基于CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建Plcz1 基因敲除小鼠模型

曹彬彬蔡 瑤王寶珠饒 喻王 超茍克勉王 濤?

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚(yáng)州 225009)

生殖能力下降是人和動(dòng)物共同面臨的健康問題,不僅對畜牧業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失,而且對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。 因此,尋找動(dòng)物生殖過程中關(guān)鍵的調(diào)控基因,探討其生殖發(fā)生過程中的調(diào)控機(jī)制成為該領(lǐng)域內(nèi)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。 在過去的半個(gè)多世紀(jì)里,許多在動(dòng)物生殖過程中發(fā)揮重要作用的精子因子相繼被發(fā)現(xiàn),在動(dòng)物發(fā)生受精時(shí),精子中的某些因子會(huì)通過融合孔進(jìn)入卵母細(xì)胞胞質(zhì)中,啟動(dòng)卵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放系統(tǒng),從而激活卵母細(xì)胞[1]。 研究發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物受精的特征是在精子-卵子融合后,卵子內(nèi)持續(xù)2~4 h 不同程度的Ca2+振蕩[2],該過程是恢復(fù)第一次減數(shù)分裂和胚胎發(fā)育的前提,同時(shí)還阻止多精入卵的發(fā)生[3]。

磷脂酶C zeta(PLCζ)是Saunders 等[4]在研究小鼠睪丸中PLC 時(shí)發(fā)現(xiàn)的新亞型,隨后證實(shí)PLCζ不僅存在于睪丸中,并且擁有其他亞型中的基本結(jié)構(gòu)域。 該蛋白結(jié)構(gòu)域由4 個(gè)位于N 端的EF 手型結(jié)構(gòu)域、位于中心的特征性X 和Y 催化域以及碳基端的C2 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[5]。 其中EF 手型區(qū)域?qū)Φ蜐舛菴a2+敏感,使PLCζ 在靜息狀態(tài)的Ca2+水平具有活性。 通過C2 結(jié)構(gòu)域與PI(3)P、PI(5)P 或一種未知的膜蛋白相互作用可能實(shí)現(xiàn)PLCζ 與特定囊泡膜的結(jié)合[6],帶正電的XY 連接區(qū)與第一個(gè)EF 手型結(jié)構(gòu)域相互作用,催化XY 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行PIP2的酶促水解,生成三磷酸肌醇(IP3)[7],促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放, 進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) Ca2+振蕩的發(fā)生[8]。Saunders 等[4]將PLCζ 功能受到抑制的精子注入卵母細(xì)胞中,發(fā)現(xiàn)Ca2+的振蕩不明顯,而將完整的PLCζ cRNA 注入小鼠卵母細(xì)胞后產(chǎn)生了與正常體外受精相類似的Ca2+振蕩現(xiàn)象,表明PLCζ 介導(dǎo)的Ca2+振蕩在體外受精過程中發(fā)揮重要作用。 研究顯示,在牛[9]、雞[10]和豬[11]等家畜中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PLCζ基因。

體外授精實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Plcz1基因缺陷的精子會(huì)導(dǎo)致小鼠受精失敗,進(jìn)而導(dǎo)致不育,最近研究發(fā)現(xiàn),在缺失PLCζ 蛋白的情況下,自然交配的小鼠也會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)受精產(chǎn)生后代,但產(chǎn)仔數(shù)明顯下降[12]。因此,自然受精的情況下Plcz1基因缺陷雄鼠是否具有生育能力尚未完全闡明。 本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建Plcz1-/-小鼠模型,并對Plcz1-/-小鼠進(jìn)行擴(kuò)繁和基因型鑒定,探討Plcz1基因在雄性小鼠生育過程中的作用,為解決Plcz1基因突變帶來的生殖能力障礙提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級C57BL/6 雄鼠6 只,8~12 周齡,體重23~28 g;SPF 級C57BL/6 雌鼠12 只,4~8 周齡,體重14~22 g;SPF 級ICR 雄鼠3 只,10 周齡,體重32~37 g;SPF 級ICR 雌鼠3 只,10 周齡,體重30~35 g,均購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心[SCXK(蘇)2017-0007],實(shí)驗(yàn)操作在揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)大樓的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK(蘇)2017-0044]。 實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心的SPF 級動(dòng)物房,光照周期采用5:00 am~7:00 pm,環(huán)境溫度控制在20℃~25℃,自由飲水、進(jìn)食,每周更換1 次墊料。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審核由揚(yáng)州大學(xué)審批(NSFC2020-SYXY-20),并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

