巴豆生物堿對(duì)Lewis小鼠肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的影響及機(jī)制研究*

武曉，谷勤勤，于淼淼，劉鳳娟，孫榮麗

（青島大學(xué)附屬青島市中心醫(yī)院1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2.病理科，3.放射科，山東青島 266042）

肺癌已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的重大疾病之一，主要采取多學(xué)科綜合治療模式，而中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌是我國(guó)的特色[1]。中藥抗肺癌的研究越來(lái)越多[2]，其中巴豆就是一種用于抗癌的中草藥[3-4]，查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，巴豆生物堿（CA）是巴豆提取物的一種，CA 對(duì)于胃癌、卵巢癌、腸癌等癌癥均有抗癌作用[5-6]，但有關(guān)CA 抗肺癌作用的報(bào)道較少，前期的初步研究發(fā)現(xiàn)CA 具有較好的體內(nèi)暴露量，能夠抑制肺癌的生長(zhǎng)，但具體的作用機(jī)制尚不明確，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于CA 體內(nèi)對(duì)肺癌細(xì)胞的作用機(jī)制及對(duì)腫瘤相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響的相關(guān)研究報(bào)道。那么CA 作用于體內(nèi)是否可抗肺癌？是否通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抗癌？具體機(jī)制是什么？為此本研究在前期體外試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（Lewis 肺腺癌小鼠），進(jìn)一步探討CA 對(duì)肺腺癌生長(zhǎng)和凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lewis 小鼠肺腺癌細(xì)胞（Lewis mouse-derived lung adenocarcinoma cells, LLC）由上海中國(guó)科學(xué)院提供；SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠，4～6 周齡，雄性，體重25～30 g，共50 只，由重慶恩斯維爾生物科技有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、水合氯醛、無(wú)水乙醇等購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；凋亡試劑盒及各引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；CA 購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)；順鉑購(gòu)自德州德藥制藥有限公司；PrimeScript RT試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon 有限公司；電子分析天平購(gòu)自瑞士Precisa 公司；生物組織自動(dòng)包埋機(jī)、生物組織烤片機(jī)、DM500 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica 公司。

1.3 方法

1.3.1 藥物配制及分組將20 mg 順鉑溶于5 mL生理鹽水，即4 mg/mL，按照75 mg/m2給藥。CA 原液濃度為200 μg/ml，分別按照低劑量0.6 mg/kg、中劑量1.2 mg/kg 和高劑量2.4 mg/kg 對(duì)小鼠注射。將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量CA 組、中劑量CA組、高劑量CA 組及順鉑組。對(duì)照組不注射任何藥物；低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組分別按0.6 mg/kg、1.2 mg/kg 和2.4 mg/kg 的劑量注射CA 注射液；順鉑組按75 mg/m2的劑量經(jīng)腹腔注射順鉑溶液。

1.3.2 小鼠成瘤及瘤體測(cè)量①小鼠皮下接種。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成濃度為5×107個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，按照分組進(jìn)行接種，每只小鼠于右腋皮下緩慢接種200 μL 細(xì)胞懸液，拔針后迅速用針頭將細(xì)胞聚集，以防止細(xì)胞液外漏。②成瘤觀察與測(cè)量。皮下接種成功后，每天觀察小鼠的精神狀況，形成腫瘤后，每2 天測(cè)量1 次腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，并計(jì)算腫瘤的體積（腫瘤體積=0.52×短徑×長(zhǎng)徑2）。③生存狀態(tài)的觀察。每天下午3 點(diǎn)記錄小鼠的進(jìn)食量（先設(shè)定每組固定進(jìn)食量為50 g），期間再觀察小鼠的精神、活動(dòng)狀態(tài)，以及小鼠的毛色和光澤度等一般狀況。④差異化處理。接種細(xì)胞1 周后即第8 天開(kāi)始按照之前的分組腹腔注射給藥，⑤腫瘤抑瘤率測(cè)定：剝?nèi)∧[瘤后稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率（抑瘤率=1-藥物組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重×100%）。

1.3.3 腫瘤病理切片的制備及蘇木精-伊紅染色先用二甲苯溶解烘烤完畢組織切片上殘留的石蠟，然后按以下順序進(jìn)行梯度水化：無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇分化，稀氨水返藍(lán)，伊紅染色，自來(lái)水洗去浮色后，可于光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。之后，按照80%、90%、95%乙醇，無(wú)水乙醇2 次，二甲苯2 次的順序進(jìn)行脫水，最后用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。

