萊菔硫烷聯(lián)合維生素D對乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響

李福平，王 茂，邱春麗，馬海龍，李 宏，代引海

(1.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；3.咸陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西 咸陽 712000)

乳腺癌是全世界范圍內(nèi)常見的疾病。根據(jù)2020年全球癌癥數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，乳腺癌發(fā)病率已超過肺癌，位居惡性腫瘤中發(fā)病率位之首。2020年全球68.5萬人死于乳腺癌，新發(fā)乳腺癌230萬例，乳腺癌患者的病死率占所有惡性腫瘤病死率的15%[1-3]。雖然手術(shù)、化療、放療和靶向治療等綜合治療在一定程度上提高了乳腺癌患者的總體生存率，但是乳腺癌新發(fā)病例數(shù)和死亡人數(shù)仍然在不斷增加。因此，我們迫切需要新的治療手段及策略去預(yù)防和控制乳腺癌。近年來，利用天然產(chǎn)品預(yù)防癌癥已經(jīng)得到了相當多的關(guān)注[4]。在各種天然產(chǎn)物中，萊菔硫烷(Sulforaphane，SFN)是從西蘭花中提取的一種硫氰酸鹽化學物質(zhì)，具有抑制腫瘤生長的特性。相關(guān)研究已證明SFN可以抑制細胞周期進程，誘導(dǎo)凋亡細胞死亡，并抑制多種癌癥細胞的血管生成[5-6]。維生素D(Vitamin D,VD)一種類固醇激素，是人體不可或缺的維生素之一。近年來，國內(nèi)外許多研究表明，VD在腫瘤細胞的生長和代謝中起著重要作用[7-10]。有趣的是，SFN和VD都對乳腺癌的生長均有抑制作用，并且在乳腺癌的機制和信號通路上相似。然而，這兩種物質(zhì)聯(lián)合對乳腺癌細胞的作用效果如何，目前鮮有報道。因此，本研究通過初步探討SFN聯(lián)合VD對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的干預(yù)作用，為預(yù)防和控制乳腺癌提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細胞與儀器 人乳腺癌MCF-7細胞(湖南豐暉，CL0206)。儀器主要包括CO2培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher，3131)、離心機(美國Eppendorf，5417R)和流式細胞儀(美國BD，F(xiàn)ACSV)。

1.2 藥物與試劑 藥物包括SFN(美國 MCE，HY-13755)和VD(美國 MCE，HY-15398)。試劑包括DMEM 培養(yǎng)基(武漢普諾賽，PM150210)、10%胎牛血清(Fatal bovine serun，F(xiàn)BS)(美國 Gibco，12664025)、青霉素-鏈霉素溶液(雙抗，武漢普諾，PB180120)、0.25%胰酶(美國Hyclone，SH30042.01)、二甲基亞砜(DMSO)(美國 Thermo Fisher，D12345)、細胞增殖/毒性檢測(CCK-8)試劑盒(美國 Glpbio，GK10001)和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(上海翌圣生物,40302ES20)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)：按常規(guī)方法將人乳腺癌MCF-7細胞復(fù)蘇，在含10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素混合溶液(按100倍稀釋)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待乳腺癌細胞匯合度達到70%～90%時，加1 ml的0.25%胰酶進行消化后離心，吹打成細胞懸液，最后按照1×104個細胞/孔將細胞懸液接種于48孔細胞培養(yǎng)板中，加入適量新鮮培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.3.2 實驗分組：實驗分為SFN組、VD組、SFN+VD組各加入對應(yīng)的SFN或VD，兩種藥物濃度都分別設(shè)為2、5、10 μmol/L，并且將只加入0.1% DMSO溶劑組設(shè)為空白對照組。

1.3.3 顯微鏡下觀察細胞形態(tài)：對照組、SFN組、VD組、SFN+VD組加入對應(yīng)的SFN或VD，于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，并在倒置顯微鏡下觀察人乳腺癌MCF-7細胞形態(tài)變化。

1.3.4 細胞血球板計數(shù)：藥物處理后乳腺癌MCF-7細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入0.1 ml的0.25%胰酶吹打成細胞懸液。每孔取少量細胞懸液，將細胞懸液滴入蓋有蓋玻片的血細胞計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽中，使細胞懸液充滿蓋玻片與計數(shù)板間(不要有氣泡)，靜置2～3 min，通過顯微鏡計算四個大方格(由4×4的小方格組成)中的細胞，計算細胞總量。公式為：細胞數(shù)/ml=四大格細胞總數(shù)/4×104，每組實驗重復(fù)5次。