pX330A-1x2、pX330S-2 載體購自Addgene;限制性內(nèi)切酶BpiⅠ(批號:10020723)、T4 DNA 連接酶(批號:10037474)及限制性內(nèi)切酶Eco31I(批號:0431712)購自New England Biolabs 公司;2×Es Taq MasterMix(Dye)(批號:01031/50351)、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(批號:50525)及高純度質(zhì)粒小提試劑盒(批號:50433)購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司;EndoFree Plasmid Maxi Kit(批號:163013537)購自QIAGEN;普通瓊脂糖(批號:EZ6688C178)購自賽國生物科技有限公司;純化試劑盒(批號:123722)購自 MP Biomedicals; DL2000 marker ( 批 號:AKF0781A)購自TaKaRa Bio;Spe 抗生素(批號:EB15BA0006)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

T100 Thermal Cycler PCR 儀購自美國Bio-Rad公司;ABI PCR 儀miniAmp 及ABI 經(jīng)典型PCR 儀2720 購自美國Thermo Fisher 公司;天能1600 型凝膠成像+電腦、HE-90 電泳槽購自上海天能生物科技有限公司;恒溫水浴鍋購自寧波新芝生物科技有限公司;臺(tái)式冷凍離心機(jī)5424R、臺(tái)式離心機(jī)5424、微型離心機(jī)MiniSpin 購自德國Eppendorf 公司;ZHTY-50 N 恒溫振蕩培養(yǎng)箱購自上海知楚儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 設(shè)計(jì)sgRNA 及sgRNA 雙鏈合成

從NCBI(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查詢到C57BL/6 小鼠的Plcz1基因的序列(NM_054066.4),由于第一個(gè)外顯子不存在氨基酸,因此本試驗(yàn)從第二個(gè)外顯子開始統(tǒng)計(jì)外顯子數(shù)量并標(biāo)記的。 通過張峰sgRNA 設(shè)計(jì)的網(wǎng)站(http:/ /crispr.mit.edu/)在第6、7 外顯子上選擇sgRNA 靶點(diǎn)序列,選擇出得分較高的2 條sgRNA,并在其兩端添加限制性內(nèi)切酶BpiⅠ酶切位點(diǎn),由擎科有限公司合成(如表1 所示)。 其中,如圖1 所示的基因敲除示意圖,Plcz1-sgRNA6 位于Plcz1基因第6 外顯子,Plcz1-sgRNA7 位于Plcz1基因第7 外顯子。

表1 Plcz1 基因sgRNA 寡核苷酸鏈Table 1 SgRNA oligonucleotide chain of Plcz1 gene

將合成的上游引物和下游引物各8 μL、Taq DNA Polymerase Buffer 4 μL 在PCR 管中混合,進(jìn)行PCR 退火反應(yīng):99℃ 10 min,16℃ 10 min。

1.3.2 pX330-sgRNA 重組載體的構(gòu)建

將退火的寡核苷酸分別插入pX330A 和pX330S 載體,反應(yīng)體系共2 μL:25 ng/μL pX330A/S 載體0.3 μL,10 μmol/L 退火的寡核苷酸0.5 μL,10×T4 DNA 連接酶緩沖液0.2 μL,BpiI 0.1 μL,T4 DNA 連接酶0.1 μL,無菌蒸餾水0.8 μL。 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng):37℃ 5 min,16℃ 10 min 進(jìn)行3 個(gè)循環(huán),循環(huán)反應(yīng)后,在37℃下進(jìn)行額外的BpiI 酶消化1 h, 即得到連接產(chǎn)物 pX330A-1x2-sgRNA6 與pX330S-2-sgRNA7,用于后續(xù)步驟。

