HECTD1激活mTOR信號(hào)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制研究

焦薇 郭娜 祖秀光 郝杰 孟明杰 謝亞囡 高偉年

病理型心肌肥厚具有不可逆性，持續(xù)的肥厚最終導(dǎo)致心力衰竭。因此，靶向心肌肥厚是治療心力衰竭的有效途徑之一[1]。含與E6-AP羧基末端同源結(jié)構(gòu)域的E3泛素化蛋白連接酶1(HECT Domain E3 Ubiquitin Protein Ligase 1，HECTD1)在調(diào)控細(xì)胞發(fā)育等方面起著非常重要的作用，但在其是否在心肌肥厚中也發(fā)揮重要作用有待確定。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin,mTOR)是一種進(jìn)化保守激酶，調(diào)節(jié)一系列與新陳代謝和生長(zhǎng)有關(guān)的細(xì)胞過(guò)程[2,3]。既往研究顯示mTOR可以調(diào)節(jié)心臟生長(zhǎng)以應(yīng)對(duì)壓力過(guò)載，并通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞參與心肌肥厚，改變炎性反應(yīng)和心臟肥大[4]。本研究主要探討HECTD1 是否調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路參與心肌細(xì)胞肥大的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ)購(gòu)自Millipore公司。辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)自中杉金橋。微滲透壓泵(Osmotic pumps)購(gòu)自美國(guó)ALZET公司。HECTD1抗體、磷酸化mTOR(p-mTOR)抗體、核糖體蛋白S6激酶B1(ribosomal protein S6 kinase B1，S6K)抗體、mTOR抗體和磷酸化S6K (pS6K) 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。電致化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自Millipore公司。本實(shí)驗(yàn)所有的細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco。胎牛血清購(gòu)自Gibco?？股刭?gòu)自Gibco。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛；RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。qRT-PCR引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。本研究中涉及到的心肌肥厚患者病理組織及對(duì)照樣本收集于本科室，并通過(guò)了河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批。本實(shí)驗(yàn)所采用的SPF級(jí)SD成年大鼠購(gòu)自北京維通利華生物科技有限公司，所有大鼠均為雄性，平均體重為290 g。SFP級(jí)SD新生大鼠16只，出生時(shí)間為72 h，每組8只，雌雄不限，購(gòu)自北京維通利華生物科技有限公司。

1.2 大鼠心肌肥厚模型構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)所有操作內(nèi)容及步驟均按照規(guī)定章程進(jìn)行。項(xiàng)目經(jīng)過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。將SD大鼠(動(dòng)物合格證號(hào)：110332220100014068) 使用氣體麻醉，之后在SD大鼠背部皮下植入含有血管緊張素Ⅱ的緩釋泵，緩釋劑量為1.5 mg·kg-1·d-1，實(shí)驗(yàn)周期為4周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)心肌肥厚標(biāo)志基因表達(dá)檢測(cè)心肌肥厚模型構(gòu)建是否成功。

1.3 大鼠原代心肌細(xì)胞分選與培養(yǎng) 取1～3 d日齡SD大鼠心室組織(合格證號(hào)：110322210103029728)，預(yù)冷PBS沖掉多余的血液，將剪碎至乳糜狀，37℃胰酶消化至單細(xì)胞懸液，終止消化后用40 μm濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，1 500 r/min離心后棄上清，將心肌細(xì)胞重懸后置于培養(yǎng)皿中，在37℃培養(yǎng)箱預(yù)貼壁2 h去除非心肌細(xì)胞，隨后輕輕將上層未貼壁的心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至其他培養(yǎng)皿培養(yǎng)待用。

1.4 siRNA介導(dǎo)基因沉默 利用RNAiMAX試劑盒將預(yù)先合成的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入心肌細(xì)胞。SiRNA靶點(diǎn)序列為5’-GAGTAACCAGGTGTCAACAATTGTA-3’。取20 nmol/L siRNA加入200 μl轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)基中，室溫靜置15 min；取4 μl RNAiMAX加入200 μl轉(zhuǎn)染用培養(yǎng)基中，室溫靜置15 min。將兩者混合之后室溫靜置15 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，干擾HECTD1的表達(dá)。

1.5 心肌細(xì)胞肥大模型 分離的原代心肌細(xì)胞靜置培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行血清剝奪培養(yǎng)24 h，隨后用血管緊張素Ⅱ(1 μmol/L)刺激48 h誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大。

