防栓膠囊含藥血清體外誘導骨髓間充質干細胞移植對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠血管新生的影響

趙 昆，盧 磊，劉曉丹，嚴思敏，胡安康，李尚洪，王忠良

（1.南京中醫(yī)藥大學研究生院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學附屬徐州市中醫(yī)院，江蘇 徐州221001；3.南京鼓樓醫(yī)院，江蘇 南京 210000；4.徐州醫(yī)科大學，江蘇 徐州 221000）

心肌缺血后再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）指冠狀動脈部分或完全急性阻塞后，在一定時間內重新獲得再通時，缺血心肌雖然得以恢復正常灌注，但其組織損傷反而呈進行性加重的病理過程。IRI 可通過氧化應激、炎癥等反應，引起心肌細胞凋亡、頓抑、壞死，從而減少心肌細胞存活數(shù)量，最終導致再灌注不良［1］。血管新生是保護心肌免除IRI 的機制之一，研究證實，骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）能在特定環(huán)境下分化為血管內皮細胞，促進心肌血管新生［2］，從而減輕患者的臨床癥狀和體征［3-4］。

防栓膠囊為南京中醫(yī)藥大學附屬徐州市中醫(yī)院院內制劑，由制首烏、槲寄生、制大黃、水蛭、石菖蒲、全蝎、川芎等組成。前期研究發(fā)現(xiàn)，防栓膠囊能減輕冠心病患者心臟血管內皮損傷，預防經皮冠狀動脈支架植入術后再狹窄［5］。本文通過體外實驗研究防栓膠囊含藥血清體外誘導骨髓間充質干細胞（BMSCs）移植對心肌缺血再灌注損傷（IRI）血管新生的作用，以期進一步明確該制劑在改善IRI血管新生的機制。

1 實驗材料

1.1 動物 BMSCs 取材動物：健康雄性SPF 級5 周齡SD 大鼠20只，體質量（100±10.5）g；含藥血清制備、IRI模型及給藥動物：健康雄性SPF 級8 周齡SD 大鼠112只，體質量（230±20.1）g；由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SYXK（京）2017-0033。動物飼養(yǎng)條件：溫度22～25 ℃，濕度（55±5）%，常規(guī)喂養(yǎng)。實驗全程符合動物倫理學要求。

1.2 主要試劑 胎牛血清（批號：NWG0445，Hyclone公司）；預染蛋白Marker（貨號：SM0441，F(xiàn)ermentas 公司）；PMSF（貨號：10837091001，Roche 公司）；蛋白裂解 液（RIPA）、1.5 mol/L Tris HCl（pH 6.8）、1.5 mol/LTris HCl（pH 8.8），均為碧云天生物技術研究所產品；ECL 發(fā)光液（貨號：32132，Thermo Fisher Scientific 公司）；Trizol（貨號：9108-1，Takara公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC，貨號：E174，Amresco 公司）；PCR 引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Anti-VEGF（血管內皮生長因子）抗體購自Affinity Biosciences 公司，Anti-Ang-1（血管生成素-1 抗體）購自Abbexa 公司，Anti-PDGFB（血小板衍生生長因子B 抗體）、Anti-GAPDH（3-磷酸甘油醛脫氫酶抗體）、Anti-CD34、Anti-CD45、Anti-CD90、Anti-Ⅷ（人凝血因子Ⅷ抗體）購自Abcam公司。

1.3 藥物 防栓膠囊由南京中醫(yī)藥大學附屬徐州市中醫(yī)院制劑室制備，批準文號：蘇藥制字Z04002019；規(guī)格：每粒0.25 g；批號：XZY201804011127。

2 方 法

2.1 大鼠BMSCs 的分離 以頸椎脫臼法處死5 周齡SD 大鼠20 只，浸泡在75%乙醇中10~15 min，無菌操作下取出脛骨和股骨，并暴露骨髓腔，抽取DMEM 培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔，將沖洗液收集于離心管中，1∶1緩慢加入Percoll 液中，離心10 min，去上清，用完全培養(yǎng)基重懸細胞，反復吹打，制備單細胞懸液，以每毫升1×106個密度接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶細胞懸液5 ml；置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下常規(guī)培養(yǎng)，48 h后換液。

