依那西普對銀屑病大鼠模型固有淋巴細(xì)胞亞群分型的影響

呼肖娜，李衛(wèi)紅

(1.楊凌示范區(qū)醫(yī)院，陜西 楊凌 712100;2.西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院，陜西 西安 710004)

銀屑病是一種非傳染性慢性皮膚病，其特征是角質(zhì)形成細(xì)胞過度快速增殖，是一種常見的T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性皮膚病[1]。它與主要攻擊皮膚中的靶細(xì)胞，特別是角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)有關(guān)，分別可導(dǎo)致細(xì)胞增生和炎癥后色素沉著過度[2]。銀屑病通常表現(xiàn)為皮膚上長期存在紅色和尖銳的鱗狀斑塊，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量[3]。有研究[4]報(bào)道，銀屑病通常會(huì)導(dǎo)致合并癥的風(fēng)險(xiǎn)增加，例如炎癥性關(guān)節(jié)炎、肥胖、高血壓和炎癥性腸病。人體免疫系統(tǒng)由兩部分組成：先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。先天免疫是在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)被激活之前抵御病原微生物感染的第一道防線，對病原體快速反應(yīng)，無特異性。作為新描述的淋巴細(xì)胞，固有淋巴細(xì)胞(Innate lymphocytes，ILC)極大地增強(qiáng)了我們對免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。ILC作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可促進(jìn)宿主對病原體和微生物的防御，維持組織和器官的穩(wěn)態(tài)，并促進(jìn)組織重塑、愈合和修復(fù)以及腫瘤的發(fā)展[5-6]。另一方面，ILC的轉(zhuǎn)錄異常和功能失調(diào)在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，與免疫耐受和自身免疫有關(guān)。基于許多關(guān)于人類疾病的推測模型和研究認(rèn)為ILC的不同亞群和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可能對自身免疫相關(guān)的皮膚病和炎癥性疾病至關(guān)重要；傳統(tǒng)治療銀屑病側(cè)重于抑制免疫系統(tǒng)和角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，如使用甲氨蝶呤、環(huán)孢素和阿維A等[7]。隨著對銀屑病潛在免疫過程的闡明，生物制劑迅速成為靶向這些途徑的調(diào)節(jié)劑的前沿。本研究通過咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病大鼠模型，探討生物制劑依那西普對銀屑病大鼠模型ILC亞群分型的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只6周齡雄性Lewis大鼠(180～200 g)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，許可證號SYXK(京)2021-0050。將大鼠分組并安置在有墊料的籠子中(每個(gè)籠子6只)，用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物和水喂養(yǎng)動(dòng)物，飼養(yǎng)條件：12 h光照和12 h黑暗循環(huán)，溫度(22±2)℃和濕度(50±15)% 。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 依那西普(購自Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG，批準(zhǔn)文號S20150009)，流式細(xì)胞儀分析(購自貝克曼庫爾特流式細(xì)胞分析儀)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(購自上海碧云天生物科技有限公司，批號P0012)；Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(美國伊利諾伊州羅克福德皮爾斯)。

1.3 銀屑病大鼠模型制作和分組 將30只大鼠平均分為三組：對照組、模型組和依那西普組，每組10只。除對照組外，其余各組進(jìn)行銀屑病造模。將62.5 mg咪喹莫特局部應(yīng)用于剃光的大鼠背部皮膚(限于3 cm×3 cm面積)，持續(xù)7 d。當(dāng)皮膚表面出現(xiàn)鱗屑、紅斑及浸潤改變，病理檢查皮膚角質(zhì)層增厚或角化不全等說明造模成功[8]。另外，依那西普組大鼠皮下注射200 mg/d生物制劑依那西普，治療持續(xù)7 d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 皮膚炎癥嚴(yán)重程度評分：采用銀屑病皮損嚴(yán)重程度指數(shù)對大鼠皮損部位的紅斑、脫屑和增厚評分，分值為0～4分，其中0分表示無癥狀，1分表示有輕微癥狀，2分表示有中度癥狀，3分表示有重度癥狀，4分表示有極重度癥狀，分值越高說明大鼠皮損部位的紅斑、脫屑和增厚越嚴(yán)重。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測ILC1、ILC2和ILC3水平：采集大鼠尾部血管血液樣本，置入添加25 μl肝素溶液的聚乙烯管中。3000 g、4 ℃離心10 min獲取血漿樣品。使用紅細(xì)胞裂解液和固定液裂解紅細(xì)胞，固定有核細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析使用三激光/12通道系統(tǒng)行，并使用 Beckman Coulter的專有Kaluza軟件1.5 版進(jìn)行分析。ILC被定義為具有以下標(biāo)記集的細(xì)胞：CD45+、CD127+、譜系標(biāo)記 CD3、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD20、CD34、CD56、CD94、FcERIa 陰性。此外，ILC1 被定義為 CRTH22 CD1172;ILC2被定義為 CRTH2+CD1172;ILC3被定義為 CRTH22 CD42 CD117+。根據(jù)制造商的說明書使用細(xì)胞內(nèi)固定和透化緩沖液。細(xì)胞的絕對數(shù)量計(jì)算如下：ILC絕對淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(自動(dòng)計(jì)數(shù))=ILC的絕對數(shù)量/mm3。

