• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于羧甲基殼聚糖-氧化透明質(zhì)酸自組裝行為構(gòu)建的pH響應(yīng)型納米乳水凝膠給藥系統(tǒng)

    2022-08-16 06:49:36湯小涵秦祉劍袁海龍
    中草藥 2022年16期
    關(guān)鍵詞:成膠痤瘡凝膠

    湯小涵,王 哲,閆 巧,秦祉劍,袁海龍*

    基于羧甲基殼聚糖-氧化透明質(zhì)酸自組裝行為構(gòu)建的pH響應(yīng)型納米乳水凝膠給藥系統(tǒng)

    湯小涵1, 2,王 哲2,閆 巧2,秦祉劍1,袁海龍1, 2*

    1. 安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230032 2. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心 藥學(xué)部,北京 100142

    基于羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan,CMC)-氧化透明質(zhì)酸(oxidized hyaluronic acid,OHA)的自組裝行為,構(gòu)建一種用于局部遞送難溶性藥物的pH響應(yīng)型納米乳水凝膠給藥系統(tǒng)。采用自乳化法制備丹參酮IIA(tanshinone ⅡA,Tan IIA)納米乳,通過平衡溶解度的考察和偽三元相圖的繪制優(yōu)化納米乳處方,對納米乳進行理化性質(zhì)考察。高碘酸鈉氧化法制備OHA,以成膠時間為指標優(yōu)選CMC和OHA的濃度。將OHA溶解于納米乳中與CMC溶液自組裝形成Tan IIA納米乳水凝膠(CMC-OHA/Tan IIA-NBHs)。對得到的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs進行理化性質(zhì)和體外抑菌活性評價。優(yōu)化處方可制備得到O/W型Tan IIA納米乳,粒徑為(52.18±0.15)nm,PDI為0.165±0.012。自組裝得到的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs具有良好的穩(wěn)定性、酸響應(yīng)性和藥物緩釋性能。抑菌圈實驗表明CMC-OHA/Tan IIA-NBHs體外可顯著抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。CMC-OHA/Tan IIA-NBHs制備方法簡便、穩(wěn)定性好,可以有效改善難溶性藥物的體外溶出行為,為納米乳局部遞送難溶性藥物提供了新的思路和方法。

    自組裝;水凝膠;藥物遞送;pH響應(yīng)性;緩釋;丹參酮IIA

    丹參酮IIA(tanshinone IIA,TanIIA)作為中藥丹參中的主要活性成分,對痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑制作用,但由于Tan IIA屬于BCS II類藥物,水溶性極差(2 μg/mL),嚴重影響了其在臨床上的使用效果[8]。因此本研究以Tan IIA為模型藥物,制備了粒徑小、分散均勻的Tan IIA納米乳,然后將OHA溶于Tan IIA納米乳形成藥物前體溶液,與CMC溶液自組裝形成Tan IIA納米乳水凝膠給藥系統(tǒng)(CMC-OHA Tan IIAnanoemulsion- based hydrogels,CMC-OHA/Tan IIA-NBHs),并對其穩(wěn)定性、pH響應(yīng)性和體外抑菌活性進行評價,為功能型水凝膠遞送難溶性藥物的研究提供新思路。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    DF101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,北京恒豐長偉科技有限公司;Winner802型納米激光粒度儀,濟南微納顆粒儀器股份有限公司;Tecnai G2 F30型場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM),美國FEI公司;KQ-100E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;BT125D型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;TGL-16G型臺式離心機,上海安亭科學(xué)儀器廠;LC-20A型高效液相色譜系統(tǒng),日本島津公司;Nicolet-5799型傅里葉紅外光譜儀,美國熱力公司;ZRS-8G型智能溶出試驗儀,天津市天大天發(fā)科技有限公司。

    1.2 材料

    Tan IIA原料藥,質(zhì)量分數(shù)95%,西安鴻生生物技術(shù)有限公司,批號150301;Tan IIA對照品,質(zhì)量分數(shù)98%,中國食品藥品檢定研究院,批號110766- 201520;蓖麻油,湖南爾康制藥股份有限公司;油酸乙酯,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL,CEL)購自長沙研邦化工科技有限公司;聚氧乙烯氫化蓖麻油(cremopher RH 40,CRH),北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司;乙醇、聚山梨酯80、聚乙二醇(PEG)400購自天津市光復(fù)精細化工研究所;甘油、1,2-丙二醇購自北京化工廠;辛癸酸甘油酯,Sigma生物科技有限公司;磷酸,天津福晨試劑廠;色譜甲醇,F(xiàn)isher Chemical公司;蒸餾水由實驗室超純水機生產(chǎn);痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌標準株及培養(yǎng)基購自西安國聯(lián)質(zhì)量檢測技術(shù)股份有限公司。

    2 方法

    2.1 TanIIAHPLC分析方法的建立

    2.1.1 色譜條件 色譜柱為Inerteil ODS-3柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(85∶15);柱溫30 ℃;體積流量1 mL/min;檢測波長270 nm;進樣量20 μL[9]。

    2.1.2 溶液的配制

    現(xiàn)階段,經(jīng)濟環(huán)境發(fā)生了比較顯著的變化,工資水平也越來越高,交個稅的群體也越來越多,不過由于物價水平的持續(xù)提升,拋除通貨膨脹的影響,整體的購買能力還是比較低,不過還是需要繳納個人所得稅,個人稅收負擔(dān)會增加,隨著二胎政策的推廣,一些家庭的生活壓力越來越大,要想顯示出稅收的公平性,就需要進行個人所得稅扣除項目改革。

    (1)對照品溶液的制備:精密稱定5.00 mg對照品Tan IIA置于10 mL量瓶中,加適當甲醇溶解后,甲醇定容至刻度得質(zhì)量濃度為500 μg/mL的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液適量,用甲醇按不同比例稀釋,得質(zhì)量濃度為1.00、2.00、4.00、8.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL系列對照品溶液。