1.3.4 qRT-PCR 法檢測(cè)Survivin、Caspase-3、Bax、YAP mRNA 相對(duì)表達(dá)量提取細(xì)胞總RNA：細(xì)胞孔板中加300 μL Trizol，轉(zhuǎn)入EP 管中，加入氯仿（0.2 mL），待轉(zhuǎn)為粉色時(shí)，靜置5 min，13 000 r/min離心15 min，吸取上清液至新EP 管，加入0.5 mL異丙醇，靜置10 min，離心棄上清液，加入75%乙醇1 mL，離心干燥EP 管中沉淀，溶解沉淀，溶解總RNA（55～60℃水浴5 min），檢測(cè)RNA 濃度和純度。RNA 質(zhì)量測(cè)定：用DEPC 空白調(diào)零，吸取2 μL溶解后的總RNA 加入上樣孔，檢測(cè)光密度（OD）值，當(dāng)OD 值介于1.8～2.0 之間（260/280），RNA純度好。使用PrimeScript RT 試劑盒（TaKaRa，Shiga，日本）將每個(gè)樣品的1 mg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)上海生工基因庫(kù)設(shè)計(jì)引物和探針。qRT-PCR 反應(yīng)條件：50℃預(yù)變性2 min，95℃變性4 min，54℃再變性15 s，72℃退火5 s，83℃延伸15 s，最后，在72～95℃（0.5℃增量）下熔解，每個(gè)步驟熔解5 s。每個(gè)樣本以GAPDH為內(nèi)參基因，將每個(gè)樣本的閾值周期（Ct）歸一化，每個(gè)樣本都是重復(fù)檢測(cè)的。按照2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，通過(guò)每組3 個(gè)樣本的幾何平均值得到各基因的最終相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western blotting檢測(cè)Survivin、Caspase-3、Bax、YAP 蛋白相對(duì)表達(dá)量Loading buffer 提取蛋白，RIPA 裂解液裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)入EP 管中離心，置入-80℃冰箱冷凍保存。蛋白濃度測(cè)定及預(yù)變性：將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，加BCA 工作液，混勻，37℃孵育30 min；測(cè)定562 nm的OD 值，計(jì)算樣品蛋白濃度。根據(jù)分子量大小選擇濃度，配制分離膠混勻后灌膠，異丙醇液封壓膠，靜置30 min，棄掉異丙醇，濾紙吸干，加濃縮膠，插入梳子，靜置1 h。每組樣本各取10 μg 總蛋白與15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后應(yīng)用80 V 恒壓轉(zhuǎn)膜120 min，封閉1 h，TBST 洗滌3 次；將PVDF 膜剪成條帶放入孵育皿中（按目的蛋白和Marker 分子量大?。鲜? 種抗體及內(nèi)參GAPDH以1∶1 000 4℃搖床上孵育，次日TBST 洗滌3 次，加入羊抗兔二抗孵育1 h，棄二抗，TBST 洗滌3 次。壓片，調(diào)整曝光時(shí)間，將X 射線片放入顯影液中，出現(xiàn)條帶后放入定影液中，取出X 射線片，風(fēng)干，掃描圖片保存，采用Image J 軟件分析灰度值。以目的蛋白條帶與GAPDH 條帶灰度值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺癌LLC細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

光學(xué)顯微鏡低倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，小鼠LLC細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長(zhǎng)，有些細(xì)胞呈圓形、梭形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。見(jiàn)圖1。

圖1 LLC細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) （光學(xué)顯微鏡×100）

2.2 CA 對(duì)LLC 細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠成瘤及一般狀況的影響

至取材之日，低劑量CA 組、高劑量CA 組及對(duì)照組各有1 只小鼠死亡；中劑量CA 組死亡2 只，順鉑組死亡3 只。模型復(fù)制1 周后，各組小鼠長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的腫瘤組織，各組小鼠在模型復(fù)制2 周左右開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的脫毛，食欲不振，毛發(fā)干枯，不喜動(dòng)，有的小鼠出現(xiàn)明顯消瘦等情況，尤以順鉑組小鼠最為明顯。而高劑量CA 組和低劑量CA 組小鼠脫毛、食欲不振及活動(dòng)敏感度下降等情況比順鉑組好，毛色比順鉑組組有光澤。

