花生AhMAPK 14基因的克隆及表達(dá)分析研究

朱立飛張初署唐月異陳 娜潘麗娟遲曉元張建成王 通王 冕

(山東省花生研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花生生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山東省花生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266100)

植物在生長發(fā)育過程中會(huì)面臨多種脅迫,為了應(yīng)對(duì)這些脅迫刺激,維持正常生命活動(dòng),植物經(jīng)過長期進(jìn)化形成了一套復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。其中,絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)級(jí)聯(lián)途徑是真核生物中普遍存在的一類較保守的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,在感知上游信號(hào)和響應(yīng)逆境脅迫中起分子開關(guān)的作用,是植物體內(nèi)重要的防御反應(yīng)機(jī)制[1-3]。

MAPK通路一般由三種激酶組成,分別為MAP3K(MAPKKK)、MAP2K(MAPKK)和MAPK,這三種激酶形成MAPK級(jí)聯(lián)的基本模式MAPKKK-MKK-MAPK,其中MAPKKK磷酸化并激活MKK,激活的MKK磷酸化并激活MAPK[4]。MAPKs通常存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,參與植物的細(xì)胞分裂、生長發(fā)育、激素信號(hào)傳遞、非生物脅迫與病原菌的防御等過程[5-7]。研究表明,在擬南芥中鹽脅迫可以激活MKK2-MAPK3/MAPK6正調(diào)控通路,也可以激活MKK9-MAPK3/6負(fù)調(diào)控通路[8-9];此外,水稻中的 Os MAPK4、Os MAPK7、Os MAPK14,玉米的Zm MAPK3,棉花的Gh MAPK2和Gh MAPK16等在應(yīng)對(duì)干旱脅迫過程中發(fā)揮著重要作用[10-15]。同時(shí),也有報(bào)道證實(shí)在擬南芥、煙草、玉米、棉花等植物中,MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與ABA、JA等多種激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16-17]。MAPK級(jí)聯(lián)途徑響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制已在多種作物中報(bào)道,但其在花生中的作用機(jī)制卻鮮有研究。

花生(ArachishypogaeaL.)是人類飲食中油脂和蛋白質(zhì)的主要來源之一,在世界范圍內(nèi)廣泛種植[18]。我國是世界上重要的花生生產(chǎn)大國和消費(fèi)大國,也是花生貿(mào)易大國,花生產(chǎn)業(yè)在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和社會(huì)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位[19-20]。作為地上開花,地下結(jié)莢的植物,花生的生長發(fā)育很容易受到外界環(huán)境的影響[21]。近年來,由于氣候多變,干旱洪澇頻發(fā),環(huán)境因素成為制約花生產(chǎn)業(yè)的重要影響因子。因此,如何提高花生在逆境脅迫下的適應(yīng)能力已成為我們亟待解決的難題。目前國內(nèi)外對(duì)花生脅迫的研究主要集中在花生病害相關(guān)數(shù)量性狀基因定位(quantitative trait locus,QTL)挖掘及分子標(biāo)記的開發(fā)等[22]。有關(guān)花生在抗逆分子機(jī)理方面的研究還處于起步階段,與其他植物相比仍存在很大差距。

本研究以課題前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為基礎(chǔ),篩選并克隆獲得關(guān)鍵基因AhMAPK14并以此為研究對(duì)象,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測其在花生各個(gè)組織中的表達(dá)量,以及在各種脅迫處理誘導(dǎo)下的表達(dá)量。初步證明其在花生中MAPK級(jí)聯(lián)途徑參與應(yīng)對(duì)生物及非生物脅迫的過程。這將有助于我們更好地了解花生響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)理,為提高花生逆境適應(yīng)能力提供重要依據(jù),同時(shí)也為選育花生抗性新品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

供試品種為花育20號(hào)(ArachishypogaeaL.cultivar Huayu20),由山東省花生研究所育成并保存。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株

