基于NLRP3炎癥小體通路探討對(duì)氨基水楊酸鈉對(duì)錳所致認(rèn)知障礙的干預(yù)作用

溫平鏡，易 丹，梁桂強(qiáng)，覃光球，高玉秋，吳琪俊*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021）

錳是人體必需微量元素之一，對(duì)人體腦發(fā)育、骨骼和肌肉生長(zhǎng)等均有重要作用［1］。廣西為錳礦資源最豐富的地區(qū)之一，錳礦、錳冶煉及焊接作業(yè)等職業(yè)暴露人群會(huì)出現(xiàn)不同程度錳中毒表現(xiàn)，長(zhǎng)期過(guò)量的錳暴露還可導(dǎo)致兒童學(xué)習(xí)記憶力下降［2-3］。海馬是錳蓄積的主要腦區(qū)，該部位錳蓄積可導(dǎo)致機(jī)體認(rèn)知能力下降［4］。

NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體神經(jīng)炎癥可能是錳神經(jīng)毒性的重要機(jī)制。大腦中NLRP3 炎癥小體主要來(lái)源于小膠質(zhì)細(xì)胞，其被活性氧族（ROS）、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、細(xì)胞內(nèi)外Ca2+和K+穩(wěn)態(tài)失衡等多種信號(hào)刺激后發(fā)生寡聚化，募集接頭蛋白ASC，通過(guò)CARD 結(jié)構(gòu)域與PYD 結(jié)構(gòu)域相互作用，進(jìn)一步激活半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1），進(jìn)而加工白細(xì)胞介素1β 前體（pro-IL-1β）和白細(xì)胞介素18前體（pro-IL-18），釋放白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素18（IL-18），并釋放于細(xì)胞外發(fā)揮作用［5］。錳可激活小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞及BV2 細(xì)胞NLRP3 炎癥小體，導(dǎo)致IL-1β 表達(dá)升高［5］。錳誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子釋放依賴于NLRP3 炎癥小體的途徑［6］。據(jù)報(bào)道，錳作業(yè)工人血液腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β、白細(xì)胞介素6（IL-6）的水平隨著工齡延長(zhǎng)而升高，其神經(jīng)相關(guān)疾病檢出率也增加［7］；錳暴露無(wú)防護(hù)工人的TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)水平高于有防護(hù)工人，神經(jīng)中毒表現(xiàn)也更突出［8］。

對(duì)氨基水楊酸鈉（sodium para-aminosalicylate，PAS-Na）是一種非甾體類抗炎藥，此類藥物通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和阻斷炎癥反應(yīng)來(lái)拮抗多巴胺能神經(jīng)退行性改變［9-10］。錳中毒患者經(jīng)PAS-Na 治療后尿錳排出量增加，記憶力下降、頭痛、失眠、多夢(mèng)、疲乏、情緒不穩(wěn)等學(xué)習(xí)記憶表現(xiàn)及舌顫、意向震顫、單足站立不穩(wěn)等臨床癥狀有所改善，甚至恢復(fù)正常［11］。因此，本研究擬基于NLRP3 神經(jīng)炎癥小體通路探討PAS-Na 對(duì)錳所致認(rèn)知障礙的干預(yù)作用，為錳中毒防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 45只雄性SPF級(jí)SD 大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，體質(zhì)量（140±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2019-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)SPF 動(dòng)物房，室溫（23±2）℃，濕度（55±5）%，每天明暗交替光照12 h。本研究已獲得廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 MnCl2·4H2O（貨號(hào)：V900197-500G，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）；PAS-Na（國(guó)藥準(zhǔn)字H23021719，購(gòu)于哈藥集團(tuán)有限公司）；NLRP3（貨號(hào)：ab210494）、β-actin 抗體（貨號(hào)：ab8245）均購(gòu)自Abcam 公司；大鼠IL-1β（貨號(hào)：12/2020）、IL-18 ELISA 批試劑盒（貨號(hào)：12/2020）均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Go Script ?Reverse Transcription Mix 試 劑 盒（批 號(hào)：A5003）、Go Taq?q PCR Master Mix 試劑盒（批號(hào)：A6001）均購(gòu)于美國(guó)Promega公司。