    (2)供試品溶液的配制:精密稱取Tan IIA納米乳1.0 g于50 mL量瓶中,加甲醇超聲破乳,定容得母液;再精密量取0.5 mL母液于10 mL量瓶中甲醇定容,搖勻得Tan IIA納米乳供試品溶液。

    (3)陰性對照溶液的配制:精密稱取空白納米乳1.0 g于25 mL量瓶中,甲醇超聲破乳,定容得母液;精密量取0.5 mL母液至10 mL量瓶中加甲醇定容,搖勻得陰性對照溶液。

    2.1.3 專屬性考察 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液,0.22 μm微孔濾膜濾過后,按“2.1.1”項下條件測定。圖1顯示,Tan IIA峰形對稱且達到基線分離,供試品與對照品溶液中Tan IIA保留時間基本一致,納米乳輔料和水凝膠基質(zhì)對測定無干擾。

    圖1 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs (A)、Tan IIA對照品(B)和空白納米乳水凝膠(C) 的HPLC圖

    2.1.4 線性關(guān)系考察 以Tan IIA質(zhì)量濃度為橫坐標()、峰面積為縱坐標()進行線性回歸,得回歸方程為=127 733+28 346,=0.999 6,表明Tan IIA在質(zhì)量濃度為1.00~40.00 μg/mL線性關(guān)系良好。

    2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下質(zhì)量濃度為8.00 μg/mL的Tan IIA對照品溶液,按“2.1.1”項下的色譜條件進樣分析,計算精密度。結(jié)果顯示Tan IIA峰面積RSD為1.35%,表明儀器精密度良好。

    2.1.6 穩(wěn)定性試驗 吸取“2.1.2”項下的供試品溶液適量,分別于0、2、4、6、8、16、24 h按“2.1.1”項下的色譜條件進樣分析。結(jié)果顯示Tan IIA峰面積RSD為0.83%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批的Tan IIA納米乳3份,每個樣品按“2.1.2”項下供試品的制備方法平行配制6個樣品,共制備18個樣品,按“2.1.1”項下的色譜條件進樣分析,記錄峰面積。結(jié)果RSD為1.38%,表明此方法重復(fù)性良好。

    2.1.8 加樣回收率試驗 按“2.1.2”項下供試品的制備方法制備供試品溶液9份,分別加入對照品儲備液適量,配制成質(zhì)量濃度為12.85、14.35、15.75 μg/mL的樣品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積,計算加樣回收率。結(jié)果低、中、高不同質(zhì)量濃度的平均回收率分別為99.53%、100.07%、99.03%,RSD值均小于1.5%。表明回收率符合要求。

    2.2 TanIIA在納米乳成分中的溶解度測定

    取各輔料1.00 g于2 mL離心管中,分別加入過量Tan IIA,渦旋混勻5 min后超聲4 h助溶,靜置過夜后,5000 r/min離心10 min,取上清液用甲醇稀釋至適當質(zhì)量濃度,過0.22 μm微孔濾膜后,使用HPLC法測定Tan IIA在各輔料中的平衡溶解度[10]。平衡溶解度測定結(jié)果如圖2所示,結(jié)合輔料的性質(zhì),初步選擇對Tan IIA溶解度大的聚山梨酯80和PEG 400作為納米乳的乳化劑和助乳化劑,辛癸酸甘油酯為油相。

    圖2 Tan IIA在不同輔料中的溶解度

    2.3 偽三元相圖的繪制及Km值的確定

    將確定的乳化劑(聚山梨酯80)和助乳化劑(PEG 400)分別按質(zhì)量比(m)為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2的比例混合,然后將油相和混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例加入西林瓶中,于37 ℃水浴下攪拌15 min混勻,緩慢滴加蒸餾水繼續(xù)攪拌直至形成澄清透明的納米乳,記錄體系從黏稠變?yōu)榱鲃有粤己脮r的臨界點用水量,以該點為相圖中可形成納米乳的邊界點。用Origin 7.5軟件繪制偽三元相圖,比較不同比例油相、乳化劑、助乳化劑所形成納米乳區(qū)域的大小。結(jié)果如圖3所示,m值(聚山梨酯80和PEG 400的質(zhì)量比)為2∶1時,該體系形成的納米乳區(qū)面積最大。根據(jù)偽三元相圖確定聚山梨酯80和PEG 400比例為2∶1。

    2.4 Tan IIA納米乳的制備

    按處方量加入乳化劑、助乳化劑、油相和Tan IIA原料藥粉末,37 ℃水浴下600 r/min攪拌15 min混勻,緩慢滴加1 mL蒸餾水,即得Tan IIA納米乳。取同法制備的空白納米乳于西林瓶中,不同比例油相形成的納米乳放置7 d后觀察乳液形態(tài),結(jié)果顯示辛癸酸甘油酯與混合乳化劑的比例為1∶9時形成的乳液更加穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)分層,絮凝或粒徑增大的情況。最終確定Tan IIA納米乳的最佳處方為聚山梨酯80-PEG 400-辛癸酸甘油酯(6∶3∶1)。

    圖3 不同Km值的偽三元相圖

    2.5 Tan IIA納米乳的表征

    為鑒定納米乳的類別分別加入適量蘇丹紅和亞甲藍染料,靜置3 min后觀察2種染料的擴散速度。如圖4-A所示,最優(yōu)處方制備的Tan IIA納米乳為澄清透明的橙紅色液體,沒有沉淀或絮凝。如圖4-B和4-C所示,亞甲藍的擴散速度快于蘇丹紅,表明所制備的Tan IIA納米乳為水包油型。

    取Tan IIA納米乳稀釋20倍后用激光粒度分析儀測定其平均粒徑。粒徑測定結(jié)果(圖5)表明,Tan IIA納米乳粒徑為(52.18±0.21)nm,多分散系數(shù)為0.165±0.012,說明該處方制備的納米乳粒徑小,分布范圍窄,是均一穩(wěn)定的分散體系。

    圖4 Tan IIA納米乳的外觀(A) 及鑒定研究示意圖(B, C)

