不同運動方式對大鼠骨骼肌MSTN 和IGF1 的影響比較

劉秀娟盛 蕾張念云王子藝申雪純

(1.南京體育學(xué)院運動健康學(xué)院,南京 210014;2.南京體育學(xué)院科研處,南京 210014;3.南京體育學(xué)院科學(xué)實驗中心,南京 210014)

肌肉減少癥是常見的由衰老引發(fā)的疾病,而運動鍛煉可以很好的對抗衰老帶來的肌肉質(zhì)量減少及功能降低。 肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)和胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor 1,IGF1)是骨骼肌生長的重要調(diào)節(jié)因子,對骨骼肌的功能起重要的調(diào)節(jié)作用。 長期以來運動對MSTN 影響的報道很多,主要集中在急性運動[1-2]、力竭運動及恢復(fù)期[3]、跑臺運動[4]及運動結(jié)合飲食干預(yù)[5]等方面,對血液或骨骼肌MSTN 的mRNA 和蛋白的影響[6]結(jié)論多樣,存在爭議。 由于MSTN 是分泌型蛋白,檢測其mRNA 的表達(dá)并不能說明其對骨骼肌的調(diào)節(jié)功能。 IGF1 是肌肉生長的重要刺激因子,可以通過胰島素(insulin)信號途徑促進(jìn)肌肉的肥大。 有關(guān)運動對IGF1 的影響多關(guān)注抗阻運動的影響[1,7-8],但在同一實驗設(shè)計中對比不同運動方式對骨骼肌生長調(diào)節(jié)因子MSTN 和IGF1 的影響鮮見研究報道。 基于此,本研究擬通過在同一實驗設(shè)計中,對大鼠進(jìn)行不同運動方式干預(yù),對比不同的運動方式對MSTN 和IGF1 的影響,為探索運動對骨骼肌表型的影響提供理論支撐,為人們選擇運動鍛煉方式以改善肌肉狀態(tài)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

40 只SPF 級雄性SD 大鼠,10 周齡,體重約為(400±50)g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司[SCXK(滬)2017-0011],飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物中心動物房[SYXK(蘇)2020-0024],飼養(yǎng)條件:室內(nèi)溫度(23 ± 3)℃,相對濕度50%~60%,12 h/12 h 光照/黑暗交替,分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)食進(jìn)水。 本研究動物實驗經(jīng)本校動物實驗倫理委員會批準(zhǔn) (SKJDW-2020-04) ,并在實驗過程中嚴(yán)格按照實驗動物3R 原則進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

MSTN ELISA kit (DGDF80, R&D Systems,USA);insulin ELISA kit(ELR-insulin-1,Rio-Biotech,USA);IGF1 ELISA kit (CEK1604 Rat,bioworld);anti-MSTN/Myostatin(abcam,ab203076);anti-IGF1( bioworld, BS60538 ); anti-p70S6K ( bioworld,BS3634);anti-alpha tubulin (abcam, ab7291);20%的烏拉坦溶液(南京木林森生物科技有限公司)。珠式樣品研磨儀(OMNI Bead Ruptor 24,OMNI 公司,美國);全自動酶標(biāo)儀(TECAN M200pro,TECAN集團(tuán)公司,瑞士);石蠟切片機(Leica RM2125 RTS,Leica Biosystems,德國);蛋白質(zhì)電泳儀、轉(zhuǎn)印系統(tǒng)及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad,伯樂公司,美國);正置光學(xué)顯微鏡(蔡司,Axio Imager 2,德國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,將大鼠隨機分為4 組,分別為安靜對照組(Con 組)10 只,持續(xù)游泳運動組(CE組)10 只,高強度間歇游泳運動組(HIIT 組)10 只,負(fù)重爬梯訓(xùn)練組(CLE 組)10 只。 喂養(yǎng)過程中,及時記錄大鼠進(jìn)食、飲水及生長情況,記錄每周體重。

1.3.2 訓(xùn)練方案

(1)持續(xù)性游泳和高強度間歇游泳運動方案

CE 組和HIIT 組兩組大鼠在寬敞的玻璃泳池中進(jìn)行游泳訓(xùn)練,室溫控制在(23 ± 3)℃,水溫(31 ± 1)℃,每周一至周五8:00 點開始訓(xùn)練,適應(yīng)性訓(xùn)練1 周。 將負(fù)重砝碼裝在氣球中按體重標(biāo)準(zhǔn)系在大鼠尾部。 兩組訓(xùn)練方案參照Da 等[9]的方案(表1)。游泳過程中,若發(fā)現(xiàn)大鼠運動協(xié)調(diào)性下降,反復(fù)下沉?xí)r,立刻撈起大鼠休息30 s。 若大鼠浮于水面不動,則進(jìn)行適當(dāng)驅(qū)趕,以保證正常運動。 訓(xùn)練結(jié)束后,立刻撈起大鼠,用毛巾擦干并用吹風(fēng)機吹干大鼠身體。 實驗過程中,注意觀察大鼠的運動能力、恢復(fù)情況等并做好記錄。