實(shí)驗(yàn)所用菌種均為實(shí)驗(yàn)室保存,PMD18-Tsimple、PMD19-T等克隆載體購于TaKaRa公司,載體pCAMBIA-1300于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑及試劑盒分別購自Promega、Sigma、TaKaRa、天根、上海生工等公司。所用RNase、抗生素和普通化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 引 物

本研究取花育20號(hào)品種4葉期花生葉片提取RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,作為基因克隆的模板,所用引物如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物Table 1 Primers required for the experiment

1.2 方 法

1.2.1 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上傳測序結(jié)果,利用BLAST工具進(jìn)行基因序列的同源性查找;利用DNAMAN軟件的Multiple Alignment對(duì)這些序列進(jìn)行基因同源性比較,用 MEGA 7.0軟件的Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 亞細(xì)胞定位

構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體35S::AhMAPK14-GFP,以35S::GFP為對(duì)照載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染3葉期本生煙葉片。培養(yǎng)2~5 d后取侵染葉片下表皮,于OLYMPUS FV300激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯,日本)下觀察定位情況,OLYMPUS DP26數(shù)碼相機(jī)(奧林巴斯,日本)拍照。

1.2.3 組織表達(dá)模式分析

花生組織表達(dá)模式分析采用的材料為花生4葉期幼苗的根、莖、葉,盛花期的花生植株花瓣,成熟期的鮮花生種子的子葉以及取自催芽露白時(shí)花生種子胚的下胚軸。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)模式分析

花生實(shí)驗(yàn)處理及取材方法參考自梁丹等花生MAPK13基因的克隆及表達(dá)分析研究[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生Ah MAPK 14基因的獲得

根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序已知序列設(shè)計(jì)引物(K14-F和K14-R),以花生cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到長約1 100 bp的片段(圖1-A)。之后利用編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,與已知的通用引物相結(jié)合,通過RACE-PCR技術(shù),擴(kuò)增得到5’非編碼區(qū)DNA片段和3’非編碼區(qū)DNA片段,兩端的片段約400 bp(圖1-B)。將上述3個(gè)片段與T載體連接、轉(zhuǎn)化DH5α,篩選轉(zhuǎn)化菌,PCR擴(kuò)增得到1 800 bp左右的基因全長片段(圖1-C)。

圖1 花生Ah MAPK 14基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Ah MAPK 14 gene

2.2 Ah MAPK14的生物信息學(xué)分析

將克隆得到的基因序列與模式植物擬南芥作比對(duì),發(fā)現(xiàn)與擬南芥中的AtMAPK14同源性較高,因此參照擬南芥將基因命名為AhMAPK14?；ㄉ蚪M測序后,通過BLAST工具檢索氨基酸序列發(fā)現(xiàn),Ah MAPK14與Ah MAPK7(Arachis hypogaeaL:XP_025691811.1)同源性高達(dá)99.18%,由此猜測,AhMAPK14基因可能是AhMAPK7基因。此外,蛋白質(zhì)分子序列進(jìn)化樹結(jié)果顯示,花生Ah MAPK14與Ah MAPK7的親緣關(guān)系最近,并且Ah MAPK14與蔓花生Ad MAPK7的親緣關(guān)系較其他植物更近(圖2)。Ah MAPK14與許多物種的MAPK7蛋白序列同源性均在80%以上,說明Ah MAPK14在大多數(shù)物種中具有高度保守性。

圖2 Ah MAPK14蛋白質(zhì)序列進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of Ah MAPK14 protein sequences

選取親緣關(guān)系較近的幾個(gè)物種的MAPK7與Ah MAPK14進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)MAPK14含有11個(gè)MAPK蛋白家族典型的保守區(qū)域,1個(gè)特異性的N端A-Loop保守基序和TEY基序(圖3)。MAPK家族的保守結(jié)構(gòu)域是其參與植物防御反應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,因此,我們推測Ah-MAPK14在花生抵御逆境脅迫過程中發(fā)揮作用。

