介孔TiO2納米粒在聲動(dòng)力學(xué)治療肝細(xì)胞肝癌應(yīng)用的生物相容性評(píng)估

王 希 湯 陽(yáng) 張小龍 徐亞丹 王文平，2△

（1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院超聲科 上海 200032；2復(fù)旦大學(xué)超聲醫(yī)學(xué)與工程研究所 上海 200032）

肝細(xì)胞肝癌是最常見(jiàn)的肝臟惡性腫瘤［1］，其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率、病死率高［2］，許多患者就診時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，高強(qiáng)度聚焦超聲（high intensity focused ultrasound，HIFU）是目前聲波治療此類(lèi)患者的重要手段之一，但對(duì)靶區(qū)周?chē)＝M織及毗鄰重 要 器 官 容 易 造 成 損 傷［3］。 聲 動(dòng) 力 學(xué) 治 療（sonodynamic therapy，SDT）利用聲敏劑對(duì)腫瘤的靶向定位，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)低強(qiáng)度聲波照射部位腫瘤組織的選擇性殺傷及正常組織的保護(hù)［4-5］，是聲波治療實(shí)體瘤的研究新熱點(diǎn)。

優(yōu)秀的聲敏劑不僅能有效殺傷腫瘤，且具備組織無(wú)毒性。傳統(tǒng)有機(jī)類(lèi)（卟啉類(lèi)為代表）聲敏劑穩(wěn)定性、分散性和可修飾性差，很難實(shí)現(xiàn)靜脈給藥，且兼具光敏物質(zhì)的毒性反應(yīng)和不良反應(yīng)。無(wú)機(jī)二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）納米粒作為聲敏劑顯示出理想的穩(wěn)定性和安全性以及優(yōu)秀的殺傷細(xì)胞能力［6］。然而傳統(tǒng)TiO2納米粒具有容易聚集的問(wèn)題［7］，一定程度限制了TiO2納米粒的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其家族新成員介孔TiO2納米粒具有清晰的介孔形貌，其有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化以及表面可修飾性對(duì)實(shí)現(xiàn)特定的納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用打開(kāi)了新窗口［8］。本研究旨在探討介孔TiO2納米粒作為聲敏劑應(yīng)用的安全性，代謝情況以及聲動(dòng)力治療的可行性。

資料和方法

主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備主要試劑：鈦酸四丁酯（TBT），醋酸（HAc），PBS 溶液，去離子水，乙醇，聚乙二醇（NH2-PEG5000）；MTT 試劑盒，2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），HemosILTM試劑盒；新鮮人血漿（上海市血液中心）。儀器設(shè)備：50 mL 水熱反應(yīng)釜，透射電子顯微鏡，Nano ZS90 動(dòng)態(tài)光散射儀，Bio-Tek EL×800 酶標(biāo)儀，ITO US-100型超聲治療儀，熒光顯微鏡IX81，ACL7000 全自動(dòng)血凝分析儀，等離子體原子發(fā)射光譜儀ICP，7170 全自動(dòng)生化分析儀。

制備介孔TiO2納米粒溶劑熱處理預(yù)水解軟模板合成法：將醋酸15 mL 與1 mL 鈦酸四丁酯在水熱釜中充分磁力攪拌后加入0.5 mL 去離子水，150 ℃水熱處理12 h，冷卻至室溫，離心收集產(chǎn)物（13 000 r/min，離心半徑：10 cm，離心時(shí)間：10 min，全文同），分別于乙醇及去離子水中共洗滌3 次，離心收集產(chǎn)物，分散于去離子水中。加入聚乙二醇NH2-PEG5000的去離子水溶液（0.5 mg/mL，100 mL），磁力攪拌48 h 后離心收集并于去離子水中洗滌3 次。

介孔TiO2 納米粒介導(dǎo)聲動(dòng)力學(xué)對(duì)HepG2 細(xì)胞的作用實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TiO2納米粒共培養(yǎng)組、超聲輻照組和SDT 組（聲動(dòng)力治療組）。將HepG2腫瘤細(xì)胞接種至共聚焦專(zhuān)用培養(yǎng)皿，細(xì)胞貼壁后TiO2納米粒共培養(yǎng)組及SDT 組換以50 μg/mL 濃度TiO2納米粒的培養(yǎng)液。繼續(xù)共培養(yǎng)12 h，用PBS 小心沖洗。在4 組共聚焦培養(yǎng)皿中加入DCFH-DA 溶液（調(diào)整終濃度為10 μmol/L），避光靜置20 min。超聲輻照組及SDT 組采用1.5 W/cm2，占空比20%，時(shí)長(zhǎng)60 s 的超聲參數(shù)于培養(yǎng)皿底部（不含氣無(wú)菌耦合劑）對(duì)行超聲輻照。在激光共聚焦熒光顯微鏡下，選擇488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm 發(fā)射波長(zhǎng)觀(guān)察細(xì)胞情況。