1.3 儀器 DMS-2型Morris水迷宮（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；Infinite M1000 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)TECAN 公司）；Fluor Chem R 多功能成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple 公司）；1658033型號(hào)小型垂直電泳槽及其轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；ABI StepOnePlus PCR 儀（美國(guó)ABI公司）；Nexion 300D 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)PerkinElmer公司）。

2 方 法

2.1 分組及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、染錳組及低、中、高劑量PAS-Na 組（L-PAS-Na 組、M-PAS-Na 組、H-PAS-Na 組），每組9只。前8 周對(duì)照組大鼠注射生理鹽水，給藥體積為1.5 ml/kg，其余組大鼠均腹腔注射MnCl2·4H2O2，劑量為20 mg/kg，給藥體積為1.5 ml/kg，1 次/天，5 天/周；后6 周對(duì)照組和染錳組腹腔注射生理鹽水，L-PASNa 組、M-PAS-Na 組、H-PAS-Na 組分別背部皮下注射PAS-Na 100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg，給藥體積為1.5 ml/kg，1 次/天，5 天/周。觀察記錄大鼠進(jìn)食量、行為、毛發(fā)、大便、小便、注射部位有無(wú)感染等情況。

2.2 Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 給予PASNa 治療結(jié)束后，用Morris 水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶水平。在定位航行試驗(yàn)中，將每只大鼠依次從圓形泳池4 個(gè)象限中的固定位置放入水中，觀察大鼠找到Ⅳ象限的平臺(tái)耗時(shí)，即逃避潛伏期。若大鼠90 s 未找到平臺(tái)，則其逃避潛伏期記為90 s，并將其引至平臺(tái)休息60 s。試驗(yàn)持續(xù)5天以評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)能力。測(cè)試第6 天撤掉第Ⅳ象限平臺(tái)進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，讓大鼠從第Ⅱ象限入水，記錄其在120 s 內(nèi)首次穿越原平臺(tái)所在位置的游泳距離、穿越平臺(tái)總次數(shù)，以此評(píng)價(jià)大鼠記憶能力。

2.3 海馬分離及炎癥因子檢測(cè) 將大鼠麻醉后于冰上快速分離大鼠海馬，保存至-80 ℃冰箱備用。稱取20 mg 海馬，加入180 μl 預(yù)冷PBS 制備勻漿液，5 000 g 離心5 min 并收集上清液。按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)IL-18、IL-1β的含量。在酶標(biāo)板空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔分別加入50 μl PBS和50 μl標(biāo)準(zhǔn)品，樣本孔先加40 μl PBS再加10 μl樣本。37 ℃孵育30 min后洗板5 次，除空白孔外其余孔均加50 μl 酶標(biāo)試劑。繼續(xù)孵育30 min，洗板，先后加入A、B 顯色液，避光孵育15 min 后用50 μl 終止液終止反應(yīng)，以450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)各孔OD值。

2.4 海馬錳含量測(cè)定 取約50 mg 海馬，轉(zhuǎn)移至高壓密閉消解罐內(nèi)，加入4 ml HNO3于60~90 ℃條件下預(yù)消解2 h。然后加入1 ml H2O2，在120~170 ℃消化4 h。樣本室溫冷卻后放在140~160 ℃電熱板上趕酸，待溶液剩約1 ml 時(shí)停止趕酸，將液體轉(zhuǎn)移到EP 管中并定容至5 ml，混勻備用。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測(cè)定腦海馬濃度，以5 %HNO3作為溶液配制錳的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。若標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＞0.999，則進(jìn)行樣本測(cè)定，最后根據(jù)實(shí)測(cè)值算出元素濃度。濃度=（C-C0）×5.0/m，C：儀器實(shí)測(cè)樣本濃度；C0：空白對(duì)照測(cè)定值；m：樣本質(zhì)量。

