兩種免疫增強(qiáng)劑對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)、非特異性免疫性能的影響研究

傅純潔，葛紅星，趙士力，李前方

(1.東?？h水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江蘇 東海 222300；2.江蘇海洋大學(xué)，江蘇 連云港 222005；3.東海縣黃川鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)站，江蘇 東海 222322；4.江蘇瑞沃農(nóng)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司，江蘇 連云港 222300)

目前的研究已經(jīng)證實(shí)，維生素、中草藥制劑能提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫能力，但在克氏原螯蝦方面的研究相對(duì)較少。本研究通過(guò)篩選可能具有免疫強(qiáng)化性能的中草藥作為免疫增強(qiáng)劑，評(píng)估其不同添加比例對(duì)克氏原螯蝦非特異性免疫和生長(zhǎng)性能的影響，以期篩選適宜克氏原螯蝦用免疫增強(qiáng)劑。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

蝦苗在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)1周后選取健康、肢體健全、平均規(guī)格為(5.5±2)克/只的克氏原螯蝦開(kāi)始試驗(yàn)。

2.試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)將維生素C、維生素E按1∶1的比例混合成維生素制劑后以0.01%、0.02%、0.04%的濃度，選取甘草、金銀花、黃芪為試驗(yàn)原料，按1∶1∶1的比例混合成中草藥制劑后以1%、2%、4%的濃度添加至飼料中(N1、N2、N3、N4、N5、N6)，并設(shè)置對(duì)照組N0，每個(gè)處理3個(gè)平行。試驗(yàn)分組以及兩種免疫增強(qiáng)劑添加濃度見(jiàn)表1。飼料配方參考徐維娜等(2011)，主要成分為1.50%的磷酸二氫鈣、0.30%的氯化膽堿、14.70%的玉米粉、20.00%的魚(yú)粉、40.00%的黃豆粉、2.00%的魚(yú)油，按照添加制劑的濃度不同添加21.50%、21.49%、21.48%、21.46%、20.50%、19.50%、17.50%的小麥粉。

表1 各組飼料成分 %

3.試驗(yàn)管理

試驗(yàn)場(chǎng)地選擇21 個(gè)1 米2的水池，在每個(gè)水池中放500 克的水草。每個(gè)水池中放入3 個(gè)氣石充氧，保證溶氧充足。每個(gè)水池中放入20 只蝦，分別投喂經(jīng)不同處理的飼料，日投喂量為克氏原螯蝦體重的5%左右，每天投喂3 次，飼養(yǎng)40 天。水池的水位保持在15～20 厘米，確保在試驗(yàn)期間溶氧≥6.0 毫克/升、pH (7.5±1.5)、氨氮＜0.5 毫克/升。試驗(yàn)水溫為自然水溫，溫度保持10～20℃。每天觀察蝦死亡情況，及時(shí)撈出死蝦并進(jìn)行數(shù)量記錄，同時(shí)檢查死亡原因。

4.生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

選取增重率、特定生長(zhǎng)率、存活率和飼料系數(shù)4個(gè)指標(biāo)用以評(píng)估生長(zhǎng)性能，計(jì)算公式為：

增重率(%)＝(Wt-W0)/W0×100；

特定生長(zhǎng)率(%/天)＝(lnWt-lnW0)/t×100；

存活率(%)＝X1/X0×100；

飼料系數(shù)＝F/(W1-W0)；

式中：W0為小龍蝦平均初始體質(zhì)量(克)，Wt為小龍蝦的平均最終體質(zhì)量(克)，t 為養(yǎng)殖天數(shù)，F(xiàn)表示投餌量(克)，X1為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)克氏原螯蝦的成活數(shù)量，X0為試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)克氏原螯蝦的初始數(shù)量。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束，試驗(yàn)蝦饑餓8小時(shí)后稱(chēng)重。

采用Excel 和SPSS Statistics 26 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。單因子方差分析(one-way ANOVA)分析差異，P＜0.05作為差異顯著水平。

5.非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束后，從每個(gè)試驗(yàn)組中抽取3只克氏原螯蝦用于樣本的收集。用無(wú)菌注射器從蝦體圍心腔中取血，得到的血清用于堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)等測(cè)定。酶活采用南京建成生物研究所試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

二、結(jié)果

1.飼料中添加不同免疫增強(qiáng)劑對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)情況和餌料系數(shù)的影響

使用不同的飼料投喂40 天，克氏原螯蝦的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。各組特定生長(zhǎng)率與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。N1、N3、N4組增重率與對(duì)照組有顯著 差 異(P＜0.05)， 其 中N3組 增 重 率 僅 為432.14%，相較其他各組增重率最低，N1、N4組的增重率分別為546.34%、552.62%，明顯高于對(duì)照組N0(P＜0.05)。同時(shí)存活率中N1、N4組與對(duì)照組差異顯著，N4組存活率在試驗(yàn)各組中最高，達(dá)到95.00%，而N6組存活率最低，僅為73.33%。試驗(yàn)各組的飼料系數(shù)均顯著低于對(duì)照組N0(P＜0.05)，其中N4組的飼料系數(shù)最低，為2.22。

表2 兩種免疫增強(qiáng)劑對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)情況和餌料系數(shù)的影響

