湖南省部分地區(qū)豬偽狂犬病病毒的分離及主要毒力基因序列擴(kuò)增與分析

林 源，楊 青，何世成，譚 磊，方 鈴，唐小明，王衛(wèi)國，彭 志，胡巧云，張 坤，魯杏華，劉道新，王昌建

（1.湖南省動物疫病預(yù)防控制中心，湖南 長沙 410014；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

豬偽狂犬?。≒seudorabies, PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）感染宿主所引發(fā)的一種高度接觸性傳染病，不同發(fā)育階段豬群對該病均易感，其中仔豬和保育豬感染該病后可出現(xiàn)發(fā)熱、神經(jīng)癥狀、嘔吐和腹瀉等臨床癥狀，且死亡率高；肥育豬感染后出現(xiàn)呼吸癥狀，但死亡率較低；公豬可出現(xiàn)睪丸炎，影響其繁殖性能；繁殖母豬可出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，如流產(chǎn)、死胎等[1-2]。目前，PR是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，該病的發(fā)生與流行給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

PRV屬于皰疹病毒科，該病原可感染多種動物，其中包括豬、犬、牛、羊等多種家畜，也有虎、狼等野生動物[4]。此外，最近研究表明，人對PRV也易感，且人感染該病后可出現(xiàn)腦炎、視力減退等臨床癥狀，甚至死亡[4-5]。因此，PRV是一種嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬從業(yè)人員甚至是消費(fèi)者健康的傳染性病原[4-5]。PRV為大型DNA病毒，其基因組大小約143 kb，可編碼至少72種蛋白，這些蛋白參與病毒衣殼、包膜及間質(zhì)的形成，其中g(shù)E、gB、gC、gH、gG和TK等是決定PRV免疫或毒力的重要基因，研究這些基因變異情況可初步分析毒株的遺傳進(jìn)化情況。

本研究于2017—2018年從湖南省部分地區(qū)共分離到5株P(guān)RV野毒，通過對以上病毒TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）進(jìn)行測定及對其毒力或免疫相關(guān)基因序列擴(kuò)增、測序與分析，旨在初步分析近湖南省部分地區(qū)PRV病原特性及基因遺傳變異情況，為相應(yīng)的防控措施制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2017—2018年從湖南長沙、株洲、岳陽和懷化等4個地區(qū)的8個豬場采集疑似感染PR的仔豬組織樣品8份，每份樣品包括1頭豬的淋巴結(jié)、脾、肺、腦等組織。以上豬場新生仔豬均出現(xiàn)疑似PR臨床癥狀，主要包括角弓反張、嘔吐、腹瀉及昏睡等，部分病例剖檢可發(fā)現(xiàn)病豬腦膜充血或出血明顯，腎臟表面有明顯的出血點(diǎn)，且淋巴結(jié)腫大等，采集以上組織病料用于病原檢測及病毒分離。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、FBS血清、0.25%含EDTA胰酶購自于Gibco公司；豬腎上皮細(xì)胞（PK15）由湖南省動物疫病預(yù)防控制中心保存；病毒基因組（DNA/RNA）提取試劑盒購自于北京天根科技有限公司；2×PCR預(yù)混液、DL 2 000 DNA Marker和反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自于TaKaRa公司；豬偽狂犬病病毒（PRV）/豬瘟病毒（CSFV）/豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）/豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）四通道熒光定量PCR檢測試劑盒、豬細(xì)小病毒（PPV）熒光定量PCR檢測試劑盒均購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。

1.3 病料處理及基因組提取

每份樣品分別取各組織混合剪碎后加入適量滅菌PBS溶液，研磨后反復(fù)凍融3次，離心取上清液置于1.5 mL離心管中。根據(jù)病毒基因組（DNA/RNA）提取試劑盒說明書對組織上清基因組進(jìn)行提取，將提取后的核酸保存于-70 ℃。

1.4 常見豬病的檢測

用商品化熒光定量PCR檢測試劑盒對步驟1.3提取的核酸進(jìn)行PRV、PCV2、PPV、PRRSV及CSFV檢測，檢測方法參照試劑盒說明書。

1.5 病毒的分離與鑒定

將步驟1.4檢測結(jié)果為PRV陽性的樣品組織上清液與適量DMEM培養(yǎng)基混合，0.22 μm濾膜過濾后將濾液接種于單層PK15細(xì)胞，并設(shè)置陰性對照。37 ℃孵育2 h后棄去上清液，PBS清洗后加入含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育3 d，每日觀察細(xì)胞病變情況，若出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），則連續(xù)傳代3代，取第3代細(xì)胞上清液提取核酸，利用商品化熒光PCR檢測試劑盒對提取的核酸進(jìn)行PRV鑒定。