2.5 蛋白表達(dá)檢測(cè) 用Wertern blotting法檢測(cè)NLRP3蛋白表達(dá)量。檢測(cè)海馬總蛋白濃度，用30%丙烯酰胺及10%過(guò)硫酸銨制成膠電泳分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉封閉后，再與NLRP3及β-actin 抗體孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST 沖洗后再與抗兔二抗孵育，最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯影，獲得照片并分析其灰度值。

2.6 熒光定量PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）

2.6.1 引物序列 Bax、Bcl2 引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見(jiàn)表1。

2.6.2 RNA 提取 稱20 mg 海馬用研缽?fù)耆ニ?，加? ml TRIzol，并將液體轉(zhuǎn)移到無(wú)核酸酶EP 管中，勻漿1 min。勻漿液靜置5 min后以10 000 g離心15 min，吸取上層水相約0.5 ml 轉(zhuǎn)移至另一EP 管，每管加入0.5 ml 異丙醇，緩慢顛倒數(shù)次混勻后靜置10 min。棄上清液后，自然晾5～10 min，加入50 μl DEPC 溶解RNA。用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定RNA 樣本濃度及質(zhì)量。

2.6.3 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)測(cè)得的RNA 濃度配制反應(yīng)體系（表2），體系中RNA 模板最終上樣量為1 μg。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃延伸20 min，95 ℃失活5 min，后置于冰上即得到c DNA。

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

2.6.4 qPCR 反應(yīng) 采用20 μl 反應(yīng)體系（表3），反應(yīng)程序：Stage 1：95 ℃10 min；Stage 2：95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)；Dissociation Stage：95 ℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。計(jì)算出各復(fù)孔的均值，用2-ΔΔCt計(jì)算各基因表達(dá)的相對(duì)值：

實(shí)驗(yàn)組ΔCt=實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct 值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值

對(duì)照組ΔCt=對(duì)照組目的基因Ct 值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值

ΔΔCt=實(shí) 驗(yàn) 組ΔCt-對(duì) 照 組ΔCt；基 因 相 對(duì) 表 達(dá)量=2-ΔΔCt

表3 qPCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

2.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊性，用單因素方差分析，采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 表示差異具有顯著性意義。

3 結(jié) 果

3.1 PAS-Na對(duì)染錳大鼠生長(zhǎng)發(fā)育的影響 染錳組和PAS-Na各劑量組大鼠在第1周就出現(xiàn)了不同程度的腹瀉、食欲不振、飲水減少、易激惹等現(xiàn)象。第2周開(kāi)始，部分大鼠毛發(fā)臟亂蓬松，有少量動(dòng)物脫毛，活動(dòng)減少，對(duì)照組未見(jiàn)異常。第9～14周為PAS-Na治療期，隨治療時(shí)間增加大鼠腹瀉及易激惹癥狀減少，但染錳組還存在此癥狀。第2~8周染錳組和L-PAS-Na組、M-PASNa組、H-PAS-Na組大鼠體重均低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），給予PAS-Na治療后，第9周后大鼠體重逐漸恢復(fù)，并接近對(duì)照組體重（P＞0.05）。而第9、10、11周染錳組體重仍低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表4。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化

表4 各組大鼠體質(zhì)量變化 （n=9，g，±s）

表4 各組大鼠體質(zhì)量變化 （n=9，g，±s）

時(shí)間點(diǎn)初重第1周對(duì)照組142.5±5.1 189.5±8.3染錳組144.7±6.9 185.9±11.4 L-PAS-Na組147.7±5.9 192.0±8.7 M-PAS-Na組147.1±8.3 188.6±9.6 H-PAS-Na組143.4±8.3 186.2±9.3