    圖5 Tan IIA納米乳的粒徑分布

    將Tan IIA納米乳稀釋5倍和20倍后滴于覆有支持膜的銅網(wǎng)上,濾紙吸去多余液體后,靜置10 min自然晾干,再滴加入質(zhì)量濃度為10 mg/mL的磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負染10 min,自然揮干,TEM觀察納米乳外觀。Tan IIA納米乳的形態(tài)可見圖6-a、b所示,稀釋倍數(shù)為5倍時Tan IIA納米乳的乳滴大多團聚在一起,粒徑大小均在1 μm內(nèi),稀釋倍數(shù)為20倍時Tan IIA納米乳的乳滴被均勻分散,呈類圓形,粒子間無黏連。

    a-5倍稀釋 b-20倍稀釋

    2.6 氧化透明質(zhì)酸的制備和表征

    采用高碘酸鈉氧化法制備OHA[11],將2.00 g透明質(zhì)酸溶于50 mL蒸餾水中,37 ℃水浴以600 r/min的速度攪拌直至完全溶解,室溫冷卻后加入1.30 g高碘酸鈉,在25 ℃水浴條件下持續(xù)攪拌12 h后,加入1 mL乙二醇淬滅未反應(yīng)的高碘酸鈉,繼續(xù)攪拌1 h,隨后將產(chǎn)物裝入透析袋(截留相對分子質(zhì)量3500),以蒸餾水透析48 h,然后冷凍干燥得到OHA。

    取少許新鮮制備的OHA于研缽中,加入100倍左右的溴化鉀粉末,研磨后壓片利用紅外吸收光譜對合成產(chǎn)物進行表征。結(jié)果如圖7所示,與HA的紅外光譜圖對比,1726 cm?1處醛基的特征吸收峰表明使用該方法成功制備OHA。

    圖7 HA和OHA的FT-IR圖

    2.7 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的制備

    2.7.1 成膠時間的測定和空白水凝膠基質(zhì)的選擇 采用傾斜法測定成膠時間,OHA和CMC溶液接觸后開始計時,然后傾斜西林瓶,觀察溶液的流動情況,待傾斜西林瓶時體系不再流動則停止計時,該時間即為成膠時間。以成膠時間為評價指標,優(yōu)化凝膠的處方比例。取制備好的OHA粉末溶解在蒸餾水中,形成質(zhì)量濃度為10、20、30 mg/mL的均勻溶液;CMC溶解在蒸餾水中,形成質(zhì)量濃度為10、20、30、40 mg/mL的均勻溶液。將等體積的OHA和CMC溶液在37 ℃水浴下混合均勻,并保持在37 ℃直至成膠。形成的空白基質(zhì)根據(jù)組成基質(zhì)的初溶液質(zhì)量濃度進行命名,例如20 mg/mL的OHA溶液和30 mg/mL的CMC溶液形成的空白基質(zhì)命名為O2C3。各組水凝膠的成膠時間和混合1 min時的成膠狀態(tài)見圖8、9??梢园l(fā)現(xiàn)OHA和CMC的質(zhì)量濃度均對凝膠的成膠時間有顯著影響,隨著二者質(zhì)量濃度的增大凝膠時間逐漸縮短。當OHA質(zhì)量濃度和CMC質(zhì)量濃度均為10 mg/mL時,無法形成穩(wěn)定的水凝膠。當OHA質(zhì)量濃度為10 mg/mL,隨著CMC的質(zhì)量濃度由20 mg/mL增大到40 mg/mL,成膠時間由261.67 s縮短至176.33 s。當OHA質(zhì)量濃度為30 mg/mL時,隨著CMC的質(zhì)量濃度由10 mg/mL增大到40 mg/mL,成膠時間進一步由152.00 s縮短至24.00 s。進一步提高質(zhì)量濃度會延長前體溶液的制備時間,導(dǎo)致總體制備時間增大,因此,最終優(yōu)選O3C4進行后續(xù)研究。

    圖8 不同質(zhì)量分數(shù)CMC和OHA形成水凝膠的成膠時間

    圖9 1 min時各組水凝膠的狀態(tài)

    2.7.2 載藥水凝膠的制備和載藥量的測定 取制備好的OHA粉末用Tan IIA納米乳溶解,隨后與等體積的CMC溶液在37 ℃水浴下混合均勻直至成膠,即得CMC-OHA/Tan IIA-NBHs。最佳處方制備得到的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs可見圖10,其外觀均勻且成膠性能良好。經(jīng)測定,CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的成膠時間為(24.32±0.03)s,與O3C4空白水凝膠基質(zhì)的成膠時間沒有顯著性差異。取1.00 g CMC-OHA/Tan IIA-NBHs置于10 mL量瓶中,加入適量甲醇超聲15 min后用甲醇定容至刻度,過0.22 μm濾膜后用HPLC法測得CMC-OHA/Tan IIA- NBHs中Tan IIA的質(zhì)量分數(shù)為1.0 mg/g。

    圖10 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的外觀

    2.8 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的穩(wěn)定性考察

    2.8.1 離心穩(wěn)定性 將Tan IIA和CMC-OHA/Tan IIA-NBHs以8000 r/min的速度離心20 min,觀察離心后其外觀是否有變化[12]。離心穩(wěn)定性結(jié)果如圖11所示,8000 r/min離心20 min后Tan IIA納米乳(b)仍澄清透明,未產(chǎn)生分層破乳現(xiàn)象,但有少量藥物析出沉積在底部,而CMC-OHA/Tan IIA-NBHs(a)經(jīng)過離心處理沒有藥物析出,表明CMC-OHA/Tan IIA-NBHs離心穩(wěn)定性良好。