表1 持續(xù)性游泳運動和高強度間歇游泳運動方案Table 1 Continuous swimming exercise and high intensity interval swimming exercise scheme

(2)負(fù)重爬梯訓(xùn)練方案

CLE 組大鼠在高度為1 m、寬度為0.15 m、每級臺階相距0.02 m 的爬梯上進(jìn)行訓(xùn)練,爬梯上方有平臺休息區(qū),下方有底座。 訓(xùn)練方案參照Tang 等[10]的方案進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整(表2)。 將負(fù)重砝碼裝在氣球中按體重標(biāo)準(zhǔn)系在大鼠尾部。 每周二至周六14:00點開始訓(xùn)練,適應(yīng)性訓(xùn)練1 周。 每次訓(xùn)練3 組,組間休息2 min,每組重復(fù)5 次,每次間歇1 min。 訓(xùn)練過程中,當(dāng)大鼠爬到頂端平臺后可休息1 min,若大鼠出現(xiàn)偷懶不運動的現(xiàn)象,適當(dāng)進(jìn)行驅(qū)趕。 實驗過程中,每天觀察大鼠的運動能力、疲勞情況等并做好記錄。

表2 負(fù)重爬梯運動方案Table 2 Load ladder-climbing exercise scheme

1.3.3 取樣

每周記錄大鼠的體重,8 周訓(xùn)練結(jié)束后,用20%的烏拉坦溶液進(jìn)行腹腔注射(1 mL/100 g)將大鼠麻醉處死,收集血液,血液經(jīng)3000 r/min,4℃離心后,分離血清置于-80℃超低溫冰箱保存;分別收集左右兩側(cè)的腓腸肌,一側(cè)肌肉投入多聚甲醛固定液中固定,用于組織學(xué)研究,另一側(cè)肌肉置于液氮速凍,后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱凍存,用于蛋白檢測。

1.3.4 腓腸肌質(zhì)量指數(shù)的計算公式

腓腸肌質(zhì)量指數(shù)=腓腸肌質(zhì)量(g)/體重(g)

1.3.5 腓腸肌組織HE 染色

取腓腸肌組織樣,用多聚甲醛固定24 h,然后修剪組織塊,并用石蠟包埋,切片,HE 染色后,顯微鏡下10×40 倍觀察并拍照,用Image-pro plus 6.0 軟件分析計算肌纖維橫截面積(muscle fiber crosssectional area,FCSA),并統(tǒng)計分析。

1.3.6 血清MSTN、IGF1 和insulin 的測定

血清MSTN、IGF1 和insulin 的檢測嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3.7 蛋白檢測

取腓腸肌組織100 mg 左右,加裂解液1:10(w/v),冰浴勻漿,冰上放置10 min,4℃,10000 r/min 離心10 min,吸上清,BCA 法測定蛋白濃度。 配制10% SDS-PAGE 分離膠,4%濃縮膠。 以30 μg 蛋白樣品量上樣,分離蛋白,轉(zhuǎn)印至PVDF 膜,封閉1 h,后,一抗4℃孵育過夜,TBST 洗滌3 遍,室溫孵育二抗1 h,TBST 洗滌3 遍,化學(xué)發(fā)光檢測,并拍照。 用Image Lab 軟件成像并對結(jié)果進(jìn)行相對定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 和GraphPad Prism 5 軟件處理,各數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05 定為差異顯著性的界值。

2 結(jié)果

2.1 不同運動方式對大鼠體重及肌肉重量的影響

由圖1 可見,3 種運動方式進(jìn)行干預(yù)8 周后,大鼠的體重均顯著低于安靜對照組(P<0.01),而3 種運動方式對大鼠體重的影響沒有顯著差異(圖1A)。 持續(xù)游泳運動組腓腸肌質(zhì)量顯著低于安靜對照組(P<0.05),其他兩組大鼠腓腸肌質(zhì)量則沒有顯著差異(圖1B)。 3 個運動組相比,高強度間歇游泳運動組和爬梯運動組腓腸肌質(zhì)量顯著高于持續(xù)游泳運動組(圖1B,P<0.05)。 高強度間歇游泳運動組和爬梯運動組腓腸肌質(zhì)量指數(shù)顯著高于安靜對照組(圖1C,P<0.05)。 3 個運動組相比,高強度間歇游泳運動組和爬梯運動組腓腸肌質(zhì)量指數(shù)顯著高于持續(xù)游泳運動組(圖1C,P<0.05)。 3 種運動方式干預(yù)4 周后,大鼠的體重均顯著低于安靜對照組(圖1D,P<0.01)。

