duì)病理特征的影響。

雖然目前刺激和導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性和轉(zhuǎn)化的潛在機(jī)制仍不清楚，但通過檢測(cè)腦組織中A1s、A2s的表達(dá)變化，可對(duì)早期腦損傷時(shí)間的推斷起到一定作用。在臨床中GFAP有利于判斷腦損傷程度及預(yù)后，在法醫(yī)學(xué)中，通過檢測(cè)血清、腦脊液中GFAP也是判斷致死性腦外傷及推斷損傷時(shí)間的重要生物學(xué)標(biāo)志物[21-22]，且與其他生物標(biāo)志物聯(lián)合使用時(shí)，可進(jìn)一步提高準(zhǔn)確性[23]。通過檢測(cè)血清中GFAP、C3d、S100A10得知，C3d、S100A10在血清中變化幅度均較GFAP明顯，且以C3d為甚。因此，是否可將上述指標(biāo)應(yīng)用到臨床案例中，早期及時(shí)監(jiān)測(cè)兩者動(dòng)態(tài)變化，并聯(lián)合臨床中影像學(xué)、電生理學(xué)等資料，為判斷腦外傷的損傷程度及預(yù)后提供一定依據(jù)。