1.3.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

取冷凍的感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中,待感受態(tài)細(xì)胞在冰上融化后,在超凈臺(tái)中向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入連接產(chǎn)物,用移液器輕輕吹打混勻,置于冰上30 min。 42℃熱擊90 s,迅速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中,冰上靜置2 min。 在超凈臺(tái)里向每個(gè)離心管中加入700 μL 無菌的LB 培養(yǎng)基,不含抗生素,混勻后置于37℃搖床,220 r/min 振蕩培養(yǎng)1 h 使菌體復(fù)蘇。 在超凈臺(tái)中取50 μL 已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞,加到含Amp 或者Spe 抗生素的LB 固體瓊脂培養(yǎng)基上,用無菌的涂布棒將菌液均勻涂開,直至干燥,倒置平板,37℃ 12~16 h 培養(yǎng)。

1.3.4 質(zhì)粒的提取與鑒定

用滅菌過后的槍頭挑取上述培養(yǎng)出的單菌落,接種于5 mL Amp 或Spe 抗生素的LB 液體瓊脂培養(yǎng)基置于37℃搖床,220 r/min 振蕩培養(yǎng)10~12 h。在超凈臺(tái)中保菌,余下菌液用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,取過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管(自備)中,13000 r/min 離心30 s 收集菌體沉淀,盡量吸棄上清。 向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μL 含RNase A 的Buffer P1,使用渦旋振蕩器充分混勻,懸浮菌體沉淀。 加入250 μL Buffer P2,輕輕地上下顛倒混勻6 次,充分混勻使菌體裂解,此時(shí)溶液應(yīng)變得清亮粘稠。 加入350 μL Buffer N3,立即輕柔地上下顛倒混勻10 次,充分混勻,此時(shí)應(yīng)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。 13000 r/min 離心5 min。 將所得的上清液轉(zhuǎn)移到已裝入收集管的吸附柱(Spin Columns DM)中,13000 r/min 離心30 s,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。 向吸附柱中加入150 μL Buffer PB,13000 r/min 離心30 s。 向吸附柱中加入400 μL Buffer PW,13000 r/min 離心1 min,倒掉收集管中的廢液。 將吸附柱置于1 個(gè)新的離心管中,向吸附膜的中間部位加入60 μL Buffer EB,室溫放置2 min,13000 r/min 離心1 min,將質(zhì)粒溶液收集到離心管中,-20℃保存質(zhì)粒。 質(zhì)粒送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序,測序引物為通用引物U6-F。

注:Plcz1 基因的外顯子由豎線表示。圖1 Plcz1 基因的基因結(jié)構(gòu)(NM_054066.4)和CRISPR/CAS9 的靶序列Note.Exons are represented by vertical bars.Figure 1 Gene structure of the mouse Plcz1 gene (NM_054066.4) and target sequences for CRISPR/Cas9

1.3.5 Golden Gate assembly

為構(gòu)建靶向2 個(gè)Plcz1基因組位點(diǎn)的CRISPR/Cas9-核酸酶載體, 將測序正確的pX330A-1x2-sgRNA6 與pX330S-2-sgRNA7 統(tǒng)一到單個(gè)載體中。將pX330A/S 載體、Eco31I、T4 DNA 連接酶與10×T4 DNA 連接酶緩沖液在PCR 管中混合,并進(jìn)行如下熱循環(huán)反應(yīng): 37℃ 5 min,16℃ 10 min 進(jìn)行25 個(gè)循環(huán),循環(huán)反應(yīng)后,在37℃下進(jìn)行額外的Eco31I 消化1 h,即得到連接產(chǎn)物pX330A-2(如圖2 所示),用于后續(xù)步驟。

1.3.6 顯微注射

測序正確的質(zhì)粒經(jīng)純化后,用注射用水稀釋至3 ng/μL,存于-20℃?zhèn)溆谩?將注射過PMSG 和hCG的C57BL/6 雌鼠(供體)與C57BL/6 雄鼠合籠,同時(shí)將未注射過激素的ICR 雌鼠與結(jié)扎的雄鼠合籠,從而獲得假孕雌鼠(受體)。 處死超數(shù)排卵的供體雌鼠,取出受精卵,使用顯微注射儀將質(zhì)粒注射到受精卵原核中。 麻醉假孕雌鼠,將受精卵移植至受體卵巢內(nèi)。 3 周后移植成功的受體雌鼠可生出F0代小鼠。