1.6 病毒空斑純化

將步驟1.5鑒定為PRV陽性的病毒液進(jìn)行梯度稀釋（10-1～10-6），500 μL/孔加入長滿單層PK15細(xì)胞的6孔板中37 ℃孵育1 h，以PBS溶液洗滌2次，每孔加入2 mL培養(yǎng)液（含5% FBS的2×DMEM與2%低熔點(diǎn)瓊脂糖1∶1混勻），待培養(yǎng)液凝固后倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。出現(xiàn)空斑后，挑取產(chǎn)生單個空斑的病毒加入500 μL DMEM中吹打混勻，反復(fù)凍融3次后進(jìn)行下一輪純化，進(jìn)行5輪純化后收獲病毒液，保存于-70 ℃。

1.7 病毒滴度測定

用DMEM將病毒液梯度稀釋（10-1～10-9），100 μL/孔加入長滿單層PK15細(xì)胞的96孔板中，每個稀釋度接種1列，設(shè)3列只加DMEM作陰性對照，37 ℃孵育2 h后用PBS溶液洗滌2次，其后每孔加入100 μL含2% FBS的細(xì)胞維持液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變并計(jì)數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.8 PRV免疫與毒力相關(guān)基因序列擴(kuò)增、測序及分析

參考文獻(xiàn)[6]分別合成用于擴(kuò)增PRV免疫與毒力相關(guān)基因（gB、gG、gH、gI、gL、gM、gE、TK和PK）的引物（表1），引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。將純化后的病毒液提取核酸，分別進(jìn)行免疫與毒力相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（50 μL）為2×PCR預(yù)混液25.0 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板3.0 μL及雙蒸水20.0 μL；反應(yīng)條件為98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，56～60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。取5.0 μL PCR產(chǎn)物于1.0%凝膠電泳進(jìn)行電泳檢測，剩余的PCR產(chǎn)物送至擎科（長沙）生物科技有限公司對各基因序列進(jìn)行雙向測序。利用DNAstar軟件將測序結(jié)果進(jìn)行拼接，從GenBank下載國內(nèi)外具有代表性的PRV毒株各免疫與毒力相關(guān)基因，利用DNAstar軟件進(jìn)行核苷酸與氨基酸序列同源性比對。將常用于構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹的gE、gB和TK基因序列依次串聯(lián)，利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

表1 本研究PCR擴(kuò)增所用引物相關(guān)信息

2 結(jié)果

2.1 病料的檢測

將8份組織樣品處理后提取基因組核酸，用熒光定量PCR法分別檢測PRV、PCV2、PPV、PRRSV及CSFV核酸。結(jié)果表明，8份組織樣品中5份為PRV陽性，且CSFV、PRRSV、PPV和PCV2均為陰性（圖1）。

2.2 PRV分離鑒定與TCID50測定

將5份PRV陽性組織樣品上清分別接種于單層PK15細(xì)胞，36 h后均出現(xiàn)細(xì)胞聚集、變圓成空泡、脫落等明顯細(xì)胞病變，對照組細(xì)胞無病變現(xiàn)象（圖1）。分別取第3代細(xì)胞上清提取核酸，用熒光PCR方法進(jìn)行PRV檢測，結(jié)果顯示，5份樣品均為PRV陽性，證明分離出5株P(guān)RV野毒，并根據(jù)地區(qū)來源將5株病毒分別命名為HuN-HH株、HuN-YY株、HuN-NX株、HuN-ZZ株和HuN-LY株。

圖1 感染PRV后PK15細(xì)胞病變情況

對各P R V野毒進(jìn)行噬斑純化（圖2），將第5代純化病毒擴(kuò)增后進(jìn)行滴度測定，滴度分別為10-6.37TCID50/100 μL（H u N-H H株）、10-7.12TCID50/100 μL（H u N-Y Y株）、10-7.44TCID50/100 μL（HuN-NX株）、10-7.62TCID50/100 μL（HuN-ZZ株）和10-7.94TCID50/100 μL（HuN-LY株）。

圖2 分離病毒的空斑形成

2.3 PRV毒株免疫與毒力相關(guān)基因序列擴(kuò)增結(jié)果

以5株P(guān)RV DNA基因組為模板，利用PCR擴(kuò)增以上病毒的免疫（gB、gG、gH、gI、gL和gM）和毒力（gE、TK和PK）相關(guān)基因序列，部分PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3所示，各基因序列對應(yīng)PCR產(chǎn)物與預(yù)期大小基本一致，說明以上基因序列均成功擴(kuò)增。