2.2 不同運動方式對大鼠腓腸肌形態(tài)的影響

腓腸肌形態(tài)學(xué)觀察顯示(圖2),3 種運動方式干預(yù),大鼠的腓腸肌橫截面積顯著低于安靜對照組(P<0.01)。 3 個運動組相比,高強度間歇游泳運動組和爬梯運動組腓腸肌橫截面積顯著高于持續(xù)游泳運動組的大鼠腓腸肌橫截面積(P<0.05),高強度間歇游泳運動組與爬梯運動組相比,腓腸肌橫截面積沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3 不同運動方式對大鼠血液MSTN、IGF1 和insulin 水平的影響

圖3 結(jié)果顯示,3 個運動組血清MSTN 和insulin水平與安靜對照組沒有顯著差異(P>0.05),而血清IGF1 水平顯著低于安靜對照組(P<0.01)。 3 個運動組相比,血清MSTN、insulin 和IGF1 水平均沒有顯著差異。

2.4 不同運動方式對大鼠骨骼肌MSTN、IGF1 和p70S6K 蛋白表達(dá)的影響

如圖4 顯示,爬梯運動組的大鼠腓腸肌MSTN蛋白表達(dá)顯著低于安靜對照組(P<0.01),持續(xù)游泳運動組與高強度間歇游泳運動組的大鼠腓腸肌MSTN 蛋白表達(dá)與安靜對照組沒有顯著差異;高強度間歇游泳運動組的大鼠腓腸肌IGF1 蛋白表達(dá)顯著低于安靜對照組(P<0.01),爬梯運動組的大鼠腓腸肌IGF1 蛋白表達(dá)顯著高于安靜對照組(P<0.01);持續(xù)游泳運動組和爬梯運動組的大鼠腓腸肌P70S6K 的蛋白表達(dá)顯著高于安靜對照組(P<0.01)。 3 個運動組相比,爬梯運動組的大鼠腓腸肌MSTN 蛋白表達(dá)顯著低于持續(xù)游泳運動組和高強度間歇游泳運動組(P<0.01);爬梯運動組的大鼠腓腸肌IGF1 蛋白表達(dá)顯著高于持續(xù)游泳運動組和高強度間歇游泳運動組(P<0.01),高強度間歇游泳運動組的大鼠腓腸肌IGF1 蛋白表達(dá)顯著低于持續(xù)游泳運動組和爬梯運動組(P<0.01);高強度間歇游泳運動組的大鼠腓腸肌P70S6K 蛋白表達(dá)顯著低于持續(xù)游泳運動組和爬梯運動組(P<0.01),且持續(xù)游泳運動組的大鼠腓腸肌P70S6K 蛋白表達(dá)顯著低于爬梯運動組(P<0.01)。

注:A:各組大鼠體重;B:各組大鼠腓腸肌質(zhì)量;C:各組大鼠腓腸肌質(zhì)量指數(shù);D:各組大鼠體重變化曲線。 a:安靜對照組;b:持續(xù)游泳運動組;c:高強度間歇游泳組;d:負(fù)重爬梯訓(xùn)練組。 與安靜對照組相比, ?P<0.05;與持續(xù)游泳運動組相比, #P<0.05。圖1 各組大鼠體重、腓腸肌質(zhì)量和腓腸肌質(zhì)量指數(shù)比較Note.A, Weight of rats in each group.B, Weight of gastrocnemius muscle of rats in each group.C, Gastrocnemius muscle mass index of rats in each group.D, Weight change curve of rats in each group.a, Con group.b, CE group.c, HIIT group.d, CLE group.Compared with Con group, ?P<0.05.Compared with CE group, #P<0.05.Figure 1 Comparison of rat body weight, gastrocnemius weight and gastrocnemius mass index in each group

注:A:肌纖維的組織學(xué)結(jié)構(gòu);B:肌纖維橫截面積統(tǒng)計圖。 a:安靜對照組;b:持續(xù)游泳運動組;c:高強度間歇游泳組;d:負(fù)重爬梯訓(xùn)練組。 與安靜對照組相比, ?P<0.05;與持續(xù)游泳運動組相比, #P<0.05;與高強度間歇游泳運動組相比,&P<0.05;與負(fù)重爬梯訓(xùn)練組相比, $P<0.05。圖2 各組大鼠腓腸肌橫截面積比較Note.A, Histological structure of muscle fibers.B, Muscle fiber cross-sectional area.a, Con group.b, CE group.c, HIIT group.d, CLE group.Compared with Con group, ?P<0.05.Compared with CE group, #P<0.05.Compared with HIIT group, &P<0.05.Compared with CLE group, $P<0.05.Figure 2 Comparison of cross-sectional area of gastrocnemius muscle of rats in each group