1.3.7 基因敲除小鼠的篩選

提取鼠尾基因組DNA,通過PCR 檢測目的片段。 由南京擎科生物科技有限公司合成檢測sgRNA 的引物(如表2 所示)。 PCR 反應(yīng)體系:2×Es Taq MasterMix(Dye)10 μL,F(10 μmol/L)1 μL,R(10 μmol/L)1 μL,DNA(<0.2 μg)1 μL,ddH2O 7 μL。 PCR 反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃ 2 min,變性94℃ 30 s、退火60℃ 30 s、延伸72℃ 30 s,循環(huán)33 次,終延伸72℃ 2 min。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序, 用SnapGene 軟件分析。

注:圖片由SnapGene 提供。圖2 pX330A-2 質(zhì)粒圖譜Note.The picture was support by SnapGene software.Figure 2 Plasmid map of pX330A-2

表2 檢測目的片段的引物序列Table 2 Primer sequences for detection of target fragment

1.3.8Plcz1-/-雄性小鼠的飼養(yǎng)和繁育

繁育出F0 代小鼠后,與野生型C57BL/6 小鼠合籠,得到F1 代雜合小鼠。 然后將純合和純合小鼠、純合和雜合小鼠、純合和野生型、雜合和雜合小鼠以及野生型和野生型小鼠等不同基因型間進(jìn)行合籠,從繁殖情況分析Plcz1基因敲除雄性小鼠的生育能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間兩兩比較采用配對雙尾t檢驗(yàn),數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)顯示。 當(dāng)P<0.05 時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pX330A-sgRNA 重組載體構(gòu)建

目的序列Plcz1-sgRNA6 和sgRNA7 與載體pX330A 載體連接,通過序列測定驗(yàn)證目的基因,并用SnapGene 軟件進(jìn)行序列比對,結(jié)果表明正確插入兩對sgRNA 序列(圖3)。

2.2 Plcz1 基因敲除小鼠的測序篩選

獲得受精卵82 枚,顯微注射活胚54 枚,胚胎移植兩只ICR 受體(C102、C103),其中C102受體產(chǎn)仔6 只,編號1~6,C103 受體生的8 只后代均被吃。 PCR 擴(kuò)增包含sgRNA 的片段后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(如圖4 所示),電泳結(jié)果顯示:用檢測sgRNA6 或sgRNA7 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,3號小鼠沒有電泳條帶,其余小鼠電泳條帶大小為289 bp;而用檢測sgRNA6 上游引物和sgRNA7 下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,3 號小鼠在268 bp 處顯示電泳條帶。 經(jīng)測序3~4 次鑒定出3、4、5 號小鼠為Plcz1基因敲除小鼠,分別為:(1)Plcz1m3:Plcz1基因第6、7 外顯子區(qū)域缺失3078 bp,在第295 個(gè)氨基酸處開始突變;(2)Plcz1m4:Plcz1基因第7 外顯子區(qū)域缺失7 bp,在第356 個(gè)氨基酸處開始突變,該小鼠在飼養(yǎng)過程中死亡。 (3)Plcz1m5:Plcz1基因第6 外顯子區(qū)域缺失1 bp,在第295 個(gè)氨基酸處開始突變。 同時(shí)預(yù)測Plcz1m3、Plcz1m4與Plcz1m5的等位基因表達(dá)產(chǎn)生的截短蛋白結(jié)構(gòu)域(如圖5所示):Plcz1m3和Plcz1m5小鼠的PLCζ 蛋白在X 結(jié)構(gòu)域處產(chǎn)生缺失;Plcz1m4小鼠的PLCζ 蛋白在X-Y連接區(qū)產(chǎn)生缺失。