    2.8.2 光穩(wěn)定性 Tan IIA作為一種具有醌式結(jié)構(gòu)的化合物,易被氧化,并有研究顯示其光穩(wěn)定性較差,因此對CMC-OHA/Tan IIA-NBHs(a)的光穩(wěn)定性進行了考察,與Tan IIA納米乳(b)和Tan IIA乙醇溶液(c)進行對比。將Tan IIA乙醇溶液、Tan IIA納米乳和CMC-OHA/Tan IIA-NBHs置于透明西林瓶中,于25 ℃、日光燈下(4500 lx)保存。分別于0、1、2、4、8、12、24、36、48、72 h取樣0.50 g,用甲醇稀釋并超聲后定容至刻度,過0.22 μm濾膜后用HPLC法測定Tan IIA含量。如圖12所示,在25 ℃、日光燈下(4500 lx)保存3 d后,Tan IIA乙醇溶液中Tan IIA的含量下降了44.66%,Tan IIA納米乳含量下降了30.92%,而CMC-OHA/Tan IIA-NBHs中Tan IIA含量變化最小,僅下降了6.92%。說明將Tan IIA制備成納米乳水凝膠能顯著提升其光穩(wěn)定性。

    a-CMC-OHA/Tan IIA-NBHs b-Tan IIA納米乳

    a-CMC-OHA/Tan IIA-NBHs b-Tan IIA納米乳 c-Tan IIA乙醇溶液

    2.8.3 長期穩(wěn)定性 將CMC-OHA/Tan IIA-NBHs置于密閉器皿中,于4、25、40 ℃不同溫度條件下避光放置,在0、3、7、14、21、30 d取樣,HPLC法測定Tan IIA的含量。如圖13所示,于4 ℃和25 ℃條件下儲存的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在30 d內(nèi)Tan IIA質(zhì)量分數(shù)分別下降2.82%和2.99%,在40 ℃條件下儲存的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在30 d內(nèi)Tan IIA含量下降8.48%。因而CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在室溫或冷藏的避光儲存條件下具備較好的藥物穩(wěn)定性,但熱穩(wěn)定性較差。

    圖13 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的長期穩(wěn)定性(, n = 3)

    2.9 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的體外響應(yīng)性釋放

    采用透析袋法考察CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在pH為5.0、5.5、7.4的PBS緩沖溶液中的釋放。取10.00 g CMC-OHA/Tan IIA-NBHs于活化好的透析袋(截留相對分子質(zhì)量14 000)中,兩端夾緊,置于盛有200 mL PBS的溶出杯中,溫度為37 ℃,轉(zhuǎn)速為100 r/min,分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、32、48、54、72 h取樣0.5 mL,同時補加同溫同體積的溶出介質(zhì),樣品用0.22 μm的微孔濾膜濾過,HPLC法測定Tan IIA含量,并計算Tan IIA累積釋放量。CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的體外響應(yīng)性釋放結(jié)果如圖14所示,在pH 5.0、5.5的PBS緩沖液中,72 h內(nèi)Tan IIA的釋放度分別為73.74%和67.56%,而在pH為7.4的緩沖溶液中,72 h內(nèi)Tan IIA的釋放度僅為37.11%。此外,在酸性緩沖溶液中,CMC- OHA/Tan IIA-NBHs在24 h內(nèi)釋放率超過40%,而在中性緩沖溶液中的釋放度不足30%。結(jié)果表明CMC-OHA/Tan IIA-NBHs具有明顯的酸響應(yīng)性,并有良好的緩釋作用,可以在接觸微酸性皮膚時緩慢釋放藥物。

    圖14 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在PBS緩沖液中釋放曲線(, n = 3)

    2.10 抑菌效果評價

    為了考察CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的抑菌活性,分別考察了CMC-OHA/Tan IIA-NBHs對痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力。痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌于培養(yǎng)平板上活化,將2種菌轉(zhuǎn)移至硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中,分別于37 ℃培養(yǎng)箱進行無氧和有氧培養(yǎng),然后使用無菌水將二者稀釋至活菌量在1×105~1×106cfu/mL,作為供試菌液備用。精密量取2種供試菌液各150 μL,分別均勻涂抹于培養(yǎng)基,并平行制備3份。使用直徑為0.5 cm的圓形模圈在含菌培養(yǎng)基表面分別涂抹等質(zhì)量0.20 g的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs、陽性藥紅霉素、O3C4空白凝膠和卡波姆空白凝膠后痤瘡丙酸桿菌于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行無氧培養(yǎng),金黃色葡萄球菌于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進行有氧培養(yǎng)。48 h后觀察測量各給藥部位的抑菌圈直徑,并按表1評判標準進行評判[13]。

    表1 抑菌圈評分

    Table 1 Scoring table of bacteriostatic ring

    抑菌圈直徑敏感度評分 直徑>20 mm極度敏感4 20 mm>直徑≥15 mm高度敏感3 15 mm>直徑≥10 mm中度敏感2 10 mm>直徑≥7 mm低度敏感1 直徑<7 mm不敏感0

    CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的體外抑菌活性評估結(jié)果如表2所示。對于痤瘡丙酸桿菌,陽性藥紅霉素抑菌圈大小為(27.30±1.27)mm,敏感程度評分4級,CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的抑菌圈大小為(23.70±0.71)mm,敏感程度評分4級,O3C4空白凝膠的抑菌圈大小為(15.60±1.12)mm,敏感程度評分3級。對于金黃色葡萄球菌,陽性藥紅霉素抑菌圈大小為(29.10±1.00)mm,敏感程度評分4級,CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的抑菌圈大小為(33.10±1.40)mm,敏感程度評分4級,O3C4空白凝膠的抑菌圈大小為(17.60±1.33)mm,敏感程度評分3級,卡波姆空白凝膠對痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抑菌能力。結(jié)果證明CMC- OHA/Tan IIA-NBHs具有良好的抑菌活性,體外能抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。

    表2 CMC-OHA/Tan IIA-NBHs的體外抑菌活性

    Table 2 Antibacterial activity of CMC-OHA/Tan IIA-NBHs in vitro

    藥物痤瘡丙酸桿菌金黃色葡萄球菌 抑菌圈直徑評分抑菌圈直徑評分 紅霉素27.30±1.27429.1±1.004 CMC-OHA/Tan IIA-23.70±0.71433.1±1.404 NBHs O3C415.60±1.12317.6±1.333 卡波姆凝膠1.40±0.9702.9±0.750

