3種消毒劑場(chǎng)景化消殺效果研究

李 博，陳俊宇，張 林，王貴平

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

現(xiàn)如今，集約化養(yǎng)殖程度越來(lái)越高，養(yǎng)殖場(chǎng)中傳染病流行的風(fēng)險(xiǎn)也在增加，規(guī)模化豬場(chǎng)中細(xì)菌病是最難以根治的疾病，而且發(fā)生的頻率也越來(lái)越高[1]，尤其是在豬病毒性疾病暴發(fā)的情況下，混合細(xì)菌性疾病和繼發(fā)感染更容易發(fā)生[2-5]，使規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)的生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)效益受到嚴(yán)重威脅[6-7]。

生物安全工作的重要性不言而喻，然而仍有部分養(yǎng)殖場(chǎng)戶防控意識(shí)不強(qiáng)，雖然制定了嚴(yán)格的消毒程序，但在實(shí)際動(dòng)物疫病防疫過(guò)程中并未切實(shí)做到位。消毒過(guò)后，殘留病原微生物只要達(dá)到適宜的條件，就會(huì)迅速傳播，暴發(fā)傳染病。市面上多種消毒劑是在實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)驗(yàn)證它的消殺效果，而養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際情況遠(yuǎn)比實(shí)驗(yàn)室復(fù)雜，消毒劑在養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)場(chǎng)景中的消殺效果還需要進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)選用豬場(chǎng)中常見(jiàn)的3種消毒劑（進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉、國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉、燒堿溶液）在轉(zhuǎn)群后地面糞便表面（場(chǎng)景1）、干清糞后地面糞渣（場(chǎng)景2）、豬舍門口腳踩盆（場(chǎng)景3）、豬場(chǎng)下水道儲(chǔ)水池（場(chǎng)景4）、豬場(chǎng)門口消毒池（場(chǎng)景5）中，進(jìn)行細(xì)菌消殺試驗(yàn)并評(píng)估其殺滅效果，為養(yǎng)殖場(chǎng)生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與試驗(yàn)地點(diǎn)

試驗(yàn)于2021年5月5日至8月31日在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

1.2 材料

（1）消毒劑：進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉，國(guó)內(nèi)某代理商代理，推薦使用稀釋濃度1∶200；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉，推薦使用稀釋濃度1∶200，湖南某生物科技公司生產(chǎn)；燒堿溶液，推薦使用稀釋濃度2%，某集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

（2）試驗(yàn)豬糞便：豬糞便均來(lái)自湖南省株洲市某規(guī)?；i場(chǎng)送檢樣品。

（3）主要試劑：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 場(chǎng)景化一：轉(zhuǎn)群后地面糞便表面消毒效果評(píng)估

（1）制造糞球。用送檢的豬糞便制作寬約4 cm、長(zhǎng)約5 cm、高約3 cm的半橢圓形干糞。

（2）潑灑消毒：分別在4 ℃、25 ℃、37 ℃條件下，將3種消毒劑按照推薦濃度用潑灑的方式將100 mL消毒劑潑灑到糞球表面每個(gè)部分上。

（3）取樣：分別在0（消毒前）、1、5、15和30 min后從糞球的底部、腰部、頂部3個(gè)表面點(diǎn)，用生理鹽水浸濕的無(wú)菌棉簽在小范圍內(nèi)輕蘸取樣，放到1.5 mL離心管中。

（4）樣品處理：向裝有樣品的離心管中加1 mL無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩混勻后，6 000 r/min，離心5 min，將上清液棄掉，目的是洗掉樣品中消毒劑成分。再加入1 mL無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩混勻后稀釋到合適濃度，備用。

（5）涂布：取最后稀釋度的樣品重新振蕩，立即用移液器抽取0.1 mL樣品于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基中，取涂布器均勻涂布30 s，至樣品均勻涂滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，每個(gè)樣品做兩次重復(fù)。將涂布好的培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，過(guò)夜培養(yǎng)12 h。

（6）菌落計(jì)數(shù)：平板上形成30～300個(gè)菌落屬于有效范圍，統(tǒng)計(jì)有效活菌數(shù)。

CFU=菌落數(shù)的平均值/10-n/0.1。

（7）細(xì)菌殺滅率計(jì)算：細(xì)菌殺滅率=（試驗(yàn)前樣品中菌落數(shù)-消殺后樣品中菌落數(shù)）/試驗(yàn)前樣品中菌落數(shù)×100%。