將HepG2 腫瘤細(xì)胞（5×103/孔，每孔100 μL）接種至96 孔板中，細(xì)胞貼壁后用梯度濃度（25、50、100、200、400 μg/mL）TiO2納米粒的培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)基。孵育結(jié)束后，用培養(yǎng)液清洗2 次。每孔加入0.6 mg/mL MTT 的培養(yǎng)液，共培養(yǎng)4 h 后棄液加入100 μL DMSO，在Bio-TekEL×800 酶標(biāo)儀上測(cè)試吸光度（λ=490 nm）。細(xì)胞存活情況以百分比表示（n=6）。

介孔TiO2 納米粒靜脈注射安全性評(píng)估TiO2納米粒配制成梯度濃度的PBS 溶液（25、50、100、200、300 和500 μg/mL，n=5）。取50 μL 的混合溶液加入到450 μL 人血漿中，離心后吸取上清液，采用HemosILTM試劑盒，在全自動(dòng)血凝分析儀中，檢測(cè)凝血酶原時(shí)間（prothombin time，PT）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）和活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT），以不加血漿作為空白對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)采用SPF 級(jí)昆明小鼠，將TiO2納米粒配置成生理鹽水溶液，通過(guò)尾靜脈注射給藥，梯度給藥劑量為10、50、150 mg/kg（n=5，0.1 mL/只）。2 周后，用眼球后靜脈采集血液標(biāo)本，部分收集在EDTA K2 抗凝管進(jìn)行全血測(cè)定，部分離心取上清于7170 型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行生化檢測(cè)（血常規(guī)、肝功能、腎功能）。取心、肺、肝、脾、腎組織塊，經(jīng)4%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 厚度切片進(jìn)行HE 染色并觀(guān)察。

介孔TiO2 納米粒代謝分布研究建立人HepG2 裸鼠種植瘤模型：將HepG2 細(xì)胞懸液100 μL（約5×106個(gè)）細(xì)胞接種于Balb/c 裸鼠右側(cè)肩背部皮下，7 天后裸鼠注射部位皮下均出現(xiàn)種植瘤，14 天后瘤體直徑約10 mm 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將TiO2納米粒配置成無(wú)菌生理鹽水溶液，通過(guò)尾靜脈注射給藥，每只劑量50 mg/kg，注射劑量為0.1 mL。昆明小鼠于注射前和注射后24 h、1 周、4 周的時(shí)間點(diǎn)，荷瘤裸鼠于注射前和注射后1、2 、4 、8 、18 及24 h，用頸椎脫位法處死（n=5），取主要器官組織（心、肝、脾、肺、腎）及皮下腫瘤組織（荷瘤裸鼠），分別稱(chēng)重并記錄，放置于王水（濃鹽酸∶濃硝酸=1∶3）中充分消化后，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICPOES）測(cè)定Ti 元素濃度（功率：1.20 kw；等離子氣體流 量：15.0 L/min；霧 化 氣 壓 力：200 kPa；泵 速：15.0 r/min）。最后，采用（組織中Ti 含量/注射劑量）/組織重量，即ID%/g 計(jì)算各器官組織中TiO2納米粒的聚集濃度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組均數(shù)比較用LSD 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

介孔TiO2納米粒理化性質(zhì)通過(guò)N2吸附-解吸技術(shù)明確了其介孔特性，所得BET 比表面積、孔容以及孔徑分別為96 m2/g，0.27 cm3/g 以及3.8 nm（圖1A、B）。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射DLS 分析，高度分散的橢圓形納米粒平均粒徑為124.0 nm，其水溶液顯現(xiàn)出良好的丁達(dá)爾現(xiàn)象，即入射光遇到液體中的粒子發(fā)生了散射現(xiàn)象呈現(xiàn)出均勻光帶，提示納米顆粒在水溶液中符合膠體系的特性（圖1C），PEG 化的納米粒通過(guò)傅立葉變換（fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）紅外光譜分析，在1 500 cm-1光譜范圍區(qū)出現(xiàn)吸收峰，對(duì)應(yīng)Ti-N-O 基團(tuán)的存在（圖1D）。

圖1 介孔TiO2納米粒理化性質(zhì)Fig 1 Physicochemical properties of mesoporous TiO2 nanoparticles