2.2 體外培養(yǎng)大鼠BMSCs 及鑒定 傳代培養(yǎng)BMSCs，將傳代細胞依次標記為P1、P2、P3、P4。P3 代細胞生長至80%～90%融合時，收集細胞，分別使用500 μl PBS制備4管單細胞懸液（包括3個檢測抗體組和1 個陰性對照組），按分組向流式管中加入CD34 抗體、CD45 抗體、CD90 抗體各10 μl，陰性對照組加入等量PBS。檢測細胞表面抗原表達，以CD90 陽性率高于95%和CD34、CD45 陽性率低于5%為高純度的BMSCs標準。

2.3 含藥血清及空白血清的制備 取8 周齡SD 大鼠16 只，一周適應期后隨機抽取8 只制備含藥血清，另8只制備空白血清。含藥血清的制備：每只大鼠灌服中藥復方防栓膠囊［劑量為5.94 g/（kg·d）］，每天2 次，每次2 ml，連續(xù)3 d。末次給藥1 h后常規(guī)麻醉，腹主動脈處無菌采血，分離含藥血清，混合同組血清，于56 ℃水浴中滅活30 min，再以0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃冰箱中備存?？瞻籽宓闹苽洌捍笫蠊喾攘可睇}水，每天2次，連續(xù)3 d，同含藥血清制備方法處理制備空白血清，備存。

2.4 BMSCs 的體外誘導 將生長狀態(tài)良好的P5 代BMSCs 分別移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，貼壁并見到50%～60%融合后，分別加入空白血清及防栓膠囊含藥血清，以20%為其體積終濃度，均誘導分化72 h，培養(yǎng)中各換液1次。

2.5 IRI 大鼠模型的建立 取健康雄性SPF 級8 周齡SD 大鼠，使用10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉大鼠后，行氣管切開術，并插管接入小動物呼吸機，設定呼吸頻率為60次/分鐘，呼吸比為1.5∶1，潮氣量為100 ml。待呼吸穩(wěn)定后，沿胸骨左緣切開皮膚，分離肌肉，剪斷3～4肋骨，將肺動脈圓錐和左心耳間與左冠狀動脈伴行的冠狀靜脈暴露于視野下，予以結扎。用3/0 號帶線縫合針于左心耳根部1～2 mm 處結扎左冠狀動脈，結扎線下置雙股2 號線做松解用。阻斷左冠狀動脈30 min，再灌注90 min。造模成功標準：以心電圖提示心率失常，QRS 波群增高、增寬，ST 段、T 波進行性抬高為大鼠心肌缺血的表現(xiàn)。在結扎大鼠冠狀動脈左前降支即刻可出現(xiàn)短暫的R 波異常增高，心律失常多出現(xiàn)在結扎后5～10 min。結扎30 min 后剪斷結扎線，讓冠狀動脈恢復血液流通。冠狀動脈再通表現(xiàn)為：再灌注15 min 內心電圖表現(xiàn)為ST 段和T 波快速回落大于50%，15～20 min 后出現(xiàn)Q 波或原有Q波加深。再灌注持續(xù)進行時，Q 波也不斷加深、加寬。再灌注早期，可見心率失常，以室性心動過速和心室顫動為主。

2.6 動物分組與干預 取8周齡大鼠96只，隨機分為假手術組、IRI 模型組、空白血清誘導組和含藥血清誘導組，每組各24 只。假手術組僅分離而不結扎，余3組均建立IRI 大鼠模型。取DMEM 培養(yǎng)液100 μl 2份，用微量注射器分3 個位點（3 點鐘、6 點鐘、9 點鐘方位）分別注射到假手術組、IRI 模型組大鼠梗死部位邊緣的心肌組織中；取空白血清體外誘導的BMSCs 細胞懸液、含藥血清體外誘導的BMSCs細胞懸液各100 μl，用微量注射器分3 個位點（3 點鐘、6 點鐘、9 點鐘方位）分別注射到空白血清誘導組、含藥血清誘導組。移植后常規(guī)關閉胸腔，待大鼠可自主呼吸后，拔除氣管插管，停用呼吸機，逐層縫合，創(chuàng)面消毒，并注射青霉素防止感染，置于單籠喂養(yǎng)。于移植后3 d、7 d、14 d進行相應指標的檢測。

2.7 Western blot 檢測各組心肌組織中VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達 采用添加苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA 裂解液裂解心肌組織后離心5 min，抽提得到組織蛋白，并通過SDS-PAGE 分離目標蛋白。將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，將膜上的殘余液體用TBST 緩沖液洗干凈，并加入用TBST 緩沖液稀釋至適宜濃度的一抗，袋口密封，4 ℃下過夜。剪開自封袋，用TBST緩沖液洗膜3 次。加入適量適宜濃度的二抗，密封袋口，室溫下孵育1 h。然后打開密封袋，用TBST 洗膜3次。將化學發(fā)光試劑A 液與B 液等體積混合，用Tanon6600發(fā)光成像工作站進行圖像采集。