1.3.2 場(chǎng)景化二：干清糞后地面糞渣消毒效果評(píng)估

（1）制造糞渣：用送檢豬糞便制作半橢圓形干糞，放置到老舊搪瓷盤上（模擬在粗糙地面上），用鏟子鏟掉大塊糞球后，會(huì)剩下細(xì)小糞球渣子。

（2）潑灑消毒：分別在4 ℃、25 ℃、37 ℃條件下，將3種消毒劑按照推薦濃度用潑灑方式潑灑100 mL到糞渣上。

（3）取樣：用生理鹽水浸濕的無(wú)菌棉簽分別在0（消毒前）、15和30 min時(shí)，對(duì)消毒后的糞渣蘸取取樣，放到1.5 mL離心管中。

（4）樣品處理、涂布、菌落計(jì)數(shù)、細(xì)菌殺滅率計(jì)算：同1.3.1。

1.3.3 場(chǎng)景化三：豬舍門口腳踩盆消殺效果評(píng)估

（1）制做腳踩盤：將1∶200進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物、1∶200國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物和2%燒堿溶液分別倒入搪瓷盤中，并用無(wú)菌毛巾完全浸入消毒劑，平鋪到腳踩盤中（模擬腳墊）。

（2）踩踏模擬：試驗(yàn)人員先到臟亂地面上踩踏，保證鞋底上粘滿帶有細(xì)菌的泥土，然后在腳踏盤毛巾上踩踏。

（3）取樣：分別在0（踩踏前）、5、15、30 s，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用生理鹽水浸濕的無(wú)菌棉簽對(duì)鞋底前部、中部、后部3個(gè)位置取樣。

（4）樣品處理：向裝有樣品的離心管中加入1 mL無(wú)菌生理鹽水，充分混勻后，6 000 r/min，離心5 min，將上清液棄掉，目的是洗掉樣品中消毒劑成分。再加入1 mL無(wú)菌生理鹽水，充分震蕩混勻后稀釋到合適的濃度，備用。

（5）在試驗(yàn)人員踩踏完，等30 min后對(duì)腳踏盤中消毒劑抽取1 mL樣品。用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌的方法來(lái)檢測(cè)消毒劑在時(shí)間足夠的情況下能否完全殺滅鞋底細(xì)菌。

（6）樣品處理、涂布、菌落計(jì)數(shù)、細(xì)菌殺滅率計(jì)算：同1.3.1。

1.3.4 場(chǎng)景化四：豬場(chǎng)下水道儲(chǔ)水池細(xì)菌消殺效果研究

（1）模擬養(yǎng)殖場(chǎng)下水道場(chǎng)景：將1∶400進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物、國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物和4%燒堿溶液各150 mL分別倒入燒杯中，露天放置。再向燒杯中加入150 mL含大量細(xì)菌的污水（細(xì)菌數(shù)在為5.6×106CFU/mL）。

（2）取樣：每天向燒杯中加入不定量細(xì)菌污水液。30 min后用移液器從燒杯中取1 mL于1.5 mL離心管中，6 000 r/min，離心5 min，除去上清液，目的是洗掉樣品中消毒劑成分，再加入1 mL生理鹽水混勻，備用。同時(shí)定期補(bǔ)充水分維持300 mL的消毒劑容積（模擬下雨天補(bǔ)充水分）。

（3）細(xì)菌培養(yǎng)：取0.2 mL樣品加入到含3 mL胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基的5 mL玻璃試管中，放入37 ℃恒溫?fù)u床中180 r/min，過(guò)夜培養(yǎng)12 h。觀察液體培養(yǎng)基是否變渾濁。

1.3.5 場(chǎng)景化五：豬場(chǎng)門衛(wèi)消毒池消殺效果研究

（1）模擬養(yǎng)殖場(chǎng)門衛(wèi)消毒池場(chǎng)景：將1∶200進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物、國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物和2%燒堿溶液各300mL分別倒入燒杯中，露天放置。

（2）取樣、細(xì)菌培養(yǎng)：同1.3.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 場(chǎng)景化一：轉(zhuǎn)群后地面糞便表面消毒效果評(píng)估

由表1、表2、表3可知，在消殺1、5、15、30 min后，糞球表面細(xì)菌殺滅率：進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉4 ℃為33.38%～85.30%，25 ℃為62.90%～97.37%，37 ℃為38.75%～90.00%；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉4 ℃為67.30%～81.79%；25 ℃為55.63%～66.89%；37 ℃為54.70%～61.90%；燒堿溶液4 ℃為99.59%～99.77%，25 ℃為65.32%～99.90%，37 ℃為99.31%～99.90%。