2.3 Plcz1-/-雄性小鼠的生育能力分析

表3 和表4 顯示了小鼠Plcz1m3和Plcz1m5后代的生育能力。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),Plcz1m3和Plcz1m5雄鼠與野生型雌鼠交配雖然可以產(chǎn)生后代,但與野生型雄鼠(8.5±1.4)相比,后代數(shù)量極顯著性降低(Plcz1m3:2.5±0.5;Plcz1m5:2.3±1.1)。 同時(shí)與野生型雄鼠相比(受精率100%;后代死亡率4.7%),Plcz1m3雄鼠受精率13.3%;Plcz1m5雄鼠受精率50%,后代死亡率24%。Plcz1m3雄鼠和Plcz1m3雌鼠交配,后代數(shù)量極顯著性降低(3.0±2.2),Plcz1m3雄鼠受精率30%,后代死亡率高達(dá)100%,而Plcz1m5雄鼠與Plcz1m5雌鼠交配不產(chǎn)生后代。 由此可見,Plcz1m3和Plcz1m5雄鼠可以和不同基因型雌鼠進(jìn)行交配,但其受精率、出生率以及死亡率均顯著性下降。 結(jié)果表明,Plcz1-/-雄鼠自然交配可以產(chǎn)生后代,但是生育能力顯著性下降,同時(shí)Plcz1m5雄鼠較Plcz1m3雄鼠受精率高,但后代死亡率也高。

表4 小鼠Plcz1m5 后代生育能力參數(shù)(±s)Table 4 Fertility parameters of mouse Plcz1m5 offspring

表4 小鼠Plcz1m5 后代生育能力參數(shù)(±s)Table 4 Fertility parameters of mouse Plcz1m5 offspring

注:雜合:Plcz1+/m3 或Plcz1+/m5;純合:純合子Plcz1m3 或 Plcz1m5;WT:野生型;雄性和雌性小鼠之間根據(jù)指定的基因型建立交配對。 與野生型小鼠每窩產(chǎn)仔數(shù)相比,???P<0.001。Note.Het, Plcz1+/m3 or Plcz1+/m5.Mut, homozygote Plcz1m3 or Plcz1m5.WT, Wild-type.Mating pairs were set up between males and females with genotypes as indicated.Compared with the litter size of wild-type mouse,???P<0.001.

交配Crosses雄性×雌性Male×Female受精率(%)Fertilization rate產(chǎn)仔窩數(shù)Number of litters 每窩產(chǎn)仔數(shù)Litter size出生小仔死亡率(%)Infant mortality rate WT(n=6)×WT(n=7) 100.0 10 8.5±1.4 4.7 Het(m5)(n=10)×Het(m5)(n=11) 80.0 13 8.0±2.3 14.4 Het(m5)(n=6)×Mut(m5)(n=4) 75.0 3 6.7±1.3 10.0 Mut(m5)(n=13)×WT(n=22) 50.0 11 2.3±1.1??? 24.0 Mut(m5)(n=9)×Het(m5)(n=10) 18.2 2 2.5±0.5??? 0 Mut(m5)(n=5)×Mut(m5)(n=5) 0 0 0 0

注:A:sgRNA6 的測序結(jié)果與預(yù)測構(gòu)建的載體的序列比對;B:sgRNA7 的測序結(jié)果與預(yù)測構(gòu)建的載體的序列比對。圖3 載體測序?qū)Ρ葓DNote.A, Sequencing results of sgRNA6 were compared with the predicted vector.B, Sequencing results of sgRNA7 were compared with the predicted vector.Figure 3 Comparison of vector sequencing

表3 小鼠Plcz1m3 后代生育能力參數(shù)(±s)Table 3 Fertility parameters of mouse Plcz1m3 offspring

表3 小鼠Plcz1m3 后代生育能力參數(shù)(±s)Table 3 Fertility parameters of mouse Plcz1m3 offspring

注:與野生型小鼠每窩產(chǎn)仔數(shù)相比, ?P<0.05,???P<0.001。Note.Compared with the litter size of wild-type mouse, ?P<0.05,???P<0.001.