注:A:血清MSTN 含量;B:血清IGF1 含量;C:血清胰島素含量。 a:安靜對照組;b:持續(xù)游泳運動組;c:高強度間歇游泳組;d:負(fù)重爬梯訓(xùn)練組。 與安靜對照組相比, ?P<0.05。圖3 各組大鼠血清MSTN、IGF1 和insulin 水平比較Note.A, Serum MSTN content.B, Serum IGF1 content.C, Serum insulin content.a, Con group.b, CE group.c, HIIT group.d, CLE group.Compared with Con group, ?P<0.05.Figure 3 Comparison of serum MSTN, IGF1 and insulin levels in rats of each group

注:A:MSTN 蛋白相對含量;B:IGF1 蛋白相對含量;C:P70S6K 蛋白相對含量;D:MSTN、 IGF1 和p70S6K 的蛋白表達(dá)條帶。 a:安靜對照組;b:持續(xù)游泳運動組;c:高強度間歇游泳組;d:負(fù)重爬梯訓(xùn)練組。 與安靜對照組相比, ?P<0.05;與持續(xù)游泳運動組相比, #P<0.05;與高強度間歇游泳運動組相比,&P<0.05;與負(fù)重爬梯訓(xùn)練組相比, $P<0.05。圖4 各組大鼠腓腸肌MSTN、IGF1 和p70S6K 蛋白表達(dá)比較Note.A, Relative content of MSTN protein.B, Relative content of IGF1 protein.C, Relative content of P70S6K protein.D, Expression of MSTN, IGF1 and P70S6K protein in gastrocnemius muscle of rats in each group.a, Con group.b, CE group.c, HIIT group.d, CLE group.Compared with Con group, ?P<0.05.Compared with CE group, #P<0.05.Compared with HIIT group, & P<0.05.Compared with CLE group, $P<0.05.Figure 4 Comparison of MSTN, IGF1 and p70S6K protein expression in gastrocnemius muscle of rats in each group

3 討論

長期以來,不同方式的運動干預(yù)對MSTN 的影響存在爭議[11-15]。 本研究將3 種運動方式放在同一個實驗中進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)3 種運動方式對血液MSTN 的水平均沒有顯著影響,只有爬梯運動可以顯著降低腓腸肌MSTN 的蛋白表達(dá)。 長期耐力運動和抗阻運動不同程度的降低MSTN mRNA 水平[13-14],本研究沒有檢測MSTN mRNA 的水平,但爬梯運動顯著降低MSTN 的蛋白水平,鑒于MSTN主要是蛋白水平發(fā)揮作用,并且MSTN 的轉(zhuǎn)錄翻譯受很多因素的調(diào)控,因此,只檢測了其血清水平和腓腸肌蛋白的表達(dá)。 對高強度間歇運動的研究顯示,運動后即刻,血清中MSTN 水平先升高后降低[15]。 而本研究發(fā)現(xiàn),高強度間歇運動對血清MSTN 水平?jīng)]有顯著影響,這可能與我們的檢測時間有關(guān);并且一次性抗阻訓(xùn)練和高強度間歇訓(xùn)練后骨骼肌MSTN mRNA 水平顯著降低[16],這與我們的結(jié)果不相符。 本研究中只發(fā)現(xiàn)爬梯運動組骨骼肌蛋白水平降低,而高強度間歇訓(xùn)練組MSTN 沒有顯著變化,可能由于長期訓(xùn)練的適應(yīng)性所致。 這些研究之間的差異可能由采樣時間、運動干預(yù)時間或運動后的差異,以及不同受試者或不同運動模式對全身循環(huán)中MSTN 排出和/或清除的影響導(dǎo)致。 本研究發(fā)現(xiàn)血液中的MSTN 與腓腸肌MSTN 的變化不同,可能的原因是MSTN 不僅由骨骼肌分泌,脂肪組織及心肌等組織均可分泌少量的MSTN,并且分泌進(jìn)入血液的MSTN 還需要修飾活化,由此可以解釋運動對血清MSTN 水平與骨骼肌MSTN 影響的不同。