綜合試驗(yàn)各組的生長(zhǎng)情況，隨著兩種免疫增強(qiáng)劑的添加濃度上升，存活率都呈下降趨勢(shì)，N1、N4為同種添加制劑中存活率最高組別，同時(shí)兩種免疫增強(qiáng)劑添加濃度達(dá)最大時(shí)，存活率均小于對(duì)照組。對(duì)于增重率、特定生長(zhǎng)率兩項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)，隨添加濃度的上升，呈下降趨勢(shì)。

2.飼料中添加不同免疫增強(qiáng)劑對(duì)克氏原螯蝦SOD、AKP和ACP酶活性的影響

飼料中添加不同免疫增強(qiáng)劑對(duì)克氏原螯蝦SOD、AKP 和ACP 酶活性的影響如圖1～圖3 所示，其中SOD 酶活性N1組最高、N6組最低，且N1組顯著高于N0組(P＜0.05)。在維生素制劑添加中N1組SOD酶活性最高，且高于中草藥制劑組中活性最高的N5組；N1、N2、N3組隨著維生素制劑添加濃度提高，SOD酶活性呈下降趨勢(shì)，而添加中草藥制劑的N4、N5、N6組則呈現(xiàn)先升高、再下降的趨勢(shì)。試驗(yàn)各組AKP酶活性均隨著兩種免疫增強(qiáng)劑濃度的提高而上升，其中N6組AKP 酶活性最高，N4組活性最低，且試驗(yàn)各組均與N0組有顯著性差異(P＜0.05)。而ACP 酶活性中N6組最高、N4組最低。N1、N2、N3組隨著維生素制劑添加濃度提高，ACP 酶活性呈現(xiàn)先升高、再下降的趨勢(shì)，而N4、N5、N6組則隨著中草藥制劑添加濃度的提高而呈上升趨勢(shì)。其 中ACP 酶活性中N6組≈N2組，且 顯 著高于N0組(P＜0.05)。

圖1 兩種免疫增強(qiáng)劑對(duì)克氏原螯蝦SOD酶活性的影響

圖2 兩種免疫增強(qiáng)劑對(duì)克氏原螯蝦AKP酶活性的影響

圖3 兩種免疫增強(qiáng)劑對(duì)克氏原螯蝦ACP酶活性的影響

三、討論

在飼料中加入維生素可以提高甲殼動(dòng)物的抗應(yīng)激能力，然而筆者研究中顯示在較低濃度維生素添加時(shí)，克氏原螯蝦的存活率、增重率較高，而過(guò)多的維生素添加會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。對(duì)其他水產(chǎn)動(dòng)物的研究中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的現(xiàn)象(吳桂玲等，2008)。這可能是維生素制劑中過(guò)多的維生素E 會(huì)抑制克氏原螯蝦對(duì)其他維生素如維生素A、維生素K的吸收導(dǎo)致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼料中添加兩種免疫增強(qiáng)劑相對(duì)于對(duì)照組，克氏原螯蝦的生長(zhǎng)發(fā)育存在差異。

克氏原螯蝦飼料中添加免疫增強(qiáng)劑的研究還較少。在本研究中，與N0組相比，添加免疫增強(qiáng)劑的飼料可提高克氏原螯蝦的生長(zhǎng)性能和存活率。飼料中添加維生素制劑和中草藥制劑可顯著提高南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)率，同時(shí)降低死亡率(Linan-Cabello 等，2015)。本試驗(yàn)中N1和N4組克氏原螯蝦的特定生長(zhǎng)率較高，達(dá)到了4.24%和4.27%。同時(shí)本試驗(yàn)顯示，兩種免疫增強(qiáng)劑在克氏原螯蝦的生長(zhǎng)中起重要作用，存活率的提高與免疫增強(qiáng)劑的添加有實(shí)質(zhì)性的關(guān)聯(lián)(王蕓等，2012)，可能是免疫增強(qiáng)劑提高了克氏原螯蝦的環(huán)境適應(yīng)能力，減少機(jī)體消耗，從而促進(jìn)了物質(zhì)能量的積累導(dǎo)致(Wang 等，2012)。其中N4組的克氏原螯蝦存活率達(dá)到了最高，說(shuō)明添加劑量過(guò)高或過(guò)低都可能影響克氏原螯蝦的存活率。本試驗(yàn)中，隨著兩種免疫增強(qiáng)劑濃度的提高，AKP酶活性隨之上升，均在最高濃度組達(dá)到最高，而隨著維生素制劑濃度的提高，ACP酶活性呈現(xiàn)先上升、再下降的趨勢(shì)，并在0.02%添加濃度時(shí)達(dá)到最高；SOD 酶活性則在0.01%濃度的維生素制劑添加中達(dá)到最大值。研究表明，在N1組，0.01%濃度的維生素添加量是克氏原螯蝦生長(zhǎng)和免疫的最佳條件。同時(shí)這一結(jié)果也表明，在免疫力強(qiáng)的條件下，特定生長(zhǎng)率也最高。

四、小結(jié)

本研究表明，飼料中添加兩種免疫增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)克氏原螯蝦存活、生長(zhǎng)，同時(shí)提高其免疫力。將克氏原螯蝦的存活率和特定生長(zhǎng)率作為主要考慮因素，綜合考慮免疫能力，建議在本次試驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件中，選擇N1組作為免疫增強(qiáng)劑的最佳濃度，即維生素制劑添加量為0.01%。