介孔TiO2 納米粒介導(dǎo)聲動(dòng)力學(xué)對(duì)HepG2 細(xì)胞的作用MTT 還原測(cè)試結(jié)果表明，各梯度濃度介孔TiO2納米粒共培養(yǎng)24 h 后，人肝癌HepG2 細(xì)胞的相應(yīng)存活率（n=4）為：99.02%±3.15%（25 μg/mL）、99.85%±7.02% （50 μg/mL） 、97.62%±4.83%（100 μg/mL）、94.14%±6.32%（200 μg/mL）、95.30%±7.86%（400 μg/mL），與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在超聲激活納米粒誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS實(shí)驗(yàn)中，超聲單獨(dú)治療組以及納米粒共培養(yǎng)組中，均未呈現(xiàn)出熒光顯像，而在SDT 組細(xì)胞內(nèi)，觀(guān)察到了DCF 所呈現(xiàn)的綠色熒光，表明在這一組腫瘤細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了大量的ROS（圖2）。相同超聲參數(shù)及納米粒濃度下，MTT 測(cè)試超聲輻照組細(xì)胞存活率為97.05%±2.27%，SDT 組存活率為78.09%±4.42%。

圖2 DCFH-DA 顯影介孔TiO2納米粒介導(dǎo)聲動(dòng)力治療后細(xì)胞內(nèi)ROSFig 2 DCFH-DA showing intracellular ROS by mesoporous TiO2 nanoparticles mediated sonodynamic therapy

介孔TiO2 納米粒靜脈注射安全性評(píng)估測(cè)得PT、FIB 和APTT 見(jiàn)圖3。25、50、100、200、300 和500 μg/mL 濃度的PEG-MTNs 的PT 值（s）分別為16.45±0.06、 16.07±0.11、 16.57±0.06、 16.50±0.10、16.33±0.12、16.13±0.11 和15.70±0.17。FIB值（g/L）的樣品測(cè)值分別為2.52±0.05、2.80±0.04、2.66±0.16、2.66±0.16、2.56±0.06、2.52±0.05 和2.52±0.11。 APTT 值（s）的 樣 品 測(cè) 值 分 別 為32.33±0.05、 32.47±0.06、 33.30±0.17、 33.07±0.23、33.43±0.12、34.03±0.15 和34.43±0.23。各濃度樣品間同一指標(biāo)的測(cè)值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 介孔TiO2納米粒血液凝集實(shí)驗(yàn)Fig 3 Coagulation assay of mesoporous TiO2 nanoparticles

尾靜脈注射介孔TiO2納米粒后2 周內(nèi)，無(wú)動(dòng)物給藥后死亡，小鼠皮膚未發(fā)現(xiàn)明顯破損，未發(fā)現(xiàn)明顯的脫毛現(xiàn)象，小鼠無(wú)異常行為（包括異常的發(fā)聲、呼吸困難，行動(dòng)困難，易激惹或攻擊行為等）。小鼠所有血液學(xué)指標(biāo)和生化指標(biāo)結(jié)果與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。各梯度給藥劑量組的重要臟器組織切片HE 染色結(jié)果顯示，組織結(jié)構(gòu)清晰完整，與對(duì)照組相比較，未發(fā)現(xiàn)明顯差異（圖5）。

圖4 介孔TiO2納米粒靜脈注射后小鼠血常規(guī)及肝腎功能檢測(cè)Fig 4 Hematology，liver and kidney function in mice after intravenous injection of mesoporous TiO2nanoparticles

圖5 介孔TiO2納米粒靜脈注射后小鼠內(nèi)臟切片HE 染色Fig 5 HE staining of mouse visceral sections after intravenous injection of mesoporous TiO2nanoparticles

介孔TiO2 納米粒代謝分布研究ICP-OES 測(cè)定結(jié)果根據(jù)（組織中Ti 含量/注射劑量）/組織重量計(jì)算后，如圖6 所示。介孔TiO2納米粒通過(guò)體循環(huán)濃聚在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)肝脾組織（注射后24 h 達(dá)22.34 %總Ti 量）并在1 個(gè)月內(nèi)逐漸代謝完全（圖6A）。在HepG2 種植瘤裸鼠研究中，肝脾組織在2 h的Ti 含量較1 h 降低（P＜0.05），而4 h 時(shí)呈現(xiàn)明顯上升（P＜0.05），8 h 達(dá)峰（51.32%），隨后出現(xiàn)較大幅度的下降。此外，注射后1 h 腫瘤組織Ti 含量達(dá)到6.74%，并于1 天內(nèi)呈現(xiàn)維持濃度。