1.3.5 CCK-8法檢測細胞增殖：藥物處理后乳腺癌細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，實驗組和對照組分別各設(shè)置5個復(fù)孔,最后分別向每孔加入20 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)放置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，選擇450 nm波長，然后在酶標儀上測定各孔吸光度(OD)值，以確定不同濃度SFN或VD對人乳腺癌MCF-7細胞活力的影響。抑制率=[(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值]×100%。

1.3.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：將培養(yǎng)的乳腺癌細胞加入0.25%胰酶(不含EDTA)，離心、洗滌后加500 μl的結(jié)合緩沖液(Binding buffer)重懸細胞。避光添加5 μl膜結(jié)合蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC) 混勻，室溫避光孵育15 min 后，加入5 μl的碘化丙啶(PI)染色液，避光孵育10 min 后過膜上機。先根據(jù)SSC/FSC圖選擇細胞群，之后對選擇的細胞群進行作圖。分別將二維散點圖的X和Y軸設(shè)為Annexin V和PI，同時將散點圖分為4個象限(根據(jù)未染色的細胞確定)，Annexin V-/PI+區(qū)域(左上)的細胞為壞死細胞；Annexin V+/PI+區(qū)域(右上)的細胞為晚期凋亡細胞；Annexin V+/PI-區(qū)域(右下)的細胞為早期凋亡細胞；AnnexinV-/PI-區(qū)域(左下)的細胞為活細胞。細胞凋亡率為Annexin V+/PI+區(qū)域細胞比例加Annexin V+/PI-區(qū)域的細胞比例。

2 結(jié) 果

2.1 SFN和VD對乳腺癌細胞形態(tài)的影響 見圖1。在倒置顯微鏡下可以觀察到，正常培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞多呈不規(guī)則多邊形，緊密排列、單核、單層貼壁生長。 加入VD或SFN后，上述MCF-7細胞數(shù)量隨藥物濃度增加而逐漸減少，細胞形態(tài)也逐漸皺縮。在高濃度下(10 μmol/L)，各組MCF-7細胞的生長受限較為明顯。

圖1 不同藥物干預(yù)下MCF-7細胞倒置顯微鏡下形態(tài)觀察(吉姆薩染色,×100)

2.2 SFN和VD對乳腺癌細胞數(shù)量的影響 見圖2。細胞血球板計數(shù)結(jié)果表明，隨著SFN或VD濃度的上升，MCF-7細胞的數(shù)目隨之下降。當SFN和VD濃度在10 μmol/L時，相對應(yīng)的SFN組和VD組中的MCF-7細胞數(shù)目分別減少到對照組的49.47%和52.55%，單因素方差分析顯示，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。此外，在SFN+VD組中，乳腺癌MCF-7細胞數(shù)目均明顯減少，特別在兩種藥物混合濃度為10 μmol/L時，MCF-7乳腺癌細胞數(shù)目減少到對照組的28.72%，單因素方差分析顯示，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.01，△P<0.001

2.3 SFN和VD對乳腺癌細胞增殖的影響 見圖3。CCK-8法檢測細胞增殖結(jié)果表明，MCF-7細胞在低濃度(2 μmol/L)的SFN和VD單獨作用時，其細胞增殖的抑制不明顯，但是MCF-7細胞在高濃度(10 μmol/L)的SFN和VD單獨作用時，吸光度值下降幅度大，細胞增殖受到明顯抑制。另外，當SFN聯(lián)合VD組的濃度僅為5 μmol/L時，就已經(jīng)對MCF-7細胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，此時MCF-7細胞增殖活力為對照組的47%。當藥物濃度為10 μmol/L時，SFN組、VD組和SFN+VD處理組中的MCF-7細胞增殖活力分別為對照組的47.54%、43.38%和32.29%,單因素方差分析顯示，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。

注：與對照組比較，△P<0.01

2.4 SFN和VD對乳腺癌細胞凋亡的影響 見圖4。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，與對照組相比，MCF-7細胞在VD、SFN以及VD+SFN聯(lián)合干預(yù)48 h后，MCF-7細胞的凋亡比例(散點圖中的右上區(qū)域+右下區(qū)域的離散點總數(shù)目)隨藥物濃度的增加而顯著上升。其中對照組、2 μmol/L(VD、SFN和VD+SFN)實驗組、5 μmol/L(VD、SFN和VD+SFN)實驗組和10 μmol/L(VD、SFN和VD+SFN)實驗組的細胞凋亡率分別為9.99%、(18.44%、21.88%和28.20%)、(22.52%、23.95%和43.62%)和(57.90%、33.51%和90.83%)，單因素方差分析顯示，差異具有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。綜上所述，VD+SFN組的MCF-7細胞的凋亡率比單獨藥物刺激的凋亡率更高。