圖3 Ah MAPK14多序列比對(duì)分析Fig.3 Multiple sequence alignment analysis of Ah MAPK14

2.3 Ah MAPK14亞細(xì)胞定位

蛋白質(zhì)的定位對(duì)其功能有重要影響。為進(jìn)一步分析Ah MAPK14的功能,我們構(gòu)建了Ah-MAPK14與GFP的融合載體35S::Ah-MAPK14-GFP,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草后,通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光分布情況。結(jié)果顯示,Ah MAPK14定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(圖4),與之前報(bào)道的MAPK家族成員的定位一致,進(jìn)一步說明Ah MAPK14在花生中的作用可能與其他植物中MAPKs成員相類似。

圖4 Ah MAPK14亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of Ah MAPK14

2.4 Ah MAPK 14基因的組織表達(dá)模式分析

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,以子葉中的表達(dá)量為參照,AhMAPK14基因在花生的下胚軸和花中的相對(duì)表達(dá)量極高,在根、莖、葉中幾乎不表達(dá)(圖5)。AhMAPK14基因的表達(dá)具有一定的組織特異性,推測Ah MAPK14可能參與花生的胚軸發(fā)育和開花過程。

圖5 Ah MAPK 14基因在花生不同組織中的表達(dá)量Fig.5 Expression of Ah MAPK 14 in different tissues of peanut

2.5 AhMAPK 14基因響應(yīng)植物激素和信號(hào)分子誘導(dǎo)

MAPKs參與植物激素信號(hào)途徑已在多種植物中被報(bào)道。我們用不同濃度的激素對(duì)花生幼苗進(jìn)行處理,通過檢測發(fā)現(xiàn),當(dāng)受到ABA刺激后,AhMAPK14基因的表達(dá)量隨著時(shí)間推移呈逐漸上升,說明ABA處理能誘導(dǎo)AhMAPK14的表達(dá);用乙烯處理后,AhMAPK14的表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)明顯下降,之后逐漸回升;用GA處理后,AhMAPK14表達(dá)量的變化趨勢與用乙烯處理時(shí)相類似,說明乙烯和GA會(huì)抑制AhMAPK14的表達(dá);SA處理后,AhMAPK14的表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)沒有明顯變化,待48 h后才明顯升高;在受到JA和H2O2的刺激后,AhMAPK14的表達(dá)量顯著升高,并且上調(diào)倍數(shù)能達(dá)到10倍以上,這一結(jié)果表明JA和H2O2處理對(duì)AhMAPK14的表達(dá)影響較大。

圖6 不同植物激素和信號(hào)分子誘導(dǎo)Ah MAPK 14的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis on Ah MAPK 14 induced by different plant hormones and signal molecules

綜上所述,AhMAPK14能響應(yīng)多種植物激素信號(hào),且大多數(shù)植物激素能上調(diào)AhMAPK14的表達(dá),僅有少數(shù)會(huì)起到抑制作用。同時(shí),這些結(jié)果也表明MAPKs在花生中也能參與植物激素和信號(hào)分子傳導(dǎo)途徑。

2.6 非生物脅迫誘導(dǎo)Ah MAPK 14基因的表達(dá)

對(duì)花生幼苗分別進(jìn)行低溫、干旱及鹽脅迫處理時(shí),AhMAPK14的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)。其中低溫處理時(shí),AhMAPK14的響應(yīng)比較緩慢;干旱處理時(shí),隨時(shí)間推移,AhMAPK14的表達(dá)量呈先下降后上升之后逐漸降低的趨勢;NaCl處理時(shí),AhMAPK14的表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)上升較為顯著。以上表明,在花生中MAPK14的表達(dá)受干旱、低溫以及鹽脅迫的影響,且該影響可能具有時(shí)間上的特異性。因此,我們推測AhMAPK14基因參與花生抵御非生物脅迫的過程。

圖7 Ah MAPK 14基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis on Ah MAPK 14 under abiotic stresses