圖3 PRV免疫與毒力相關(guān)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.4 PRV免疫與毒力相關(guān)基因序列比對及同源性分析結(jié)果

將以上PCR產(chǎn)物送至擎科（長沙）生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序，其后將返回的序列進(jìn)行拼接，并與GenBank收錄的國內(nèi)部分PRV變異株（HeN1、BJ-YT、JS-2012和TJ株）、傳統(tǒng)株（Ea和Fa株）和疫苗株（Kaplan、Becker和Bartha株）對應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行多重序列比對同源性。其中不同基因核苷酸序列比對結(jié)果表明：與國內(nèi)流行變異株相比，本研究獲得的部分毒株gE和gG核苷酸序列有連續(xù)堿基缺失或插入，其中HN-YY、HN-LY和HN-NX株的gE基因序列在第1 472～1 474位出現(xiàn)3個連續(xù)堿基缺失（ACG），導(dǎo)致其氨基酸序列第491位有天冬氨酸（D）缺失；HN-YY株的gG基因序列在第876～990位有一段連續(xù)堿基插入，導(dǎo)致其對應(yīng)氨基酸序列第329～366位插入一段氨基酸序列（SPAAPVEGAGDGEEGHGDEEDEELTSSDL DNIEIEVVG）。此外，不同基因核苷酸序列均有出現(xiàn)堿基突變情況，部分導(dǎo)致對應(yīng)的氨基酸出現(xiàn)變異。

序列同源性分析結(jié)果如表2所示，本研究獲得的5株P(guān)RV野毒免疫及毒力相關(guān)基因序列相對較為保守，其中g(shù)B、gH、gI、gL、gM、gG、gE、TK和PK核苷酸（對應(yīng)氨基酸）序列同源性分別為100.0%（100.0%）、9 9.9%～1 0 0.0%（9 9.7%～1 0 0.0%）、9 9.8%～1 0 0.0%（9 9.7%～1 0 0.0%）、1 0 0.0%（1 0 0.0%）、9 9.9%～1 0 0.0%（9 9.6%～1 0 0.0%）、9 9.8%～1 0 0.0%（9 9.1%～1 0 0.0%）、9 9.9%～1 0 0.0%（99.7%～100.0%）和100.0%（100.0%）；5株P(guān) R V與國內(nèi)流行的P R V變異株對應(yīng)序列同源性分別為1 0 0.0%（1 0 0.0%）、9 9.8%～1 0 0.0%（9 9.7%～1 0 0.0%）、9 9.4%～1 0 0.0%（9 9.7%～1 0 0.0%）、1 0 0.0%（1 0 0.0%）、9 9.9%～1 0 0.0%（9 9.8%～1 0 0.0%）、9 9.9%～1 0 0.0%（9 9.8%～1 0 0.0%）、9 9.9%～1 0 0.0%（9 9.7%～1 0 0.0%）、9 9.7%～1 0 0.0%（9 9.6%～1 0 0.0%）和9 9.8%～1 0 0.0%（99.6%～100.0%）。由表2可知，本研究獲得的所有毒株與國內(nèi)流行變異毒株（如JS-2012株和HeN1株）對應(yīng)基因核苷酸和氨基酸序列同源性均高于國內(nèi)流行的傳統(tǒng)毒株（如Ea株和Fa株）國外流行毒株（如Bartha株和Kaplan株）。

表2 本研究獲得的PRV毒株與國內(nèi)外代表性毒株對應(yīng)序列同源性比較結(jié)果 %

2.5 PRV毒株免疫與毒力相關(guān)基因序列遺傳進(jìn)化分析

為分析本文獲得PRV毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系，基于PRV分離株gE核苷酸序列推導(dǎo)氨基酸序列，應(yīng)用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖4所示，國內(nèi)外所有PRV毒株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上可聚為2個分支（genotype Ⅰ和genotype Ⅱ），其中國外流行毒株則屬于genotype Ⅰ分支，而國內(nèi)流行的毒株屬于genotype Ⅱ分支。此外，國內(nèi)2012年以前流行毒株和2012年以后流行毒株可分為2個小分支，分別命名為傳統(tǒng)株和變異株。本研究獲得的5株P(guān)RV野毒與國內(nèi)2012年后流行的PRV變異株聚為同一分支，與2012年以前的PRV流行株（如Ea和Fa）相隔較近，但與國外流行毒株（如Becker和Kaplan）所屬分支親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，上述結(jié)果表明，本研究分離得到的毒株均為PRV變異株。

圖4 基于PRV gE氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（菱形代表本研究分離PRV毒株）