1.4.3 蛋白印跡分析：取大鼠皮膚組織并切成小塊于PBS中勻漿，13 000 r/min，離心10 min獲取沉淀組織碎片。使用含有蛋白酶抑制劑(500 mmol/L苯甲基磺酰氟)的 RIPA 裂解和提取緩沖液提取蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商的方案，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量T-bet、GATA3和RORγt、Caspase-3、Caspase-14、絲聚蛋白、外皮蛋白和β-肌動(dòng)蛋白含量。如前所述將蛋白質(zhì)樣品(50 μg)上樣并進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行抗體標(biāo)記蛋白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光檢測，并暴露于Kodak XOMAT AR 放射自顯影膠片。使用程序 Image J v1.33u 對條帶進(jìn)行光密度分析。

1.4.4 實(shí)時(shí)PCR分析：使用RNeasy Kit從小鼠背部皮膚活檢中提取總RNA，根據(jù)制造商的說明使用RT2 First Strand Kit 和 RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix 將其轉(zhuǎn)化為互補(bǔ) DNA。在 ABI 7300 RT-PCR上進(jìn)行擴(kuò)增，并使用 PCR Array Data Analysis Software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)算γ-干擾素 (IFN-γ)、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-13(IL-13)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)和白細(xì)胞介素-22(IL-22)的mRNA水平。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠背部皮膚炎癥嚴(yán)重程度評分比較 見表1。模型組紅斑、鱗屑和厚度評分較對照組升高(均P<0.05)，依那西普組紅斑、鱗屑和厚度評分較模型組降低(均P<0.05)。

表1 三組大鼠皮膚炎癥嚴(yán)重程度評分比較(分)

2.2 三組大鼠外周血循環(huán)ILC譜系分析 見表2。ILC1和ILC3水平比較，模型組高于對照組，依那西普組低于模型組(均P<0.05)；ILC2水平比較，模型組高于對照組，依那西普組低于模型組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠外周血循環(huán)ILC譜系分析(個(gè)/μl)

2.3 三組大鼠轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平比較 見表3。模型組T-bet、GATA3、RORγt、Caspase-3蛋白表達(dá)較對照組升高(均P<0.05)，而Caspase-14、絲聚蛋白和外皮蛋白的蛋白表達(dá)降低(均P<0.05)；依那西普組T-bet、GATA3、RORγt、Caspase-3蛋白表達(dá)較模型組降低(均P<0.05)，而Caspase-14、絲聚蛋白和外皮蛋白的蛋白表達(dá)升高(均P<0.05)。

表3 三組大鼠轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平比較

2.4 三組大鼠組各炎癥因子mRNA表達(dá)水平比較 見表4。模型組IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17和IL-22mRNA表達(dá)較對照組升高(均P<0.05)，依那西普組IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17和IL-22 mRNA表達(dá)較模型組降低(均P<0.05)。