    3 討論

    制備簡單、工藝成熟的納米乳液近年來在食品和藥品領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注,制備納米乳的輔料具有生物相容性好毒性低的特點,因此,納米乳很適合封裝和遞送親脂性活性成分。然而由于其低黏度性和不穩(wěn)定性,納米乳不適合局部給藥,為了解決這些問題,將納米乳和凝膠劑結(jié)合是一個很有效的解決方案[14-15]。在成膠時間的測定中發(fā)現(xiàn),隨著OHA和CMC質(zhì)量濃度的升高,凝膠的成膠時間會顯著縮短。這是因為OHA-CMC水凝膠是通過席夫堿反應(yīng)形成,OHA的氨基和CMC的醛基生成具有pH響應(yīng)性的亞胺鍵,因此水凝膠的成膠時間主要和溶液中的活性氨基和醛基數(shù)有關(guān),隨著OHA和CMC質(zhì)量濃度的升高,溶液中發(fā)生交聯(lián)的活性基團密度會增加,凝膠的成膠時間會顯著縮短[16]。

    皮膚面部的pH與多種因素有關(guān),有研究顯示在多種皮膚屏障受損的疾病中,均觀察到了不同程度的皮膚表面pH的升高[17-18]。因此本研究選擇考察CMC-OHA/Tan IIA-NBHs中Tan IIA在pH為5.0、5.5的緩沖溶液中的釋放,同時以pH為7.4的緩沖溶液組作為對照。體外釋放實驗結(jié)果表明,CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在pH為5.0的PBS緩沖液中,Tan IIA72 h的累積釋放度可達到70%以上,而在pH 7.4時僅僅不到30%,表明具有較好的酸響應(yīng)性。根據(jù)Chen等[19]實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),席夫堿結(jié)構(gòu)在弱酸性環(huán)境下降解緩慢,完全降解需要10 d左右,因此CMC-OHA/Tan IIA-NBHs在72 h內(nèi)難以釋放完全。而在pH7.4的緩沖液中,席夫堿鍵較為穩(wěn)定,CMC和OHA水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)降解程度較低,不利于藥物釋放。因此這種pH響應(yīng)型的藥物載體在藥物遞送領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

    體外抑菌活性實驗表明,CMC-OHA/Tan IIA- NBHs在體外能夠有效抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。此外O3C4水凝膠基質(zhì)也有一定的抑菌活性,這是因為殼聚糖的高電荷多陽離子結(jié)構(gòu)與帶負電的細菌磷脂膜成分會產(chǎn)生強烈的靜電相互作用,通過膜損傷和隨后的內(nèi)容物泄漏導(dǎo)致細菌死亡,因此適當提高殼聚糖的濃度有利于提高凝膠的抗菌性能[20-21]。

    本研究利用CMC和OHA的自組裝行為,在溫和的反應(yīng)條件下,一步制備完成了納米乳和水凝膠的結(jié)合,得到的CMC-OHA/Tan IIA-NBHs具有良好的穩(wěn)定性、pH響應(yīng)性和緩釋能力,可在體外顯著抑制痤瘡丙酸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。為納米乳和難溶性藥物的外用產(chǎn)品開發(fā)與臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    [1] Yan S Q, Zhang Q, Wang J N,. Silk fibroin/ chondroitin sulfate/hyaluronic acid ternary scaffolds for dermal tissue reconstruction [J]., 2013, 9(6): 6771-6782.

    [2] Su H Y, Zhang W, Wu Y Y,. Schiff base-containing dextran nanogel as pH-sensitive drug delivery system of doxorubicin: Synthesis and characterization [J]., 2018, 33(2): 170-181.

    [3] Hu M, Yang J L, Xu J H. Structural and biological investigation of chitosan/hyaluronic acid with silanized- hydroxypropyl methylcellulose as an injectable reinforced interpenetrating network hydrogel for cartilage tissue engineering [J]., 2021, 28(1): 607-619.

    [4] Moradi S, Barati A, Salehi E,. Preparation and characterization of chitosan based hydrogels containing cyclodextrin inclusion compounds or nanoemulsions of thyme oil [J]., 2019, 68(11): 1891-1902.

    [5] Liang Y P, Zhao X, Hu T L,. Adhesive hemostatic conducting injectable composite hydrogels with sustained drug release and photothermal antibacterial activity to promote full-thickness skin regeneration during wound healing [J]., 2019, 15(12): e1900046.

    [6] Ma X Z, Xiang S Y, Xie H J,. Fabrication of pH- sensitive tetramycin releasing gel and its antibacterial bioactivity against[J]., 2019, 24(19): 3606.

    [7] Omidi S, Pirhayati M, Kakanejadifard A. Co-delivery of doxorubicin and curcumin by a pH-sensitive, injectable, andhydrogel composed of chitosan, graphene, and cellulose nanowhisker [J]., 2020, 231: 115745.

    [8] 王秀環(huán), 孫偉衛(wèi), 季新燕, 等. 丹參酮IIA微乳及微乳凝膠的抑菌效果及痤瘡臨床療效的初步研究 [J]. 山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2015, 16(6): 36-38.

    [9] 鄭娟, 沈成英, 龐建云,等. 丹參酮IIA納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的體外評價及其對HaCaT細胞增殖的影響 [J]. 中草藥, 2016, 47(24): 4340-4344.

    [10] 鐘鈺, 胡鵬翼, 鄭琴, 等. 紫蘇精油納米乳的處方工藝研究與初步質(zhì)量評價 [J]. 中草藥, 2020, 51(22): 5714-5722.

    [11] Zhang R Y, Li X, He K W,. Preparation and properties of redox responsive modified hyaluronic acid hydrogels for drug release [J]., 2017, 28(12): 1759-1763.