續(xù)表4

3.2 PAS-Na 對(duì)染錳大鼠海馬錳濃度的影響 見(jiàn)圖2及表5。染錳組海馬錳濃度高于對(duì)照組（P＜0.05），LPAS-Na、M-PAS-Na、H-PAS-Na 組治療后均可降低

圖2 各組大鼠海馬錳水平比較

3.3 PAS-Na對(duì)染錳大鼠學(xué)習(xí)記憶的干預(yù)作用 隨測(cè)試天數(shù)增加，各組大鼠平均游泳路程、逃避潛伏期均逐漸下降，其中，測(cè)試第2天染錳組游泳路程大于對(duì)照組（P＜0.05）。與染錳組比較，第5 天M-PAS-Na 組、HPAS-Na組逃避潛伏期均明顯降低（均P＜0.05）；與染錳海馬錳濃度（均P＜0.05）。結(jié)果提示，PAS-Na 具有促排錳作用。組比較，L-PAS-Na 組、M-PAS-Na 組、H-PAS-Na 組第3~5 天游泳路程縮短，M- PAS-Na 組、H-PAS-Na組穿越平臺(tái)次數(shù)增加，但差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）。見(jiàn)圖3～圖5及表6～表7。結(jié)果提示，PAS-Na治療可在一定程度上改善錳所致的認(rèn)知障礙。

表5 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠海馬錳水平的影響 （n=9，±s）

表5 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠海馬錳水平的影響 （n=9，±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與染錳組比較，②P＜0.05

組 別對(duì)照組染錳組L-PAS-Na組M-PAS-Na組H-PAS-Na組錳濃度（mg/kg）0.532±0.321 1.007±0.389①0.612±0.295②0.615±0.204②0.595±0.241②

圖3 各組大鼠游泳路程比較

圖4 各組大鼠逃避潛伏期比較

圖5 各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較

表7 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠逃避潛伏期及平臺(tái)穿越次數(shù)的影響 （±s）

表7 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠逃避潛伏期及平臺(tái)穿越次數(shù)的影響 （±s）

注：與染錳組比較，①P＜0.05

組 別對(duì)照組染錳組L-PAS-Na組M-PAS-Na組H-PAS-Na組n 9 9 9 9 9逃避潛伏期（s）第1天41.1±14.9 45.7±7.4 44.4±11.1 44.4±9.4 41.5±8.9第2天31.5±9.4 27.5±4.6 21.3±7.6 18.0±7.9 23.9±17.5第3天24.9±14.3 26.4±12.4 17.3±10.2 15.4±6.6 17.8±9.0第4天14.0±5.7 15.9±5.4 21.7±11.6 11.5±3.7 14.0±7.8第5天14.4±4.4 17.0±3.3 14.2±7.8 10.0±2.9①10.4±2.4①平臺(tái)穿越次數(shù)（次）5.5±1.5 5.3±2.2 5.4±2.8 7.0±2.4 5.8±1.5

表6 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠游泳距離的影響 （cm，±s）

表6 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠游泳距離的影響 （cm，±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05

組 別對(duì)照組染錳組L-PAS-Na組M-PAS-Na組H-PAS-Na組n 9 9 9 9 9第1天941.6±339.9 891.2±123.8 1 126.2±263.1 1 015.6±281.8 1 181.8±229.3第2天579.2±113.6 822.9±231.9①620.2±193.4 524.2±232.8 598.4±382.6第3天659.2±356.9 607.0±282.4 572.9±255.6 458.7±194.4 531.2±252.3第4天396.4±172.4 493.4±176.5 482.7±182.2 364.4±120.0 363.6±170.6第5天539.5±218.6 447.5±133.2 422.6±216.6 307.8±148.0 358.1±167.2

3.4 PAS-Na對(duì)染錳大鼠海馬凋亡基因表達(dá)的影響 見(jiàn)圖6 及表8。染錳組Bax mRNA 高于對(duì)照組，而B(niǎo)cl2 mRNA 低于對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05）；L-PAS-Na 組、M-PAS-Na 組、H-PAS-Na 組Bax mRNA 表達(dá)均低于染錳組（均P＜0.01），Bcl2 mRNA升高，但與染錳組比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。Bax/Bcl2比例決定細(xì)胞的凋亡過(guò)程，染錳組Bax/Bcl2 mRNA比率明顯高于對(duì)照組，經(jīng)PAS-Na 治療后Bax/Bcl2 的比率較染錳組明顯降低（均P＜0.01）。結(jié)果提示，PAS-Na對(duì)錳暴露所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因異常表達(dá)有拮抗作用。