2.8 Real-time PCR 檢測各組心肌組織中VEGF、Ang-1、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α）及腎上腺素能受體β3（ADRB3）的mRNA 含量 用預冷PBS 洗滌心臟組織2 次，在液氮下把組織樣品充分研磨成粉末，裝入有Trizol 的EP 管中劇烈振蕩，靜置10 min，離心15 min，取上清加等量異丙醇后劇烈振蕩，-20 ℃下靜置30 min，讓RNA 沉淀，再離心10 min，去上清。加入1 ml 75%乙醇洗滌，離心5 min，棄上清，自然干燥5~10 min。用DEPC 水10 μl 溶解RNA，吹打混勻，得到總RNA 溶液，取2 μl 樣品，使用Nanodrop2000 測定microRNA 的 濃 度 和 純 度。cDNA 合 成采用20 μl 體系，25 ℃反應5 min，42 ℃反應30 min，85 ℃反應5 min，獲得cDNA，-70 ℃保存。實時定量PCR 采用20 μl 體系，于8 聯(lián)管內加入預混合的試劑，密封，置于儀器內，調整反應參數(shù)，進行擴增，結果以2-ΔΔCt進行計算，所用引物見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

2.9 免疫組化試驗（IHC）檢測各組心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子和CD34的表達 將石蠟切片置于電熱恒溫干燥箱中，60 ℃烘烤3 h；隨后用乙醇水化、蒸餾水洗，抗原修復；之后滴加3%H2O2滅活內源性酶。每張切片滴加正常山羊免疫血清封閉，滴加第一抗體（1∶100稀釋），4 ℃冰箱中過夜。取出并達到室溫后，給每張切片分別滴加聚合物增強劑（試劑A）和酶標抗鼠兔聚合物（試劑B），DAB顯色，蘇木素復染，蒸餾水充分水洗終止顯色。切片脫水干燥并封片后用相差顯微鏡在200倍視野下拍照。陽性表達為棕黃色顯色，且強度明顯高于背景無特異性染色的部位，細胞核為淺藍色顯色。

2.10 統(tǒng)計學分析 計量數(shù)據以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間差異采用GraphPad Prism 中Tukey-Kramer HSD post test進行分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 BMSCs 生長的形態(tài)學特征 于倒置相差顯微鏡中觀察到剛接種的原代細胞為圓形，懸浮于培養(yǎng)液中，24 h 后可見大部分已貼壁。如圖1 所示，2 d 后換液，除去懸浮細胞，換液后可見部分細胞貼壁，多為圓形；4 d 后細胞出現(xiàn)不同形態(tài)，后伸出2～3 個小突起，呈三角形、短梭形、多邊形改變，有的細胞兩極端有細絲，細胞位置較分散，核較大、位于細胞中央或邊緣；培養(yǎng)6 d 后細胞呈梭形的成纖維細胞樣，部分呈寬大扁平的多邊形，并以克隆集落方式快速增殖；原代細胞培養(yǎng)10 d 時，細胞密集排列，融合成單層。于細胞融合達到80%～90%后，予以首次傳代，可見傳代細胞快速生長，24 h內完全貼壁，6 d可見鋪滿底部；細胞融合再次達到80%～90%后，第二次傳代培養(yǎng)，第3代時可見細胞形態(tài)呈較均勻一致的平行樣、紡錘形或漩渦樣生長。

圖1 BMSCs生長的形態(tài)學特征（×200）

3.2 BMSCs 表面抗原的鑒定 用流式細胞儀檢查內皮細胞表面抗原CD90、CD45、CD34 時，可見CD90 陽性表達率為94.2%（C），CD45 陽性表達率為0.7%（B），CD34陽性表達率為0.4%（A）。表明細胞均一性較好，純度較高，符合實驗要求。見圖2。

圖2 大鼠BMSCs表面抗原CD34、CD45和CD90的表達

3.3 各組心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子的表達情況 見圖3、表2。再灌注后，與假手術組同時相點比較，模型組、空白血清誘導組及含藥血清誘導組中心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子的表達均有不同程度的升高（P＜0.05），且含藥血清誘導組和空白血清誘導組明顯高于模型組；再灌注3 d 時，Ⅷ因子在含藥血清誘導組和空白血清誘導組的心肌組織中無顯著性差異，而再灌注7 d、14 d后，含藥血清誘導組中Ⅷ因子的含量明顯高于空白血清誘導組（P＜0.05）。