交配Crosses雄性×雌性Male × Female受精率(%)Fertilization rate產(chǎn)仔窩數(shù)Number of litters每窩產(chǎn)仔數(shù)Litter size出生小仔死亡率(%)Infant mortality rate WT(n=6)×WT(n=7) 100.0 10 8.5±1.4 4.7 Het(m3)(n=16)×Het(m3)(n=15) 75.0 25 6.3±1.5??? 21.0 Het(m3)(n=6)×Mut(m3)(n=7) 55.6 9 6.9±1.5? 16.1 Mut(m3)(n=15)×WT(n=15) 13.3 2 2.5±0.5??? 0 Mut(m3)(n=17)×Het(m3)(n=17) 17.7 3 3.0±0.8??? 0 Mut(m3)(n=10)×Mut(m3)(n=6) 30.0 3 3.0±2.2??? 100.0

注:A、C、E:野生型Plcz1(Plcz1WT)等位基因和3 個(gè)核苷酸缺失突變Plcz1 等位基因的基因組序列比較,虛線標(biāo)紅為缺失序列;B、D、F:預(yù)測了野生型小鼠PLCζ 蛋白(PLCζWT)和突變的PLCζm3(B)、PLCζm4(D)以及PLCζm5(F)等位基因表達(dá)的截短蛋白的結(jié)構(gòu)域。圖5 小鼠Plcz1m3、Plcz1m4 以及Plcz1m5 突變等位基因的表達(dá)分析Note.A, C, E, Comparison of genomic sequences from wild-type Plcz1(Plcz1WT) allele and three mutant Plcz1 alleles harbouring nucleotide deletions, the missing sequence is marked red by a dotted line.B, D, F, Predicted protein-domain structures for wild-type mouse PLCζ protein (PLCζWT) and truncated proteins resulting from expression of mutant PLCζm3(B), PLCζm4(D) and PLCζm5(F) alleles.Figure 5 Expression analysis of mouse Plcz1m3, Plcz1m4and Plcz1m5mutant alleles

注:M:DL5000 Marker;WT:野生型;1~6:原代小鼠的鼠尾DNA。圖4 PCR 法鑒定小鼠Plcz1 基因突變位點(diǎn)Note.M, DL5000 Marker.WT, Wild type.1~6, Tail DNA of primary mice.Figure 4 Identification of mouse Plcz1 gene mutation site by PCR

3 討論

不孕癥是一種影響男性和女性的復(fù)雜和多因素的疾病,全球臨床數(shù)據(jù)顯示,每7 對夫婦中就有1 對經(jīng)歷不孕不育[13]。 即使采用胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI),高達(dá)5%的ICSI 治療周期仍然失敗,僅在英國每年就有至少1000 對夫婦受到影響[14]。 目前,卵子激活過程中的缺陷被認(rèn)為是這一失敗的主要來源[15]。 許多臨床報(bào)告已將人類PLCζ 缺陷與卵母細(xì)胞激活失敗聯(lián)系在一起,同時(shí)某些類型的男性不育與人類精子中PLCζ 的異常表達(dá)、功能、結(jié)構(gòu)以及定位密切相關(guān)[16]。 因此,本研究構(gòu)建的Plcz1基因敲除小鼠模型對研究PLCζ 在精子和卵母細(xì)胞中的表達(dá)和功能活性的調(diào)控機(jī)制,以及找出不孕癥的潛在治療方案具有臨床意義。

利用基因組靶向編輯技術(shù)制備動(dòng)物模型是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)使用RNA 引導(dǎo)的核酸酶切割外源基因[17],相較于其他基因編輯技術(shù),具有易于定制、更高的靶向效率以及促進(jìn)多重基因組編輯的能力[18-19],操作更加簡單,成本較低[20]。 Sakuma 等[21]用CRISPR/Cas9 構(gòu)建的系統(tǒng)為多重基因組/表觀基因組編輯、同時(shí)激活/抑制多個(gè)基因等提供了有效的靶向策略。Golden Gate 載體構(gòu)建方法,使構(gòu)建質(zhì)粒更加便利[22]。 為保證CRISPR/Cas9 的切割效率,本研究選擇脫靶位點(diǎn)較少、sgRNA 與其互補(bǔ)序列錯(cuò)配率也較少的靶點(diǎn),且得分較高的靶點(diǎn),同時(shí)也控制CRISPR/Cas9 的劑量,因?yàn)閯┝恳彩怯绊懨摪型蛔兊牧硪粋€(gè)因素,最大限度地減少脫靶突變。 此外,通過利用Cas9 與多個(gè)sgRNA 一起使用的優(yōu)勢,可成功地實(shí)現(xiàn)sgRNA 靶點(diǎn)之間的大片段缺失或倒置[23]。