3 討 論

乳腺癌是一種影響全人類健康的疾病。它是全世界女性中最常見的癌癥，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，分別占所有癌癥病例和癌癥死亡病例的25%和15%[1，11]。因此，尋求多種預(yù)防和治療乳腺癌的策略這一行動已經(jīng)刻不容緩。近年來，膳食植物化學制劑因其不良反應(yīng)小、成本低、毒性低等優(yōu)點，已成為預(yù)防和治療包括乳腺癌在內(nèi)的癌癥的有利藥物[12-13]。

萊菔硫烷是一種硫氰酸鹽化學物質(zhì)，在西蘭花等十字花科蔬菜中含量豐富。大量研究[6,14-17]表明，萊菔硫烷可以抑制多種癌癥細胞的轉(zhuǎn)移、增殖和侵襲。據(jù)報道，SFN可引起MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細胞的生長阻滯和凋亡，這些與p53、p21、PTEN、DNMT1和RARbeta2的表達增加有關(guān)[17]。 Kaczyńska 等[18]研究表明，SFN聯(lián)合拉帕替尼可降低HER2陽性乳腺癌SKBR-3和BT-474細胞中人表皮生長因子受體2 (HER2)、AKT和S6的磷酸化，最終抑制細胞增殖、遷移并誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，多項體內(nèi)研究[19-21]表明，乳腺癌小鼠給予SFN治療后，其腫瘤體積明顯縮小。本研究采用2、5、10 μmol/L等不同濃度的SFN去干預(yù)人乳腺癌MCF-7細胞，結(jié)果表明這三種濃度的SFN均可抑制乳腺癌MCF-7細胞活力，這與上述文獻報道一致，并且隨藥物濃度的增加這種抑制效果更加顯著。有趣的是，本研究還發(fā)現(xiàn)當SFN聯(lián)合VD干預(yù)乳腺癌MCF-7細胞時，其抑制乳腺癌細胞增殖活力的能力明顯強于單獨使用SFN。

VD是一種類固醇類激素，在高等生物體內(nèi)主要行使控制骨礦化和維持鈣磷平衡的功能。大量證據(jù)表明，VD及其信號通路在乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌和結(jié)腸癌中可能具有抗癌作用[22]。此外，研究表明補充VD可以降低女性患乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的風險，因為它可以下調(diào)雌激素受體的表達[23]。前期相關(guān)體外研究也表明，維生素D可以抑制MCF-7乳腺癌細胞和SUM159乳腺癌干細胞的增殖活力[10]。鄭舒等[24]研究發(fā)現(xiàn)，VD聯(lián)合逍遙散還可改善產(chǎn)后抑郁大鼠的各項行為指標。本研究采用2、5、10 μmol/L等不同濃度的VD去干預(yù)人乳腺癌MCF-7細胞，結(jié)果表明這三種濃度的VD均可抑制上述MCF-7細胞活力，這與上述文獻報道一致，并且隨藥物濃度的增加這種抑制效果更加顯著。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)當VD聯(lián)合SFN去干預(yù)乳腺癌MCF-7細胞時，其抑制乳腺癌細胞增殖活力和促進細胞凋亡的能力明顯強于單獨使用VD。

值得注意的是，萊菔硫烷是否會對人體產(chǎn)生有益影響尚不清楚，因為到目前為止還沒有相關(guān)的臨床報道，當前研究只是在動物模型或者體外實驗檢測了其療效?；谝陨闲畔?，為了更好地了解萊菔硫烷在預(yù)防和治療乳腺癌中的功效。未來的研究重心應(yīng)放在:①更好地說明其作用所涉及的分子機制；②在臨床試驗中證明其有效性；③確定其安全性；④萊菔硫烷聯(lián)合維生素D兩者所產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)是由相加作用還是增強作用引起的，還需要進一步研究去證實。

綜上所述，SFN和VD都可抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖活力，當SFN聯(lián)合VD與兩類物質(zhì)單獨作用相比，其對MCF-7細胞增殖的抑制效果更加顯著。本研究的實驗結(jié)果可望為預(yù)防和控制乳腺癌提供新的策略。