3 討論

豬偽狂犬病是嚴(yán)重影響我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一，該病是由PRV感染所引起。根據(jù)PRV的基因組特點(diǎn)，我國流行的PRV毒株可分為2種基因型，分別為PRV傳統(tǒng)株和變異株[7]。以2012年為分界線，2012年以前流行的PRV毒株均屬于傳統(tǒng)株，而2012年以后流行的PRV毒株則主要為變異株，且大量研究表明PRV變異株對宿主（小鼠模型）的致病力遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)株[8]。盡管目前我國政府及相關(guān)養(yǎng)豬企業(yè)出臺并實(shí)施了一系列針對豬偽狂犬病的防控措施，但該病仍然在我國流行趨勢嚴(yán)重。

PRV屬于皰疹病毒科成員，其基因組較大（約143 kb），可編碼至少72種蛋白，其中部分編碼蛋白與病毒毒力或免疫相關(guān)，如gB蛋白是PRV感染宿主細(xì)胞必須的，該蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；gG蛋白是病毒在增殖過程中大量釋放的一種談蛋白，可以使機(jī)體不易識別入侵的病毒；gL蛋白參與病毒的體外感染和復(fù)制等[6]；而gE、TK和PK等基因主要與病毒的毒力或致病性等相關(guān)[6]。由于PRV基因組龐大，這導(dǎo)致擴(kuò)增其全基因組序列去分析基因變異情況相對困難，所以研究人員一般通過分析這些與免疫及毒力相關(guān)基因序列信息來初步確定毒株基因組變異情況[1，6，8]。

近年來，湖南省生豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展較為迅速，但部分豬場仍然存在PRV野毒流行情況[9-10]。為初步分析近年來湖南省部分地區(qū)豬場流行的PRV野毒基因變異情況，本研究于2017—2018年從湖南懷化、益陽和寧鄉(xiāng)等地區(qū)5個疑似發(fā)生PRV感染的豬場采集病料樣品，通過前期病原檢測確定以上豬場發(fā)病均由PRV感染引起。其后我們對病料處理后進(jìn)行病毒分離，最終成功分離出5株P(guān)RV野毒，進(jìn)一步TCID50測定以上5株病毒滴度分別為10-6.37、10-7.12、10-7.44、10-7.62和10-7.94TCID50/100 μL，這與國內(nèi)流行的PRV變異株滴度基本一致[8]。其后我們對本研究分離的5株P(guān)RV野毒的gB、gG、gH、gI、gL、gM、gE、TK和PK基因序列進(jìn)行擴(kuò)增與分析，這9個基因與PRV的毒力或免疫相關(guān)，通過分析這些基因序列變異情況可初步確定PRV的變異情況[6]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究分離的毒株大部分基因序列與國內(nèi)流行的PRV變異株相應(yīng)序列同源性很高，這表明這些基因序列十分保守，僅僅有部分核苷酸堿基出現(xiàn)突變。與國內(nèi)流行的PRV變異株相比，HN-YY、HN-LY和HN-NX株的gE基因序列在第1 472～1 474位出現(xiàn)3個連續(xù)堿基缺失（ACG），導(dǎo)致其氨基酸序列第491位有天冬氨酸（D）缺失，而這個現(xiàn)象同樣在國內(nèi)流行的PRV傳統(tǒng)毒株（Ea株）和國外流行毒株（Kaplan株）存在。此外，HN-YY株的gG基因序列在第876～990位有一段連續(xù)堿基插入，而有文獻(xiàn)表明gG基因可能參與PRV的免疫誘導(dǎo)等[11]，但這段連續(xù)氨基酸序列的插入是否會影響該毒株誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)或更弱的免疫應(yīng)答還需要進(jìn)一步試驗(yàn)探索。

將本研究獲得毒株與GenBank收錄的國內(nèi)外具有代表性PRV毒株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究獲得的5個毒株均與國內(nèi)2012年后流行的PRV變異株聚為同一分支，與國內(nèi)流行的PRV傳統(tǒng)株和國外流行毒株（疫苗株）相距較遠(yuǎn)，這提示湖南省部分地區(qū)流行的PRV毒株仍為變異株。雖然目前大部分豬場通過加強(qiáng)免疫接種疫苗（如Bartha或HB-98疫苗）可有效防控PRV野毒感染，但目前我國PRV流行情況仍然不容客觀，這可能主要與許多散養(yǎng)戶未免疫接種PRV相關(guān)疫苗或養(yǎng)殖水平較低等有關(guān)[6]，但這也提示我們需要研發(fā)以PRV變異株為親本的新型疫苗，這樣可能對豬偽狂犬病的防控更為有效。