3 討論與結(jié)論

目前已經(jīng)從植物中成功分離到了很多MAPK,例如擬南芥、棉花、水稻、楊樹、玉米中分別有20、28、17、21、21個(gè) MAPK[24-28]。 有研究表明,在擬南芥中已經(jīng)克隆得到的20個(gè)MAPK家族基因被證明參與到植物生長的各個(gè)方面。擬南芥作為一種典型的模式植物,其基因組已實(shí)現(xiàn)全序列分析。本研究將克隆得到的基因與擬南芥進(jìn)行序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)其與擬南芥中的At MAPK14同源性最高,因此將其命名為AhMAPK14。隨著花生基因功能注釋的逐漸完善,我們通過BLAST工具檢索發(fā)現(xiàn),MAPK14蛋白與栽培種花生中MAPK7蛋白同源性極高,與野生型及蔓花生(花生祖先A.duranensis)中MAPK7的同源性也高達(dá)90%以上,與其他植物中的MAPK7蛋白同源性也非常高。由于花生種質(zhì)資源較多,品種之間存在一定的差異性,因此我們猜測AhMAPK14基因就是花生中的AhMAPK7基因。

MAPKs存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,參與不同的細(xì)胞生理過程,包括生長、發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)等[29]。本研究通過亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)Ah MAPK14定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中,這一結(jié)果也表明在花生中Ah MAPK14與其他MAPK家族成員發(fā)揮的功能可能具有相似性。此外,我們通過分析其組織表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)AhMAPK14主要在花和下胚軸中表達(dá),說明其可能主要在花和下胚軸中發(fā)揮作用,是否參與下胚軸的發(fā)育以及開花過程還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

在植物中,MAPKs在環(huán)境信號(hào)和發(fā)育信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。通過調(diào)節(jié)MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng),細(xì)胞能夠?qū)τ筛叩蜏?、紫外線輻射、臭氧、活性氧、干旱、高低滲透壓、重金屬、傷害和病原體感染等引起的一系列脅迫作出反應(yīng)[30-31]。此外,生長素(AUX)、脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)、乙烯(ET)、油菜素內(nèi)酯(BR)和赤霉素(GA)等激素也能通過MAPK級(jí)聯(lián)作用影響信號(hào)傳導(dǎo)[32-33]。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干旱、低溫、高鹽脅迫以及ABA、JA、SA、H2O2等激素或信號(hào)分子能誘導(dǎo)AhMAPK14的表達(dá),與其他植物中的MAPKs表現(xiàn)相一致,表明MAPKs可能在不同物種之間具有相同的功能。之前有研究發(fā)現(xiàn),在大白菜中,BraMAPK17-2和BraMAPK19-1的表達(dá)被GA3上調(diào),而像BraMAPK3、BraMAPK10-2/3、BraMAPK10-4/5、BraMAPK5、BraMAPK13、BraMAPK1、BraMAPK7-1、BraMAPK7-2、Bra-MAPK8-1和BraMAPK16-2等多數(shù)BraMAPKs的表達(dá)量在GA3處理后顯著降低[34]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GA及ET抑制AhMAPK14的表達(dá),其響應(yīng)GA的作用機(jī)理可能與白菜中有相似之處。MAPKs響應(yīng)信號(hào)分子的作用機(jī)制是復(fù)雜的,關(guān)于Ah MAPK14參與花生信號(hào)通路的證據(jù)還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

我們通過生物信息學(xué)分析、亞細(xì)胞定位、組織特異性表達(dá)分析、激素誘導(dǎo)表達(dá)分析等實(shí)驗(yàn)證明,Ah MAPK14具有MAPK家族的共有特征,并且AhMAPK14基因的表達(dá)水平受非生物脅迫和多數(shù)植物激素的誘導(dǎo),初步表明Ah MAPK14在花生中參與逆境脅迫過程與植物激素和信號(hào)分子傳導(dǎo)途徑。MAPKs參與花生中信號(hào)傳導(dǎo)和抵御非生物脅迫過程的具體作用機(jī)制尚不明確。下一步研究將繼續(xù)以Ah MAPK14作為切入點(diǎn),詳細(xì)解析Ah MAPK14在花生防御非生物脅迫過程中的作用機(jī)制,為選育花生抗性品種提供新思路。