2.3 CA對(duì)LLC細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠成瘤體積的影響

對(duì)照組、低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組及順鉑組的腫瘤體積分別為（4.09±0.24）cm3、（3.09±0.58）cm3、（2.91±0.64）cm3、（2.59±0.89）cm3和（1.98±1.04）cm3，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.652，P=0.010）。進(jìn)一步兩兩比較，對(duì)照組腫瘤體積大于低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組（P<0.05）；順鉑組腫瘤體積小于低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組（P<0.05）；高劑量CA 組腫瘤體積小于低劑量CA 組和中劑量CA 組（P<0.05）。各組腫瘤體積隨劑量增加體積逐漸縮小，對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)最快，順鉑組腫瘤生長(zhǎng)最慢。

2.4 CA對(duì)瘤重及抑瘤率的影響

對(duì)照組、低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組及順鉑組瘤重比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組及順鉑組腫瘤重量逐漸減少，對(duì)照組瘤重最大，順鉑組瘤重最小。低劑量CA 組、中劑量CA 組、高劑量CA 組及順鉑組的抑瘤率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各組抑瘤率依次升高，順鉑組腫瘤生長(zhǎng)最慢（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組瘤重、抑瘤率的比較

2.5 各組小鼠LLC細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組：細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，發(fā)現(xiàn)大量腫瘤細(xì)胞，核質(zhì)粗、深染，核仁明顯，核分裂象多見(jiàn)，可見(jiàn)大量細(xì)胞壞死，但細(xì)胞凋亡不明顯（見(jiàn)圖2）。低劑量組：細(xì)胞凋亡比例較低，但有凋亡現(xiàn)象，大部分細(xì)胞為壞死細(xì)胞（見(jiàn)圖3）。中劑量組：細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象均可見(jiàn)（見(jiàn)圖4）。高劑量組：可見(jiàn)細(xì)胞壞死，凋亡現(xiàn)象多，間質(zhì)可見(jiàn)紅細(xì)胞滲出，細(xì)胞分裂象減少，可見(jiàn)散在許多凋亡小體（見(jiàn)圖5）。順鉑組：可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，可見(jiàn)形成的凋亡小體，細(xì)胞質(zhì)深嗜伊紅，細(xì)胞核濃染（見(jiàn)圖6）。

圖2 對(duì)照組LLC細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)

圖3 低劑量組LLC細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)

圖4 中劑量組LLC細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)

圖5 高劑量組LLC細(xì)胞病理學(xué)

圖6 順鉑組LLC細(xì)胞病理學(xué)形態(tài)

2.6 各組LLC 細(xì)胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA 相對(duì)表達(dá)量的比較

對(duì)照組、低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組LLC 細(xì)胞Survivin、Caspase-3、Bax mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，對(duì)照組Survivin mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于不同劑量CA 組（P<0.05），低劑量CA 組Survivin mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于中劑量CA 組和高劑量CA 組（P<0.05）。對(duì)照組Caspase-3、Bax mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于不同劑量CA 組（P<0.05），低劑量CA 組Caspase-3 、Bax mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于中劑量CA 組和高劑量CA 組（P<0.05）。各組YAP mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組LLC細(xì)胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表3 各組LLC細(xì)胞Survivin、Caspase-3、Bax及YAP mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與低劑量CA組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組低劑量CA組中劑量CA組高劑量CA組F 值P 值YAP mRNA 1.613±0.247 1.229±0.037 1.381±0.207 1.484±0.195 3.019 0.128 Survivin mRNA 3.148±0.211 2.618±0.065①1.590±0.025①②1.304±0.098①②28.532 0.009 Caspase-3 mRNA 1.754±0.102 2.601±0.278①3.629±0.086①②3.861±0.088①②16.413 0.018 Bax mRNA 2.241±0.101 3.451±0.191①5.309±0.156①②6.182±0.050①②6.409 0.014

2.7 各組LLC 細(xì)胞Survivin、Caspase-3、Bax 及YAP蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