    [12] 鄧茂, 李小芳, 陳慧娟, 等. 以茶皂素為天然乳化劑制備水飛薊素納米乳及其理化性質(zhì)考察 [J]. 中草藥, 2021, 52(21): 6528-6536.

    [13] 呂好新, 趙玲麗, 霍珊珊, 等. 肉桂-山蒼子復(fù)合植物精油對發(fā)霉花生黑曲霉BQM菌的抑菌效果 [J]. 中國食品學(xué)報, 2021, 21(12): 222-229.

    [14] Komaiko J, McClements D J. Food-grade nanoemulsion filled hydrogels formed by spontaneous emulsification and gelation: Optical properties, rheology, and stability [J]., 2015, 46: 67-75.

    [15] Hu Q, Lin H, Wang Y F,. Design, optimization and evaluation of a microemulsion-based hydrogel with high malleability for enhanced transdermal delivery of levamisole [J]., 2021, 605: 120829.

    [16] Hu B, Gao M Z, Boakye-Yiadom K O,. An intrinsically bioactive hydrogel with on-demand drug release behaviors for diabetic wound healing [J]., 2021, 6(12): 4592-4606.

    [17] 陳思璇, 李泓瑩, 楊洋, 等. 點陣激光用于痤瘡患者的臨床治療對療效、皮損改善、經(jīng)表皮失水量、皮膚表面pH值、血紅素含量的影響觀察 [J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志, 2021, 20(1): 60-62.

    [18] Schürer N. pH and acne [J]., 2018, 54: 115-122.

    [19] Chen T Y, Wen T K, Dai N T,. Cryogel/hydrogel biomaterials and acupuncture combined to promote diabetic skin wound healing through immunomodulation [J]., 2021, 269: 120608.

    [20] Moeini A, Pedram P, Makvandi P,. Wound healing and antimicrobial effect of active secondary metabolites in chitosan-based wound dressings: A review [J]., 2020, 233: 115839.

    [21] Qu J, Zhao X, Liang YAntibacterial adhesive injectable hydrogels with rapid self-healing, extensibility and compressibility as wound dressing for joints skin wound healing [J]., 2018, 183(11): 185-199.

    pH-responsive nanoemulsion hydrogel drug delivery system based on self- assembly behavior of carboxymethyl chitosan-oxidized hyaluronic acid

    TANG Xiao-han1, 2, WANG Zhe2, YAN Qiao2, QIN Zhi-jian1, YUAN Hai-long1, 2

    1. School of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230032, China 2. Department of Pharmacy, Air Force Medical Center, PLA, Beijing 100142, China

    To construct a pH-responsive nanoemulsion hydrogel drug delivery system based on the self-assembly behavior of carboxymethyl chitosan (CMC)-oxidized hyaluronic acid (OHA) for the topical delivery of in poor solubility drugs.The optimum prescription of nanoemulsion was determined according to the amount of tanshinone ⅡA(Tan IIA) dissolved in various excipients and the pseudo-ternary phase diagram and the physicochemical properties of the nanoemulsion were investigated. Furthermore, OHA was prepared by sodium periodate oxidation and the concentration of CMC and OHA is optimized by using the gel formation time as an indicator. CMC-OHA Tan IIAnanoemulsion-based hydrogels (CMC-OHA/ Tan IIA-MBHs) were prepared by dissolving OHA in nanoemulsion and self-assembling the mixture with CMC solution. Physicochemical properties andantibacterial activity of CMC-OHA/Tan IIA-MBHs were observed and detected.The mean particle size of the prepared Tan IIAnanoemulsion was (52.18 ± 0.21) nm and PDI was 0.165 ± 0.012. Theevaluation results showed CMC-OHA/Tan IIA-NBHs had good centrifugal stability, light stability, pH responsiveness, and sustained-release properties. The bacterial inhibition ring test showed that CMC-OHA/TanIIA-NBHs could significantly inhibit the growth of Propionibacterium acnes and Staphylococcus aureus.With the advantages of simple preparation and good stability, CMC-OHA/Tan ⅡA-MBHs could effectively improve thedissolution behavior of insoluble drugs, providing a new idea and method for topical delivery of poorly soluble drugs by nanoemulsion.

    self-assembly; hydrogel; drug delivery; pH-sensitive; sustained-released; tanshinone IIA

    R283.6

    A

    0253 - 2670(2022)16 - 4992 - 09

    10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.008

    2022-02-21

    國家自然科學(xué)基金面上項目(81873092)

    湯小涵,碩士研究生,研究方向為中藥新型給藥系統(tǒng)研究。E-mail: 3206820156@qq.com

    袁海龍,研究員,博士生導(dǎo)師,研究方向為中藥新型給藥系統(tǒng)研究。Tel: (010)66928505 E-mail: yhlpharm@126.com

    [責(zé)任編輯 鄭禮勝]