表4 三組大鼠各炎癥因子mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

銀屑病是一種常見的慢性疾病，主要累及皮膚和關(guān)節(jié)，并且與潛在的遺傳易感性和炎癥失調(diào)有關(guān)[9]。雖然沒有治愈牛皮癬的方法，但有完善的管理方案。輕度和中度銀屑病的一線治療通常是局部治療，包括糖皮質(zhì)激素、維生素D類似物和光療的組合，而中度至重度銀屑病通常需要全身治療[10]。用于銀屑病全身治療的藥物包括小分子藥物，如甲氨蝶呤、類維生素A或環(huán)孢菌素，以及最近的生物制劑，如單克隆抗體和受體融合蛋白[11]。大多數(shù)小分子減少細(xì)胞增殖或抑制免疫活性，而生物制劑靶向IL-23/Th17軸和TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的炎性細(xì)胞因子。本研究使用生物制劑對銀屑病大鼠進(jìn)行了治療，并探討對ILC亞群表達(dá)的影響機(jī)制。

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的炎癥性和主要皮膚嗜性的疾病，具有多因素癥狀，由先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和分子介導(dǎo)。遺傳和環(huán)境因素都與銀屑病的發(fā)病有關(guān)。證據(jù)表明，Th17標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22在銀屑病中起主要作用，Th17細(xì)胞是這些致病細(xì)胞因子的主要來源[12-14]。然而，侵入皮膚的γδT細(xì)胞和RORγt+ILC分泌IL-17A、IL-17F和IL-22，成為大鼠急性銀屑病樣病變形成的重要誘因，表明先天免疫失調(diào)參與銀屑病斑塊的形成。銀屑病中觀察到的表皮增厚是由IL-23介導(dǎo)的，IL-23由樹突狀細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞過度產(chǎn)生，它們刺激真皮內(nèi)的Th17細(xì)胞產(chǎn)生IL-17A和IL-22。在健康的皮膚和血液中，ILC2和ILC3以低水平存在并表達(dá)皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CLA)，因此具有定位于皮膚的能力[15-17]。在咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病實(shí)驗(yàn)小鼠模型中，已經(jīng)證明先天淋巴細(xì)胞之間的串?dāng)_在該疾病的發(fā)病機(jī)制中顯得至關(guān)重要。事實(shí)上，RORγt+γδT細(xì)胞和ILC3代表了銀屑病斑塊中IL-17和IL-22的主要早期生產(chǎn)者，并且值得注意的是，通過比較缺乏所有淋巴細(xì)胞亞群的Rag2/-IL2rcg/小鼠與Rag1/小鼠，僅缺乏T和B細(xì)胞，ILC3和γδ T細(xì)胞導(dǎo)致銀屑病斑塊形成是必要和充分的[18-20]。通過使用免疫組織化學(xué)分析，本研究發(fā)現(xiàn)生物制劑對ILC亞群分型有調(diào)控作用，與對照組大鼠相比，模型大鼠有較高水平的ILC1和ILC3分型及較低水平ILC2，而生物制劑干預(yù)治療后逆轉(zhuǎn)了模型大鼠的ILC亞群失衡，并調(diào)控相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和炎癥因子的表達(dá)。在介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)中細(xì)胞因子通過Th-17、Th-1和Th-22系統(tǒng)啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致IL-5、IL-13、IL-17、IL-22和IFN-γ的mRNA表達(dá)。因此，Th-1和Th-17細(xì)胞因子均誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生IL-20，從而在自動(dòng)擴(kuò)增步驟中增加細(xì)胞的增殖。此外IL-6和TNF-α由角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生并有助于樹突狀細(xì)胞的活化，從而促進(jìn)和增加表皮炎癥的嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)，生物制劑通過調(diào)控ILC亞群分型變化影響模型大鼠炎癥因子的水平，通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與模型組大鼠相比，生物制劑組IFN-γ、IL-5、IL-13、IL-17和IL-22 mRNA表達(dá)降低。研究還表明，生物制劑能減少細(xì)胞凋亡程度的發(fā)生(蛋白印跡分析顯示模型組Caspase-3下調(diào))，與模型組相比，生物制劑上調(diào)Caspase-14、外皮蛋白和絲聚蛋白的蛋白表達(dá)水平來維持表皮的穩(wěn)態(tài)以及功能和結(jié)構(gòu)的完整性，從而改善皮膚狀況。

綜上所述，生物制劑依那西普可通過調(diào)控ILC亞群分型進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子和炎癥因子的表達(dá),從而達(dá)到減緩銀屑病的作用。