圖6 ICP-OES 測(cè)定介孔TiO2納米粒靜脈注射后代謝分布Fig 6 Metabolic distribution of nanoparticles determined by ICP-OES after intravenous injection of mesoporous TiO2nanoparticles

討 論

聲動(dòng)力學(xué)治療是對(duì)腫瘤部位先給予聲敏劑，后用低強(qiáng)度超聲對(duì)腫瘤部位進(jìn)行輻照，產(chǎn)生ROS 從而殺傷腫瘤［5，9］。SDT 研究初期，聲敏劑選擇主要為部分光敏劑，集中在卟啉類(lèi)有機(jī)物［10-11］（5-ALA，ATX-70等），然而其穩(wěn)定性和分散度欠佳，難以通過(guò)增強(qiáng)的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）沉積于腫瘤組織，影響ROS 產(chǎn)能，且常伴隨光照性皮炎等不良反應(yīng)。新近的研究通過(guò)脂質(zhì)體包裹［12-13］、無(wú)機(jī)納米粒攜帶［14-15］、自組裝納米粒［16］為有機(jī)聲敏劑開(kāi)辟了新道路。無(wú)機(jī)TiO2因生物安全性良好近年受到SDT 領(lǐng)域的關(guān)注［6，17］，然而其本身的化學(xué)特性限制了靜脈給藥。

本研究采用新穎的軟模板方法成功合成了具有良好分散度和均一性的橢圓形介孔TiO2納米粒（圖1），其中最低能量原則即具有熱力學(xué)穩(wěn)定性質(zhì)的脫鈦礦二氧化鈦Wulff 結(jié)構(gòu)占據(jù)了主導(dǎo)地位（高達(dá)94%）［18-19］。鈦前驅(qū)體遇水后水解產(chǎn)生鈦的低聚物以及正丁醇，而后凝結(jié)形成Ti-O-Ti 框架。原位形成的醋酸丁酯具有相對(duì)較長(zhǎng)的碳鏈能形成微團(tuán)，與水解/凝結(jié)的鈦低聚物共同形成納米介孔的結(jié)構(gòu)（圖7）。這種有機(jī)/無(wú)機(jī)的自組裝過(guò)程類(lèi)似于傳統(tǒng)無(wú)機(jī)介孔硅的形成過(guò)程［20-21］。通過(guò)非共價(jià)鍵形式連接NH2-PEG5000的氨基和納米粒的Ti，進(jìn)一步改善溶液中的穩(wěn)定性?？梢?jiàn)光（波長(zhǎng)在400～700 nm）透過(guò)納米粒水溶液呈現(xiàn)出的丁達(dá)爾現(xiàn)象（圖1C）提示其水溶液符合膠體系特性，具有高度分散性和理想直徑，為靜脈注射提供了保障。

圖7 介孔TiO2納米粒合成機(jī)制及微結(jié)構(gòu)Fig 7 Mesoporous TiO2 nanoparticles nanoparticle synthesis mechanism and microstructure

在聲動(dòng)力療法抗腫瘤的眾多機(jī)制理論［5，9］中，超聲空化作用產(chǎn)生ROS 被廣泛認(rèn)可。超聲能激活有機(jī) 類(lèi) 聲 敏 劑 在 腫 瘤 細(xì) 胞 內(nèi) 產(chǎn) 生ROS［10，22-23］，上 調(diào) 凋亡相關(guān)蛋白（如Bax、Caspase-9 等）［24］，損壞線(xiàn)粒體，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用熒光探針DCFH-DA 進(jìn)行ROS 測(cè)定。1.5 W/cm2、占空比20%、時(shí)長(zhǎng)60 s 的超聲參數(shù)下，超聲輻照組細(xì)胞存活率為97.05%±2.27%，證明了該參數(shù)對(duì)細(xì)胞的安全性，而在加入納米 粒（50 μg/mL）后，存 活 率 下 降 至78.09%±4.42%，表明該參數(shù)能誘導(dǎo)納米粒損傷細(xì)胞，而非超聲熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)殺傷細(xì)胞。當(dāng)探針與HepG2細(xì)胞共孵育時(shí)，DCFH-DA 穿過(guò)細(xì)胞膜水解成DCFH 滯留于細(xì)胞內(nèi)，后進(jìn)行超聲輻照即刻觀(guān)察。所有組別中僅SDT 組的細(xì)胞內(nèi)觀(guān)察到了綠色熒光（DCFH 被ROS 轉(zhuǎn)化成了DCF），表明納米粒能大量進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮聲敏作用產(chǎn)生ROS。超聲輻照所產(chǎn)生的空化效應(yīng)能介導(dǎo)聲光觸發(fā)和熱解反應(yīng)，進(jìn)一步激活具有半導(dǎo)體性質(zhì)的TiO2納米粒，使之從高電子能的價(jià)帶產(chǎn)生電子（e-）形成低電子能的導(dǎo)帶，造成價(jià)帶出現(xiàn)電子空穴（h+）。電子（e-）和電子空穴（h+）進(jìn)一步與溶解的氧分子及水分子進(jìn)行反應(yīng)，從 而 產(chǎn) 生 具 有 毒 性 的ROS（O2-、HO2和OH）［6，16-17］。近年TiO2抗腫瘤的研究也印證了ROS理論［25-27］。此外，粒徑（124 nm）大小使其本身成為了空化核，增加超聲聲能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)沉積從而局部增強(qiáng)SDT 作用，幾種因素產(chǎn)生的大量ROS 在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)直接損傷細(xì)胞。