對(duì)照組、低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組Survivin、Caspase-3、Bax 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，對(duì)照組Survivin 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組（P<0.05），低劑量CA 組Survivin 蛋白相對(duì)表達(dá)量高于中劑量CA組和高劑量CA 組（P<0.05）。對(duì)照組Caspase-3、Bax 相對(duì)表達(dá)量低劑量CA 組、中劑量CA 組及高劑量CA 組（P<0.05），低劑量CA 組Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量低于中劑量CA 組和高劑量CA 組（P<0.05）。各組YAP 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組LLC細(xì)胞中Survivin、Caspase-3、Bax及YAP蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

表4 各組LLC細(xì)胞中Survivin、Caspase-3、Bax及YAP蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05；②與低劑量CA組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組低劑量CA組中劑量CA組高劑量CA組F 值P 值YAP蛋白1.113±0.047 1.166±0.068 1.043±0.032 1.101±0.079 3.391 0.110 Survivin蛋白0.892±0.0349 0.706±0.087①0.451±0.032①②0.319±0.025①②18.532 0.016 Caspase-3蛋白0.251±0.055 0.480±0.047①1.005±0.034①②1.298±0.094①②22.413 0.009 Bax蛋白0.243±0.045 0.295±0.089①0.631±0.056①②0.882±0.096①②16.409 0.018

3 討論

肺癌目前仍是最常見(jiàn)的腫瘤之一[7]，其發(fā)病率和病死率均占腫瘤死亡患者的前位，2019年國(guó)家癌癥中心關(guān)于惡性腫瘤流行情況分析報(bào)告指出肺癌的發(fā)病率和病死率仍居榜首，中國(guó)每年約有6 萬(wàn)患者因肺癌死亡[8]。最近研究表明，中藥能在腫瘤的整個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要的預(yù)防和治療作用。中藥在預(yù)防和治療肺癌中有自己的優(yōu)勢(shì)[9-10]。巴豆是一種流傳于民間，用于抗癌的中草藥，民間早已應(yīng)用巴豆的提取物治療惡性腫瘤，但關(guān)于巴豆提取物的具體抗癌機(jī)制研究較少。近年來(lái)，對(duì)巴豆及其提取物抗腫瘤作用機(jī)制的最新研究進(jìn)展主要集中在以下幾個(gè)方面：①影響膜系統(tǒng)分子動(dòng)力學(xué)[11]；②誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡：如CA 會(huì)抑制人卵巢癌細(xì)胞（HO-8910）的增殖，使其發(fā)生細(xì)胞凋亡[12]；③可誘導(dǎo)腫瘤分化和抗氧化、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[13]；④可改變癌細(xì)胞的胞漿結(jié)構(gòu)和破壞癌細(xì)胞的微管等[14]。以上機(jī)制相互影響相互作用，起到抗腫瘤作用。

目前肺腺癌發(fā)病率最高[15]，筆者前期已經(jīng)進(jìn)行了CA 對(duì)肺腺癌A549 細(xì)胞凋亡機(jī)制的體外實(shí)驗(yàn)研究，本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討CA 對(duì)肺腺癌生長(zhǎng)的作用及具體的凋亡機(jī)制。本研究首先從復(fù)制動(dòng)物模型開(kāi)始，因小鼠的肺臟在分子特點(diǎn)、組織形態(tài)等方面與人類(lèi)相似，而且兩者的基因有90%以上同源性，所以復(fù)制小鼠肺腺癌模型更具有意義。本實(shí)驗(yàn)選用LLC 細(xì)胞，主要是由于LLC 腫瘤細(xì)胞來(lái)源于C57BL/6 小鼠的自發(fā)性肺腫瘤。將其接種于C57B/6 小鼠皮下，具有同種移植、成瘤率高、且生長(zhǎng)較快等優(yōu)點(diǎn)。本研究分兩部分進(jìn)行。第一部分為CA 對(duì)Lewis 小鼠肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究：實(shí)驗(yàn)結(jié)果順鉑組小鼠死亡數(shù)目最多，可能是因?yàn)榛熕幬锔弊饔锰螅荒苣褪芩?。順鉑組小鼠腫瘤生長(zhǎng)雖然比對(duì)照組、低劑量CA 組、中劑量CA組、高劑量CA 組速度明顯減慢，但出現(xiàn)體重下降，食欲差的現(xiàn)象，與臨床上順鉑化療后出現(xiàn)消化道副作用相符，可見(jiàn)順鉑對(duì)患者身體素質(zhì)要求高，使用較局限。不同CA 組可抑制腫瘤生長(zhǎng)速度，雖不如順鉑組明顯，但小鼠生活狀態(tài)良好。說(shuō)明CA 更能提高生活總體質(zhì)量。通過(guò)瘤重、瘤體體積及抑瘤率，發(fā)現(xiàn)CA 對(duì)Lewis 小鼠肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，且隨著CA 濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，說(shuō)明CA 可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并與CA 濃度相關(guān)。繼續(xù)增加CA 劑量后是否抑瘤效果更好？副作用更大？這一點(diǎn)可以通過(guò)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，隨CA 濃度的升高，腫瘤細(xì)胞凋亡率不斷增加，但均沒(méi)有順鉑組凋亡率高，說(shuō)明CA 對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用不如順鉑組，但副作用較小。結(jié)果提示，在不能完全耐受順鉑治療的患者中，可以嘗試應(yīng)用CA 進(jìn)行聯(lián)合治療，減少順鉑用量，以減輕副作用。為進(jìn)一步明確CA 通過(guò)何種途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)，本研究通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討其具體凋亡機(jī)制。