圖6 PAS-Na對(duì)染錳大鼠海馬凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

表8 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠海馬凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 （±s）

表8 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠海馬凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與染錳組比較，③P＜0.01

組 別對(duì)照組染錳組L-PAS-Na組M-PAS-Na組H-PAS-Na組n 9 9 9 9 9 Bax相對(duì)表達(dá)量（倍）1.13±0.07 1.38±0.08②0.38±0.08③0.51±0.14③0.29±0.04③Bcl2相對(duì)表達(dá)量（倍）1.08±0.03 0.88±0.03①0.83±0.05 0.94±0.04 0.97±0.02 Bax/Bcl2相對(duì)表達(dá)量（倍）1.05±0.08 1.57±0.13②0.45±0.07③0.54±0.16③0.30±0.03③

3.5 PAS-Na 對(duì)染錳大鼠海馬NLRP3 及相關(guān)炎癥因子的影響 見(jiàn)圖7 及表9。染錳組NLRP3 蛋白表達(dá)量及IL-18、IL-1β 炎癥因子含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05 或P＜0.01）；經(jīng)PAS-Na 治療后，H-PAS-Na 組NLRP3 蛋白表 達(dá) 量及M-PAS-Na 組、H-PAS-Na 組IL-18 和IL-1β 的含量均下降（均P＜0.01 或P＜0.05）。結(jié)果提示，PAS-Na 對(duì)錳所致的NLRP3 神經(jīng)炎癥有抑制作用。

圖7 PAS-Na對(duì)染錳大鼠海馬NLRP3炎癥表達(dá)的影響

表9 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠海馬NLRP3、IL-1β、IL-18表達(dá)的影響 （±s）

表9 PAS-Na治療對(duì)染錳大鼠海馬NLRP3、IL-1β、IL-18表達(dá)的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與染錳組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組 別對(duì)照組染錳組L-PAS-Na組M-PAS-Na組H-PAS-Na組n 3 3 3 3 3 NLRP3相對(duì)表達(dá)量（倍）0.557±0.071 1.163±0.182②0.966±0.087 1.140±0.124 0.763±0.069④IL-1β（pg/g）665.1±53.1 816.7±72.8①841.5±59.6 591.4±121.3③604.2±137.4③IL-18（pg/g）2 135.3±288.4 3 101.8±323.2②2 680.5±190.4 1 886.5±424.3④1 801.7±579.6④

4 討 論

錳既是機(jī)體必需微量元素之一，也是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物，其來(lái)源主要有焊接、錳礦開(kāi)采及錳冶煉、殺菌農(nóng)藥、汽油防爆劑等［12］。體質(zhì)量作為生長(zhǎng)發(fā)育較直觀的指標(biāo)，一定程度上可以反映機(jī)體的中毒情況。研究顯示，錳暴露可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)食欲不振、腹瀉、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等癥狀，持續(xù)染錳動(dòng)物體重明顯降低［13］。本研究中，造模大鼠在第1周就出現(xiàn)胃腸功能紊亂、食欲不振、飲水減少、易激惹等疑似中毒癥狀。從第2周起造模大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)劑量依賴性下降，提示錳可致機(jī)體中毒。臨床研究發(fā)現(xiàn)，慢性錳中毒患者經(jīng)PAS-Na治療，尿錳大幅增加，是治療前的3～9 倍［14］；對(duì)比PAS-Na 和依地酸二鈉鈣兩種藥物治療錳中毒的療效，發(fā)現(xiàn)PAS-Na 可更好地排錳保鋅，利于錳中毒治療［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)PAS-Na 治療后異常癥狀基本消失，之后大鼠體質(zhì)量逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平。PAS-Na治療可使大鼠海馬錳濃顯著下降，提示PAS-Na具有排錳作用且對(duì)錳所致的大鼠體質(zhì)量降低有改善作用。