    猜你喜歡
    成膠痤瘡凝膠
    一種復(fù)合凝膠堵劑的制備與性能研究
    纖維素氣凝膠的制備與應(yīng)用研究進展
    超輕航天材料——氣凝膠
    軍事文摘(2020年20期)2020-11-16 00:31:56
    保暖神器——氣凝膠外套
    “凍結(jié)的煙”——氣凝膠
    三子湯配合放血療法治療痤瘡病150例
    影響丙烯酰胺堵水劑成膠因素的研究
    聚合物水解度對有機鉻交聯(lián)劑成膠性能的影響
    消風(fēng)清熱散治療面部痤瘡69例
    痤瘡的中醫(yī)藥治療
    夜夜爽天天搞| 真人做人爱边吃奶动态| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲自拍偷在线| 1024香蕉在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费高清视频大片| 黄色视频,在线免费观看| 天堂中文最新版在线下载| 一进一出抽搐动态| 国产激情欧美一区二区| 欧美一区二区精品小视频在线| 99热只有精品国产| 国产成人影院久久av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 757午夜福利合集在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产三级黄色录像| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久久久久中文| 亚洲成人免费电影在线观看| 88av欧美| 一级作爱视频免费观看| 国产1区2区3区精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜福利欧美成人| 日韩三级视频一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品亚洲av一区麻豆| 操美女的视频在线观看| 无人区码免费观看不卡| 久久精品成人免费网站| 亚洲欧美激情在线| 身体一侧抽搐| 新久久久久国产一级毛片| 天天影视国产精品| 黄色女人牲交| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 狂野欧美激情性xxxx| 热re99久久精品国产66热6| 美女大奶头视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 人妻久久中文字幕网| 超碰成人久久| 国产xxxxx性猛交| а√天堂www在线а√下载| 女人被狂操c到高潮| 成人精品一区二区免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲五月婷婷丁香| av网站免费在线观看视频| 99精品久久久久人妻精品| 久久久国产成人精品二区 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 一级作爱视频免费观看| 中文字幕色久视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线观看66精品国产| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲av电影在线进入| 亚洲人成77777在线视频| 国产成人影院久久av| 视频区图区小说| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 日日夜夜操网爽| 亚洲国产精品合色在线| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久精品亚洲av国产电影网| 麻豆一二三区av精品| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲av第一区精品v没综合| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日韩精品中文字幕看吧| a级片在线免费高清观看视频| 日韩大码丰满熟妇| 看片在线看免费视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲,欧美精品.| 日韩av在线大香蕉| 午夜福利在线观看吧| 国产深夜福利视频在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久精品国产亚洲av高清一级| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产xxxxx性猛交| av网站免费在线观看视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美黄色片欧美黄色片| 极品人妻少妇av视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品 国内视频| 制服人妻中文乱码| 18禁观看日本| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品永久免费网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久精品人人爽人人爽视色| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产熟女xx| 国产在线观看jvid| 51午夜福利影视在线观看| 日本wwww免费看| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产欧美日韩一区二区三| 男人的好看免费观看在线视频 | av在线播放免费不卡| 久久精品91无色码中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频 | 在线观看免费日韩欧美大片| 精品国产国语对白av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲人成电影观看| 9191精品国产免费久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 中文欧美无线码| 看片在线看免费视频| 国产野战对白在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 黄色怎么调成土黄色| 日韩欧美国产一区二区入口| 一级,二级,三级黄色视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久久久久精品吃奶| 精品第一国产精品| 国产三级在线视频| 超色免费av| 窝窝影院91人妻| 免费看a级黄色片| 交换朋友夫妻互换小说| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 最好的美女福利视频网| 桃红色精品国产亚洲av| 搡老熟女国产l中国老女人| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| a在线观看视频网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 日韩免费av在线播放| 亚洲成av片中文字幕在线观看| а√天堂www在线а√下载| 成年人黄色毛片网站| 精品欧美一区二区三区在线| 脱女人内裤的视频| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品九九99| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美日韩黄片免| 淫秽高清视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 色在线成人网| 波多野结衣一区麻豆| 香蕉久久夜色| 丰满的人妻完整版| aaaaa片日本免费| 成年版毛片免费区| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产免费男女视频| 一级毛片高清免费大全| 欧美日韩黄片免| 欧美午夜高清在线| 俄罗斯特黄特色一大片| 麻豆国产av国片精品| 级片在线观看| 免费在线观看日本一区| 国产欧美日韩一区二区精品| 狂野欧美激情性xxxx| 啦啦啦在线免费观看视频4| 少妇 在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲美女黄片视频| 午夜福利免费观看在线| 久久中文字幕一级| 性欧美人与动物交配| 男男h啪啪无遮挡| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 在线观看免费视频网站a站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 国产亚洲av高清不卡| 国产欧美日韩精品亚洲av| 香蕉丝袜av| 精品久久久久久电影网| 看黄色毛片网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产看品久久| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩有码中文字幕| 热re99久久国产66热| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 桃红色精品国产亚洲av| 级片在线观看| 亚洲专区字幕在线| 精品久久久久久,| 精品免费久久久久久久清纯| 成人国语在线视频| 97人妻天天添夜夜摸| 少妇被粗大的猛进出69影院| 人成视频在线观看免费观看| 一级片'在线观看视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲熟女毛片儿| a级片在线免费高清观看视频| 岛国视频午夜一区免费看| 日韩av在线大香蕉| 国产单亲对白刺激| 一本综合久久免费| 亚洲伊人色综图| 日韩三级视频一区二区三区| 青草久久国产| 欧美大码av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲,欧美精品.| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产精品成人在线| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲精华国产精华精| 深夜精品福利| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 他把我摸到了高潮在线观看| 后天国语完整版免费观看| 正在播放国产对白刺激| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品二区激情视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久香蕉国产精品| 午夜福利在线观看吧| 搡老乐熟女国产| 午夜两性在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| av天堂久久9| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品国产av在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 可以在线观看毛片的网站| 国产视频一区二区在线看| 一区福利在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 99久久综合精品五月天人人| www.