表1 4 ℃ 3種消毒劑對(duì)糞球表面細(xì)菌消殺效果

表2 25 ℃ 3種消毒劑對(duì)糞球表面細(xì)菌消殺效果

表3 37 ℃ 3種消毒劑對(duì)糞球表面細(xì)菌消殺效果

在4 ℃、25 ℃、37 ℃條件下，燒堿消殺效果比同時(shí)間點(diǎn)的其他兩種消毒劑消殺效果均好，而且燒堿殺菌力持久強(qiáng)大，價(jià)格較低，在該場(chǎng)景消毒中更有優(yōu)勢(shì)。3種消毒劑均能殺滅糞便中絕大部分細(xì)菌，但還有小部分細(xì)菌并不能殺滅，推測(cè)原因可能是糞便中有機(jī)物干擾或耐消毒劑的細(xì)菌存在。

2.2 場(chǎng)景化二：干清糞后地面糞渣消毒效果評(píng)估

由表4、表5、表6可知，在消殺15、30 min后，糞渣中細(xì)菌殺滅率：進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉4 ℃為95.49%～97.14%，25 ℃為99.27%～99.83%，37 ℃為99.94%～99.95%；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉4 ℃為99.05%～99.86%，25 ℃為99.91%～99.95%，37 ℃為97.78%～99.91%；燒堿溶液4 ℃為99.94%～99.95%，25 ℃為99.96%～99.97%，37 ℃為99.97%～99.98%。

表4 4 ℃ 3種消毒劑對(duì)糞渣消殺效果

表5 25 ℃ 3種消毒劑對(duì)糞渣消殺效果

表6 37 ℃ 3種消毒劑對(duì)糞渣消殺效果

3種消毒劑對(duì)糞便殘?jiān)屑?xì)菌殺滅效果均良好。燒堿殺菌力持久強(qiáng)大，價(jià)格較低，與其他兩種消毒劑相比較而言，燒堿在該場(chǎng)景消毒中更有優(yōu)勢(shì)。

2.3 場(chǎng)景化三：豬舍門口腳踩盆消殺效果評(píng)估

（1）由表7可知，在消殺5、15、30 s后，鞋底細(xì)菌殺滅率：進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉為84.16%～98.78%，國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉為85.48%～98.04%，燒堿溶液82.52%～97.24%。在該場(chǎng)景消毒中，進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑更有優(yōu)勢(shì)。（2）消毒液對(duì)鞋底上細(xì)菌消殺30 min后，仍然有活菌存在。對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，可以看出有大量菌落形成。取這些菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)后用相同消毒液進(jìn)行再次消殺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)消毒完全無(wú)效。這些結(jié)果提示在鞋底存在耐消毒劑的細(xì)菌。

表7 3種消毒劑對(duì)鞋底上細(xì)菌殺滅效果

2.4 場(chǎng)景化四：豬場(chǎng)下水道儲(chǔ)水池消殺效果研究

進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，第5天液體培養(yǎng)基開(kāi)始變渾濁，說(shuō)明第5天有細(xì)菌存活；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑第8天培養(yǎng)基開(kāi)始變渾濁，說(shuō)明第8天有細(xì)菌存活；燒堿第3天培養(yǎng)基開(kāi)始變渾濁，說(shuō)明第3天有細(xì)菌存活。

在豬場(chǎng)下水道儲(chǔ)水池消毒中，消毒液的更換時(shí)間：進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉，4 d；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉，7 d；燒堿，2 d。國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑在該場(chǎng)景中消毒更有優(yōu)勢(shì)。

2.5 場(chǎng)景化五：豬場(chǎng)門衛(wèi)消毒池消殺效果研究

進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，第9天培養(yǎng)基開(kāi)始變渾濁，說(shuō)明第9天有細(xì)菌存活；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，第13天培養(yǎng)基開(kāi)始變渾濁，說(shuō)明第13天有細(xì)菌存活；燒堿第5天培養(yǎng)基開(kāi)始變渾濁，說(shuō)明第5天有細(xì)菌存活。

在豬場(chǎng)門衛(wèi)消毒池消毒中，消毒液的更換時(shí)間：進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉，8 d；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉，12 d；燒堿，4 d。國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑在該場(chǎng)景中消毒更有優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

在場(chǎng)景一，轉(zhuǎn)群后地面上糞便表面消毒中，3種消毒劑均能對(duì)糞球表面細(xì)菌有效殺滅，推薦使用2%燒堿溶液對(duì)糞球表面消毒。

在場(chǎng)景二，干清糞后地面糞渣消毒中，3種消毒劑在4 ℃、25 ℃、37 ℃的條件下，均能有效殺滅糞便殘?jiān)屑?xì)菌，推薦使用2%燒堿溶液對(duì)糞球表面消毒。