研究發(fā)現(xiàn)，用PAS-Na 對(duì)30 例慢性錳中毒患者進(jìn)行4～12 個(gè)不同療程治療后，患者神經(jīng)衰弱癥狀改善程度達(dá)到90%，情緒不穩(wěn)、腱反射亢進(jìn)、手指震顫等癥狀改善大于80%，指鼻不準(zhǔn)、單足站立不穩(wěn)、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀改善大于90%［16］，表明PAS-Na 對(duì)錳所致認(rèn)知障礙及類帕金森癥均有較好的改善作用。體內(nèi)研究亦顯示，PAS-Na 治療對(duì)錳中毒大鼠的學(xué)習(xí)記憶力下降有明顯拮抗作用［17］。本研究中，治療后PAS-Na高、中劑量組第4~5天逃避潛伏期均下降，且第3~5天游泳路程縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)亦高于染錳組。結(jié)果提示，PAS-Na 治療可在一定程度上改善錳所致的學(xué)習(xí)記憶力下降，但效果不是很明顯，這可能跟PAS-Na排錳的個(gè)體差異有關(guān)，延長(zhǎng)治療時(shí)間效果可能更顯著。

Bax和Bcl2是體內(nèi)主要的促凋亡基因和抗凋亡基因，其表達(dá)水平直接關(guān)系到細(xì)胞凋亡。韋福［18］給予小鼠染錳后發(fā)現(xiàn)海馬Bax 蛋白表達(dá)上升而B(niǎo)cl2 蛋白表達(dá)降低。體內(nèi)研究顯示，PAS-Na 治療或預(yù)防對(duì)錳暴露導(dǎo)致的大鼠基底核神經(jīng)元和海馬細(xì)胞凋亡有一定的拮抗作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，染錳組Bax mRNA 及決定凋亡過(guò)程的Bax/Bcl2 mRNA 表達(dá)升高，經(jīng)PAS-Na治療后，Bax mRNA 及Bax/Bcl2 mRNA 表達(dá)均下降。結(jié)果提示，PAS-Na 可抑制錳所致的海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

NLRP3 神經(jīng)炎癥可能是錳所致神經(jīng)毒性的重要機(jī)制，其與神經(jīng)細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。王迪雅［20］發(fā)現(xiàn)，錳暴露可致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力惡化，其海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，NLRP3、cleaved Caspase-1 蛋白表達(dá)升高，炎性因子IL-1β、IL-18和TNF-α 釋放量增加，IL-1β、IL-18 mRNA 表達(dá)也增加，在BV2 細(xì)胞中也觀察到了類似的結(jié)果。錳對(duì)于與小膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)的神經(jīng)元損傷作用強(qiáng)于單獨(dú)培養(yǎng)的神經(jīng)元，激活狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞可快速釋放TNF-α、IL-1β、IL-18 等炎癥因子，其介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡或變性壞死［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，染錳組NLRP3 蛋白表達(dá)升高，IL-1β 和IL-18 水平亦升高。PAS-Na 治療錳中毒的機(jī)制包括抗氧化作用和螯合作用，此外還有抗炎作用［16，23-25］。體內(nèi)研究顯示，錳暴露可致海馬、丘腦及皮層PGE2、IL-1β、IL-6和TNF-α 含量升高，而PAS-Na 可以逆轉(zhuǎn)這種情況，尤其在海馬和丘腦最為明顯［22］。本研究顯示，PAS-Na治療后NLRP3蛋白表達(dá)下降，IL-1β、IL-18水平下降。結(jié)果提示，PAS-Na 對(duì)錳介導(dǎo)的NLRP3 炎癥具有拮抗作用，但其確切機(jī)制尚需研究。

綜上所述，錳暴露可能通過(guò)激活大鼠海馬NLRP3炎癥小體通路介導(dǎo)海馬細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)認(rèn)知障礙，PAS-Na可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體通路介導(dǎo)的海馬細(xì)胞凋亡改善錳所致認(rèn)知障礙。