利用顯微注射方法將質(zhì)粒注射到胚胎原核中[24],21 d 后,6 只F0 代小鼠出生,鼠尾DNA 經(jīng)過PCR 后瓊脂糖凝膠電泳和測序分析,證明3 只小鼠有Plcz1基因缺失,成功構(gòu)建出Plcz1基因敲除小鼠模型。 野生型或Plcz1-/-雄性小鼠分別與野生型雌性小鼠交配,結(jié)果表明Plcz1-/-雄性小鼠可以繁育后代,但是與野生型雄性小鼠相比其產(chǎn)仔數(shù)量顯著性下降,此結(jié)果與Hachem 等[12]的研究結(jié)果相符,為闡明Plcz1基因突變帶來的生殖能力障礙提供理論依據(jù)。

目前,研究者越來越重視卵母細(xì)胞激活途徑的選擇與優(yōu)化,在體外激活卵母細(xì)胞的過程中,研究者往往通過選取不同的激活方式獲得動(dòng)物的胚胎,而卵母細(xì)胞的人工激活效率會(huì)直接影響胚胎的發(fā)育質(zhì)量。 受精時(shí),PLCζ 作為精子中一種重要的因子在激活卵母細(xì)胞第二次減數(shù)分裂過程中發(fā)揮重要作用。 精卵融合后,PLCζ 通過精子進(jìn)入卵質(zhì),并催化PIP2水解生成IP3。 IP3觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放,產(chǎn)生特有的胞質(zhì)Ca2+振蕩,導(dǎo)致卵子激活,從而啟動(dòng)胚胎發(fā)育過程。 Nomikos 等[25]證明在表達(dá)功能障礙的PLCζ 不能激活的卵母細(xì)胞中顯微注射重組人PLCζ,可以有效地挽救失敗的激活,并正常發(fā)育至囊胚階段。 在人類生殖過程中,PLCζ 蛋白缺陷的男性會(huì)不育[26-27]。 Hachem 等[12]首次在哺乳動(dòng)物上證明,在沒有卵母細(xì)胞激活的情況下,自然交配和受精可以產(chǎn)生后代,與本文研究結(jié)果相符,相較于野生型雄鼠,Plcz1-/-雄鼠在受精率和繁殖率上均有顯著性下降,是否存在別的途徑激活小鼠體內(nèi)的卵母細(xì)胞還有待商榷,需要對Plcz1基因敲除小鼠進(jìn)行深入的機(jī)制研究。 同時(shí),Dai 等[28]證明催化結(jié)構(gòu)域變異的精子會(huì)受到損害,失去水解PIP2的功能,導(dǎo)致異常的Ca2+振蕩,不能激活卵母細(xì)胞使受精失敗。 Unnikrishnan 等[29]表明PLCζ 在精子中的分布在不同物種中存在差異:在人類精子頭部的頂體、赤道段和頂體后區(qū)域,以及尾部區(qū)域;在小鼠精子的頂體和頂體后區(qū)域。 但是,PLCζ 的不同結(jié)構(gòu)區(qū)域調(diào)節(jié)PLCζ 定位的機(jī)制,以及對于精子獲能的具體作用尚不清楚。

本研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)構(gòu)建的Plcz1基因敲除(Plcz1-/-)小鼠模型,為進(jìn)一步揭示Plcz1基因缺失導(dǎo)致的生殖障礙發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)為治療生育能力障礙等問題的研究提供了有效的動(dòng)物模型。 但是關(guān)于PLCζ 的確切作用機(jī)制及其在卵母細(xì)胞激活過程中的作用程度仍然存在許多問題,所以需要進(jìn)一步探索。