1.6 Western blot 將待測(cè)樣本使用蛋白裂解液混勻后進(jìn)行裂解。樣本置于冰上30 min后，于4℃，12 000 r/min離心。取上清棄去沉淀。測(cè)定蛋白濃度之后，準(zhǔn)備30 μg蛋白進(jìn)行電泳。電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，之后進(jìn)行5%脫脂牛奶封閉抗原后進(jìn)行一抗孵育，孵育條件為4℃過(guò)夜。第2天將PDVF膜用洗膜緩沖液(tris buffered saline twee，TBST)緩沖液洗干凈后孵育對(duì)應(yīng)二抗，孵育條件為室溫 2 h。最后用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影分析蛋白表達(dá)水平。

1.7 qRT-PCR 使用細(xì)胞裂解液裂解組織或者細(xì)胞，提取總RNA，并對(duì)RNA進(jìn)行定量。使用qPCR方法對(duì)基因進(jìn)行定量檢測(cè)。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 ANP、BNP、MYH7和HECTD1在心肌肥厚患者中的表達(dá)比較 在心肌肥厚組中肥厚標(biāo)志基因ANP、BNP和MYH7均顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組比較，HECTD1表達(dá)水平在心肌肥厚組中顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 ANP、BNP、MYH7和HECTD1基因表達(dá)比較

2.2 HECTD1在心肌肥厚大鼠中的表達(dá) 血管緊張素Ⅱ處理可以顯著增加心肌肥厚標(biāo)志基因(ANP、BNP和MYH7)的表達(dá)，說(shuō)明心肌肥厚模型構(gòu)建成功。與對(duì)照組(1.00±0.13)比較，HECTD1的mRNA表達(dá)水平在大鼠Ang Ⅱ組(3.14±0.89)中顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 ANP、BNP、MYH7和HECTD1表達(dá)水平比較

2.3 SiRNA介導(dǎo)沉默 HECTD1 Western blot 結(jié)果顯示，與si-NC 組比較，si-HECTD1組條帶明顯減弱；定量分析結(jié)果表明，HECTD1干擾組(0.19±0.02)的表達(dá)水平顯著低于干擾對(duì)照組(1.00±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表4。

圖1 siRNA可以有效地降低HECTD1的蛋白水平

表4 HECTD1相對(duì)表達(dá)量

2.4 HECTD1沉默抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大 PBS Si-NC組心肌細(xì)胞面積與Ang Ⅱ Si-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。AngⅡ Si-HECTD1組心肌細(xì)胞面積與Ang Ⅱ Si-NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。AngⅡ Si-NC組誘導(dǎo)了心肌肥厚標(biāo)志基因ANP、BNP和MYH7的表達(dá)，使其升高為(3.21±0.31)、(3.82±0.30)和(4.11±0.30)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。敲低HECTD1的表達(dá)后，心肌細(xì)胞中ANP、BNP和MYH7的表達(dá)水平分別降低為(1.54±0.19)、(1.64±0.11)和(1.90±0.11)，與Ang Ⅱ Si-NC組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表5。

表5 干擾HECTD1有效抑制心肌肥大

2.5 HECTD1沉默抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的mTOR信號(hào)的激活 Western blot結(jié)果顯示，Si-NC組與PBS 處理比較，采用血管緊張素Ⅱ處理升高了心肌細(xì)胞中p-mTOR和p-S6K的蛋白表達(dá)水平，表明血管緊張素Ⅱ可以顯著激活mTOR-S6K信號(hào)通路，當(dāng)HECTD1被敲低以后(Si-HECTD1組)，心肌細(xì)胞中p-mTOR和p-S6K的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 沉默HECTD1表達(dá)抑制血管緊張素Ⅱ?qū)TOR通路活性

3 討論

心血管疾病已經(jīng)成為危險(xiǎn)人類(lèi)健康的最主要的風(fēng)險(xiǎn)因素。每年超過(guò)30%的死亡與心血管疾病相關(guān)[5]。