IGF1 和MSTN 在骨骼肌的生長肥大方面起著相反的作用,IGF1 刺激骨骼肌的生長而MSTN 抑制骨骼肌的生長肥大。 研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)MSTN 缺乏和IGF1 過量時,骨骼肌的生長和體脂的減少存在疊加效應(yīng),MSTN 和IGF1 通過增加AKT 和S6K 的表達(dá)和磷酸化,調(diào)節(jié)骨骼肌的大小、肌纖維類型和脂肪的沉積[17]。 運動可以影響IGF1 的表達(dá),急性抗阻運動誘導(dǎo)大鼠和人的骨骼肌IGF1 表達(dá)增加[7,18]。這與我們的結(jié)果相符,爬梯運動顯著上調(diào)骨骼肌IGF1 的蛋白表達(dá),而高強度間歇運動卻顯著降低IGF1 的表達(dá),分析原因可能與我們選擇的運動干預(yù)方式有關(guān),本研究中高強度間歇運動方案采用的是游泳訓(xùn)練,而非跑臺或爬梯,可能對骨骼肌的影響受限。 IGF1 與瘦體重質(zhì)量的維持有關(guān),研究顯示長期抗阻運動顯著降低血清IGF1 水平[19],這與我們的結(jié)果類似。 我們的研究發(fā)現(xiàn),3 種運動方式均顯著降低了血清IGF1 的水平。 有研究報道骨骼肌的代謝與IGF1 表達(dá)之間存在聯(lián)系,而與血清IGF1 濃度無關(guān)[20],本研究中,3 種運動方式對血清IGF1 和骨骼肌IGF1 的影響不同,這與前人的研究相符,但其中的原因有待進(jìn)一步研究闡明。

骨骼肌蛋白質(zhì)的合成受幾個細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號的調(diào)節(jié)。 其中許多信號隨著營養(yǎng)狀態(tài)的不同(如胰島素信號和氨基酸)而變化;運動也是影響此信號的因素之一[21]。 經(jīng)典的蛋白質(zhì)合成信號通路為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路。 而核糖體蛋白 S6 激酶(p70S6K)是 mTOR 信號的下游[22]。 運動尤其是抗阻運動可以促進(jìn)p70S6K 的表達(dá)和肌原纖維蛋白質(zhì)合成增加。 本研究中發(fā)現(xiàn)持續(xù)游泳運動和爬梯運動顯著上調(diào)骨骼肌p70S6K 的表達(dá),而高強度間歇游泳運動對p70S6K 的表達(dá)沒有顯著影響。 由于p70S6K 是MSTN 和IGF1 信號的下游,從腓腸肌蛋白的表達(dá)結(jié)果看,爬梯運動組和高強度間歇游泳運動組p70S6K 的表達(dá)可能是MSTN 和IGF1 共同作用的結(jié)果,而在持續(xù)游泳運動組p70S6K 的表達(dá),IGF1 的作用可能占優(yōu)勢。

綜合來看,3 種運動方式均能夠降低大鼠的體重,但高強度間歇游泳運動和爬梯運動顯著上調(diào)腓腸肌質(zhì)量和腓腸肌質(zhì)量指數(shù),并且與持續(xù)游泳運動相比,二者也顯著增加肌肉的橫截面積。 值得注意的是,持續(xù)游泳運動顯著降低腓腸肌質(zhì)量和橫截面積,可能由于運動量過大,能耗過高所致。 3 種運動方式相比,爬梯運動對骨骼肌的影響更為顯著,它下調(diào)MSTN 的表達(dá),上調(diào)IGF1 和p70S6K 的表達(dá),這些變化與上調(diào)的腓腸肌質(zhì)量指數(shù)相吻合。 高強度間歇運動雖然也上調(diào)腓腸肌質(zhì)量指數(shù),但其對MSTN、IGF1 和p70S6K 的影響不顯著,提示本研究中采用的高強度間歇運動方案可能通過其他機制影響骨骼肌質(zhì)量;也可能是爬梯運動作為下肢肌肉進(jìn)行的力量訓(xùn)練模式,而在本研究中,高強度間歇運動和持續(xù)運動采用的是游泳運動方式,對下肢肌肉的影響可能沒有爬梯運動明顯。

綜上所述,3 種運動方式中,高強度間歇運動和爬梯運動對大鼠腓腸肌的影響較為顯著。 爬梯運動可能通過下調(diào)MSTN 的表達(dá),上調(diào)IGF1 和p70S6K 的表達(dá)來促進(jìn)腓腸肌的肥大;而高強度間歇運動對腓腸肌的影響可能存在其他機制,也可能受選取的運動干預(yù)方式的影響,具體機制有待進(jìn)一步深入研究。