聲敏劑不僅要求高ROS 產(chǎn)能，還應(yīng)具有良好的生物相容性，其化學(xué)特性、藥代動(dòng)力學(xué)特征都是SDT 療 效 的 關(guān) 鍵［28］。共 培 養(yǎng) 實(shí) 驗(yàn) 中，在 最 高400 μg/mL 納米粒濃度條件下，細(xì)胞存活率依然高達(dá)95.30 %，表明位于胞質(zhì)中的納米粒沒(méi)有對(duì)細(xì)胞器產(chǎn)生損傷，印證了其無(wú)毒或極低毒性的特性。

為確保靜脈途徑給藥，血液相容性評(píng)估尤為重要。本研究將APTT 作為內(nèi)源性凝血因子缺乏的篩選試驗(yàn)，PT 反映外源性凝血系統(tǒng)情況，F(xiàn)IB 反映纖維蛋白原的含量。所有指標(biāo)在各納米粒濃度組間無(wú)明顯差異，表明沒(méi)有激活凝血途徑，對(duì)血漿的凝血/抗凝性能沒(méi)有明顯影響。部分介孔材料由于比表面積大，吸附容量高而易引起凝血。本研究合成的納米粒比表面積小，預(yù)先PBS 浸潤(rùn)減少吸附，均有效降低凝血的激活。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)小鼠血液系統(tǒng)（三系情況）和生化指標(biāo)（肝，腎功能），以及主要臟器HE 染色觀(guān)察來(lái)全面評(píng)估靜脈注射后的生物安全性。靜脈注射2 周內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)動(dòng)物死亡，呼吸困難或行為異常。血液生化指標(biāo)與對(duì)照組間均無(wú)顯著差異，組織切片觀(guān)察沒(méi)有異常（圖3、4），證實(shí)了介孔TiO2納米粒靜脈注射的生物安全性，蓄積于臟器的納米粒對(duì)正常細(xì)胞較為安全。

我們從納米粒藥代分布研究結(jié)果推測(cè)納米粒通過(guò)靜脈進(jìn)入體循環(huán)后，2 h 時(shí)已有部分代謝，而4 h時(shí)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)通過(guò)血液循環(huán)攔截了身體其他部分代謝的納米粒而呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。此外，注射后1 h 腫瘤組織Ti 含量達(dá)到6.74%，并于1 天內(nèi)呈現(xiàn)維持濃度，證實(shí)納米粒能通過(guò)靜脈途徑有效蓄積于腫瘤組織。由此，找準(zhǔn)組織低濃度、腫瘤高濃度的時(shí)間窗為SDT 的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本研究采用軟模版方法合成了介孔TiO2納米顆，系統(tǒng)性證實(shí)了其無(wú)毒性和靜脈注射安全性，并從藥物代謝特點(diǎn)為SDT 應(yīng)用找到時(shí)間窗口。介孔結(jié)構(gòu)賦予其進(jìn)一步作為藥物載體與SDT 協(xié)同抗腫瘤作用的潛能，為基于TiO2的生物納米系統(tǒng)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了一條新的道路。

作者貢獻(xiàn)聲明 王希 構(gòu)思和設(shè)計(jì)，文獻(xiàn)調(diào)研，可行性分析，構(gòu)建模型，數(shù)據(jù)分析和保存，繪制圖表，獲取資助，完成實(shí)驗(yàn)，論文撰寫(xiě)和修訂。湯陽(yáng)，張小龍，徐亞丹 文獻(xiàn)調(diào)研和整理，數(shù)據(jù)搜集，執(zhí)行實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建模型，繪制圖表。王文平 構(gòu)思和設(shè)計(jì)，可行性分析，監(jiān)督指導(dǎo)，獲取資助，論文修訂。

利益沖突聲明 所有作者均聲明不存在利益沖突。