心肌肥厚是多種心血管疾病共有的發(fā)病基礎(chǔ)[6]，但筆者查閱后發(fā)現(xiàn)心肌肥厚的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。本研究中我們發(fā)現(xiàn)E3蛋白泛素連接酶HECTD1促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。在患者和大鼠肥厚心肌組織中，HECTD1的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著增加的表達(dá)特征。我們?cè)诖笫笤募〖?xì)胞中發(fā)現(xiàn)HECTD1可以促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大。分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)HECTD1可以抑制mTOR-S6K信號(hào)的激活。

蛋白泛素化修飾在心血管疾病中起著重要的調(diào)節(jié)作用[7]。HECTD1是一種E3蛋白泛素連接酶，其參與到細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程，并在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的角色。HECTD1調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Hsp90的定位和分泌，以控制顱間質(zhì)細(xì)胞行為[8]。在胎盤(pán)的交界區(qū)內(nèi)的多種類(lèi)型的細(xì)胞發(fā)育和分化過(guò)程中，HECTD1同樣起著非常關(guān)鍵的作用[9]。此外，HECTD1通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白泛素化修飾參與環(huán)狀NA在硒誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化過(guò)程中的功能[10]。HECTD1 促進(jìn)APC-Axin相互作用，從而負(fù)向調(diào)控Wnt信號(hào)[11]。HECTD1也可以通過(guò)泛素化調(diào)控IQGAP1蛋白水平，從而介導(dǎo)包括Paxillin和Actinin招募在內(nèi)的FXs的動(dòng)力學(xué)過(guò)程[12]。但是，我們發(fā)現(xiàn)HECTD1在心血管疾病中的功能尚不清楚。為了研究HECTD1在心肌肥厚中的潛在功能和分子生物學(xué)機(jī)制，我們首先在患者肥厚的心肌組織中研究了HECTD1的表達(dá)，結(jié)果顯示HECTD1在患者肥厚心肌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。同時(shí)，本研究也在大鼠中利用血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)了大鼠心肌肥厚，結(jié)果顯示在我們構(gòu)建的大鼠心肌肥厚模型中，HECTD1的表達(dá)水平也明顯增加。這些結(jié)果都提示HECTD1在心肌肥厚中可能起著重要的調(diào)節(jié)作用。

為了進(jìn)一步研究HECTD1在心肌細(xì)胞肥大中的功能，進(jìn)一步分離培養(yǎng)了大鼠原代心肌細(xì)胞并構(gòu)建了大鼠心肌細(xì)胞肥大的模型，即血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大。我們利用siRNA在原代大鼠心肌細(xì)胞中敲低了HECTD1的表達(dá)。結(jié)果顯示沉默HECTD1表達(dá)可以顯著地抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積的增大。同時(shí)，沉默HECTD1表達(dá)可以顯著地抑制血管緊張素Ⅱ?qū)π募》屎裣嚓P(guān)基因表達(dá)的激活作用。上述這些結(jié)果表明HECTD1促進(jìn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

心肌細(xì)胞的肥大過(guò)程受到多種胞外和胞內(nèi)信號(hào)的調(diào)控作用[13,14]。進(jìn)一步，本研究探討了HECTD1促進(jìn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的具體分子機(jī)制。心肌細(xì)胞的肥大受到多種胞外和胞內(nèi)的信號(hào)的調(diào)節(jié)作用[6]。mTOR信號(hào)是促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的關(guān)鍵信號(hào)分子之一。mTOR通過(guò)激活下游S6K信號(hào)控制細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞的肥大過(guò)程[13]。研究表明，利用雷帕霉素抑制mTOR的活性可以抑制心肌細(xì)胞肥大并阻止心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展[4]。而mTOR在心肌肥厚過(guò)程中如何被調(diào)控并不完全清楚[15]。在我們的心肌細(xì)胞肥大模型中，我們也觀察到mTOR-S6K信號(hào)被血管緊張素Ⅱ激活。此外，我們也發(fā)現(xiàn)沉默HECTD1可以顯著地抑制血管緊張素Ⅱ?qū)TOR-S6K的激活作用。這些結(jié)果提示HECTD1在心肌肥厚中調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)活性，并且HECTD1對(duì)mTOR的調(diào)控作用是其參與心肌細(xì)胞肥大非常重要的分子基礎(chǔ)之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HECTD1在心肌肥厚過(guò)程中高表達(dá)，HECTD1的高表達(dá)可以通過(guò)激活mTOR信號(hào)促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生和發(fā)展。因此，HECTD1可能成為潛在治療心肌肥厚的分子靶點(diǎn)。