在場(chǎng)景三，豬舍門口腳踩盆消毒中，3種消毒劑均能殺滅絕大部分鞋底上細(xì)菌，且消殺效果不相上下，推薦使用進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒。

在場(chǎng)景四豬場(chǎng)下水道儲(chǔ)水池消毒和場(chǎng)景五豬場(chǎng)門衛(wèi)消毒池消毒中，推薦使用國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒。

4 討論

在不同場(chǎng)景化中，進(jìn)口硫酸氫鉀復(fù)合物（1∶200）、國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物（1∶200）和2%燒堿溶液對(duì)細(xì)菌均有良好的殺菌效果。在轉(zhuǎn)群后地面上糞便表面場(chǎng)景中，3種消毒劑對(duì)糞便表面場(chǎng)景中細(xì)菌消殺效果整體要弱于在對(duì)干清糞后地面糞渣場(chǎng)景，原因可能是在進(jìn)行對(duì)干清糞后地面糞渣潑灑消毒時(shí)，糞渣體積小，也比較散，能夠與消毒劑充分接觸。潑灑完后糞渣較長(zhǎng)一段時(shí)間都浸泡在消毒液中，有機(jī)物的干擾作用減弱了，能夠充分消毒。而對(duì)轉(zhuǎn)群后地面上糞便表面潑灑消毒時(shí)，雖然糞便表面每個(gè)部分都被潑上了消毒劑，但是消毒液會(huì)流下去，而且糞便表面的消毒液也會(huì)揮發(fā)，再加上糞便表面有機(jī)物干擾作用，所以消毒劑對(duì)干清糞后地面糞渣的消殺效果要強(qiáng)于糞便表面中細(xì)菌消殺效果。在生產(chǎn)應(yīng)用過(guò)程中，遇到轉(zhuǎn)群后地面殘留糞便時(shí)，飼養(yǎng)人員應(yīng)先將大塊糞便及時(shí)鏟走，然后用大量含消毒劑的水沖洗地面，對(duì)地面糞渣進(jìn)行充分消毒。

在豬舍門口腳踩盆消毒場(chǎng)景中，腳踩盤中消毒液當(dāng)天就檢測(cè)到活菌，建議定期更換消毒液來(lái)避免耐消毒劑的細(xì)菌出現(xiàn)；同時(shí)強(qiáng)烈建議采用其他方法（如換鞋）代替踩踏消毒的方式。

豬場(chǎng)生產(chǎn)實(shí)際情況比實(shí)驗(yàn)室復(fù)雜，在豬場(chǎng)下水道儲(chǔ)水池消毒中，建議消毒劑更換時(shí)間：進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，2～3 d；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，3～5 d；燒堿溶液應(yīng)每天更換1次。在豬場(chǎng)門衛(wèi)消毒池消毒中，建議消毒劑更換時(shí)間：進(jìn)口過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，1周；國(guó)產(chǎn)過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合物粉消毒劑，1～2周；燒堿溶液，3 d。

在場(chǎng)景一、二、三中，均有部分細(xì)菌不能被殺滅。推測(cè)其原因可能是糞便中耐消毒劑的細(xì)菌存在或有機(jī)物干擾。細(xì)菌抵抗消毒劑的作用機(jī)制主要包括形成生物膜、改變表面滲透性、外排性和導(dǎo)致酶失活等[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，某些種類的病原微生物長(zhǎng)期暴露低濃度消毒液后，就會(huì)產(chǎn)生耐藥性，一定劑量消毒劑作用下仍能存活，其傳染性和致病性增加[9]。采用多種消毒劑交替使用，或者選擇加熱、臭氧、UV（紫外線）等替代措施進(jìn)行消毒。聯(lián)合使用多種處理方法協(xié)同作用來(lái)更徹底地消除有害微生物，避免消毒劑抗性的產(chǎn)生和傳播。當(dāng)遇到有機(jī)物干擾時(shí)，消毒劑消殺效果會(huì)受到影響。由于消毒劑與有機(jī)物結(jié)合，會(huì)減少與病原微生物作用，有機(jī)物也起到保護(hù)微生物的作用，降低了消毒劑殺菌能力。在這種情況下，必須提高消毒劑的濃度，延長(zhǎng)消毒時(shí)間方能達(dá)到消毒目的。在消毒前應(yīng)對(duì)消毒場(chǎng)地進(jìn)行徹底地打掃，清除雜物以防影響消毒劑與病原微生物的接觸，可大幅提高消毒效果。