凋亡有內(nèi)源性和外源性凋亡途徑[16]，內(nèi)源性途徑在細(xì)胞凋亡中起到?jīng)Q定性作用[17]。Bax 屬于Bax亞家族之一，具有促凋亡作用，在凋亡過(guò)程中扮演重要角色[18]；Survivin 是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子[19]；Caspase-3 是一種終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20]， 且Survivin 是Caspase-3 的直接抑制劑[21]；Hippo-YAP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞中調(diào)節(jié)各類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡[22-23]。本研究Survivin mRNA 在不同劑量CA組中的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，CA 劑量越高，Survivin mRNA 的相對(duì)表達(dá)量越低；而B(niǎo)ax mRNA 和Caspase-3 mRNA 在不同劑量CA 組中的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，CA 劑量越高，Bax mRNA 和Caspase-3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量越高；筆者猜測(cè)CA 對(duì)Lewis 小鼠肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制與Bax 和Caspase-3 表達(dá)上調(diào)及Survivin 表達(dá)下調(diào)從而抑制細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)；YAP 在各組中變化不明顯，Hippo-YAP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不是CA 引起Lewis 小鼠細(xì)胞凋亡的主要通路，有可能是本研究的樣本量太少，有待于進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行研究。

綜上，CA 可誘導(dǎo)Lewis 小鼠肺癌細(xì)胞凋亡，其可能的機(jī)制可能是因?yàn)镾urvivin 是Caspase-3 的直接抑制劑，Survivin 和Bcl-2 可能具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的共同途徑，CA 抑制了Survivin 的表達(dá)，從而使得Survivin 對(duì)Caspase-3 蛋白的抑制作用減弱，使得Caspase-3 的剪切增強(qiáng)，由于CA 可使Bax 表達(dá)增強(qiáng)，其與線粒體體外膜結(jié)合，將Cyt-c 釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與其他細(xì)胞因子結(jié)合形成凋亡小體并募集和激活Caspase-3 蛋白，從而誘導(dǎo)Caspase 級(jí)聯(lián)效應(yīng)并因此促進(jìn)細(xì)胞凋亡，起到抗腫瘤生長(zhǎng)的作用。參與肺腺癌的凋亡相關(guān)因子眾多[24-25]，如β-抑制蛋白2 基因，鈣結(jié)合蛋白家族成員S100A6基因等，本研究?jī)H從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步探討CA 引起肺腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，以及阻止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，同時(shí)涉及多個(gè)分子和信號(hào)通路。僅用一個(gè)方面說(shuō)明或評(píng)估肺腺癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制無(wú)說(shuō)服性，需要更深一步探討，筆者認(rèn)為可在此基礎(chǔ)上運(yùn)用高通量測(cè)序等高水平檢測(cè)方法，進(jìn)一步研究參與凋亡的其他凋亡蛋白和信號(hào)通路，以明確起最主要作用的凋亡蛋白和信號(hào)通路，為肺腺癌治療提供新的思路。