熟女人妻精品国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 黄色丝袜av网址大全| 午夜激情av网站| 国产在线观看jvid| 在线看a的网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 母亲3免费完整高清在线观看| 两个人看的免费小视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美黄色片欧美黄色片| 99精品久久久久人妻精品| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品二区激情视频| 欧美日韩视频精品一区| 91精品国产国语对白视频| 大型黄色视频在线免费观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产视频一区二区在线看| 日日干狠狠操夜夜爽| 真人做人爱边吃奶动态| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 精品一品国产午夜福利视频| 老司机福利观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 成年人黄色毛片网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 淫秽高清视频在线观看| 大码成人一级视频| 午夜免费鲁丝| 欧美性长视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 午夜福利欧美成人| 久久久久国内视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲情色 制服丝袜| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一二三四社区在线视频社区8| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久精品国产清高在天天线| 在线看a的网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 美女午夜性视频免费| 久久精品成人免费网站| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人精品无人区| 国产亚洲精品一区二区www| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品二区激情视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 超色免费av| 午夜免费鲁丝| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久中文看片网| 午夜老司机福利片| 国产精品野战在线观看 | 精品福利永久在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 免费日韩欧美在线观看| 一夜夜www| 久久精品国产综合久久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 免费在线观看日本一区| 亚洲久久久国产精品| 搡老乐熟女国产| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美另类亚洲清纯唯美| av在线播放免费不卡| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 极品人妻少妇av视频| 91字幕亚洲| 国产精华一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 99香蕉大伊视频| 久久香蕉精品热| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品久久久久久成人av| 亚洲精品国产区一区二| 天堂中文最新版在线下载| 久久影院123| 精品电影一区二区在线| 啪啪无遮挡十八禁网站| 首页视频小说图片口味搜索| 国产乱人伦免费视频| 国产一区二区激情短视频| 99riav亚洲国产免费| 日日爽夜夜爽网站| 99精品欧美一区二区三区四区| 搡老乐熟女国产| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品永久免费网站| 在线免费观看的www视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产99久久九九免费精品| 久久精品影院6| 国产99久久九九免费精品| 亚洲熟妇熟女久久| 久久 成人 亚洲| 国产精品九九99| 中文字幕av电影在线播放| 国产一区二区三区综合在线观看| 一级毛片精品| 露出奶头的视频| 精品国产国语对白av| 大陆偷拍与自拍| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 免费日韩欧美在线观看| 夜夜爽天天搞| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲 国产 在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 午夜免费成人在线视频| 成人国语在线视频| avwww免费| svipshipincom国产片| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 午夜成年电影在线免费观看| 黄片小视频在线播放| 久久人妻av系列| www.999成人在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费 | 最新美女视频免费是黄的| 在线免费观看的www视频| 国产成人av激情在线播放| 天堂√8在线中文| 丁香六月欧美| 香蕉丝袜av| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久午夜亚洲精品久久| 男人舔女人的私密视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 婷婷六月久久综合丁香| 最新美女视频免费是黄的| 男女床上黄色一级片免费看| 99国产精品99久久久久| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美激情久久久久久爽电影 | 制服人妻中文乱码| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 热re99久久国产66热| 叶爱在线成人免费视频播放| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲 国产 在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲国产精品sss在线观看 | 久久国产精品男人的天堂亚洲| 一级片'在线观看视频| 黄色怎么调成土黄色| 身体一侧抽搐| 51午夜福利影视在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产精品久久视频播放| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 波多野结衣高清无吗| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲成国产人片在线观看| 精品一区二区三卡| 久久人妻av系列| 国产精品九九99| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产真人三级小视频在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美国免费a级毛片| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产麻豆69| 国产又爽黄色视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久久久大精品| 国产精品久久久久成人av| 大型av网站在线播放| 欧美成人午夜精品| 久99久视频精品免费| 色在线成人网| 国产精品永久免费网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一本综合久久免费| 久久精品成人免费网站| 亚洲全国av大片| www国产在线视频色| 另类亚洲欧美激情| 久久国产亚洲av麻豆专区| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品1区2区在线观看.| 男人操女人黄网站| 波多野结衣av一区二区av| 男女高潮啪啪啪动态图| 美女高潮到喷水免费观看| 在线观看舔阴道视频| av网站免费在线观看视频| 不卡一级毛片| 在线av久久热| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲国产欧美网| 欧美在线一区亚洲| 老汉色∧v一级毛片| aaaaa片日本免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产高清激情床上av| www.精华液| avwww免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 在线观看一区二区三区激情| 女警被强在线播放| ponron亚洲| 99在线视频只有这里精品首页| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲五月婷婷丁香| 国产精品亚洲一级av第二区| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 免费看十八禁软件| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜福利欧美成人| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产伦人伦偷精品视频| 中文亚洲av片在线观看爽| x7x7x7水蜜桃| 另类亚洲欧美激情| 色播在线永久视频| 1024视频免费在线观看| 91字幕亚洲| 精品久久久久久成人av| 久久香蕉国产精品| 成年版毛片免费区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 美女大奶头视频| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 电影成人av| 午夜激情av网站| 午夜福利在线观看吧| 国产乱人伦免费视频| 一级片免费观看大全| a级毛片黄视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产黄色免费在线视频| 女同久久另类99精品国产91| 桃红色精品国产亚洲av| 国产99白浆流出| 一区在线观看完整版| 精品电影一区二区在线| e午夜精品久久久久久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 99国产精品99久久久久| 中亚洲国语对白在线视频| 成人国产一区最新在线观看| 日本三级黄在线观看| 久久久国产精品麻豆| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 午夜精品国产一区二区电影| 老司机午夜十八禁免费视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品无人区乱码1区二区| 国产深夜福利视频在线观看| 热99re8久久精品国产| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 国产精华一区二区三区| 国产精品免费视频内射| a级毛片在线看网站| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美乱妇无乱码| 999久久久国产精品视频| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲国产精品999在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产精品国产av在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 中文字幕色久视频| 日本黄色日本黄色录像| 欧美日韩精品网址| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 91在线观看av| 久久九九热精品免费| 99re在线观看精品视频| 一级毛片精品| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲自拍偷在线| 欧美最黄视频在线播放免费 | 欧美人与性动交α欧美软件| 日韩高清综合在线| 成人三级黄色视频| 黄色毛片三级朝国网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久国产欧美日韩av| av国产精品久久久久影院| 一级片免费观看大全| 亚洲少妇的诱惑av| 精品国产乱子伦一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久人妻av系列| 高清黄色对白视频在线免费看| 好男人电影高清在线观看| 制服人妻中文乱码| а√天堂www在线а√下载| 18禁观看日本| 欧美大码av| 久久精品国产亚洲av高清一级| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久影院123| 高清黄色对白视频在线免费看| 成人国产一区最新在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产成人精品无人区| 亚洲伊人色综图| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲美女黄片视频| 一级毛片精品| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产在线观看jvid| 精品高清国产在线一区| 欧美精品一区二区免费开放| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产熟女xx| 69精品国产乱码久久久| 在线永久观看黄色视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久香蕉激情| 少妇被粗大的猛进出69影院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 |