圖3 各組心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子的表達

表2 各組心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子的表達比較 （±s）

表2 各組心肌邊緣區(qū)Ⅷ因子的表達比較 （±s）

注：與假手術組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與空白血清誘導組比較，③P＜0.05；下同

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n8 8 8 8 3 d 395.56±56.23 512.72±60.22①744.28±63.32①②775.03±78.26①②7 d 415.53±77.12 602.65±68.42①790.65±49.03①②924.37±43.49①②③14 d 402.29±51.01 629.35±95.18①826.98±53.67①②1 043.87±64.35①②③

3.4 各組心肌邊緣區(qū)CD34的表達情況 見圖4、表3。再灌注后，與假手術組同時相點比較，模型組、空白血清誘導組及含藥血清誘導組中心肌邊緣區(qū)CD34 的表達均有不同程度的升高（P＜0.05），且含藥血清誘導組和空白血清誘導組明顯高于模型組；再灌注3 d 時，CD34 在含藥血清誘導組和空白血清誘導組的心肌組織中無顯著性差異，而再灌注7 d、14 d 后，含藥血清誘導組中的CD34 含量明顯高于空白血清誘導組（P＜0.05）。再灌注14 d 時CD34 在含藥血清誘導組及空白血清誘導組中的表達均達到峰值。

圖4 各組心肌邊緣區(qū)CD34的表達

表3 各組心肌邊緣區(qū)CD34的表達情況 （±s）

表3 各組心肌邊緣區(qū)CD34的表達情況 （±s）

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n 8 8 8 8 3 d 376.54±63.87 539.62±52.67①680.42±56.75①②676.40±78.32①②7 d 390.63±82.59 572.95±55.31①830.08±43.41①②854.08±52.85①②③14 d 390.39±58.96 617.38±80.19①859.93±43.63①②919.46±114.46①②③

3.5 各組心肌組織中VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達情況 見圖5、表4、表5、表6。再灌注后，與假手術組同時相點比較，模型組、空白血清誘導組以及含藥血清誘導組的心肌組織中VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達均有不同程度的升高（P＜0.05）；再灌注3 d 時，空白血清誘導組與模型組中VEGF 的表達比較無顯著性差異，其余各個不同時相點含藥血清誘導組和空白血清誘導組中VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達均明顯高于模型組；VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達在含藥血清誘導組的心肌組織隨著灌胃時間的延長而逐步升高，14 d 時達到峰值，且各個時相點VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達均高于空白血清誘導組（P＜0.05）。

圖5 各組心肌組織中VEGF、Ang-1、PDGFB的表達

表5 各組心肌組織中Ang-1的表達情況 （±s）

表5 各組心肌組織中Ang-1的表達情況 （±s）

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n 8 8 8 8 3 d 1.17±0.20 1.79±0.17①2.16±0.12①②2.94±0.09①②③7 d 1.06±0.14 1.76±0.16①2.57±0.17①②3.22±0.10①②③14 d 1.03±0.16 1.73±0.22①2.41±0.15①②3.90±0.29①②③

表4 各組心肌組織中VEGF的表達情況 （±s）

表4 各組心肌組織中VEGF的表達情況 （±s）

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n 8 8 8 8 3 d 0.95±0.18 1.85±0.17①1.93±0.09①2.87±0.13①②③7 d 0.97±0.18 1.86±0.18①2.31±0.14①②3.06±0.14①②③14 d 0.92±0.05 1.80±0.18①2.50±0.14①②3.99±0.27①②③

表6 各組心肌組織中PDGFB的表達情況 （±s）

表6 各組心肌組織中PDGFB的表達情況 （±s）

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n8 8 8 8 3 d 0.87±0.18 1.78±0.19①1.96±0.12①②2.28±0.17①②③7 d 0.90±0.14 1.50±0.19①1.86±0.10①②3.05±0.15①②③14 d 0.88±0.13 1.34±0.12①1.89±0.10①②3.99±0.36①②③

3.6 各 組 心 肌 組 織 中VEGF、Ang-1、PPAR-α 及ADRB3 的mRNA 含量的表達情況 見表7 至表10。再灌注后，與假手術組同時相點比較，模型組、空白血清誘導組以及含藥血清誘導組的心肌組織中VEGF、Ang-1、PPAR-α 及ADRB3 的mRNA 含量均有不同程度的增加（P＜0.05）；再灌注3 d 時，空白血清誘導組與模 型 組 中VEGF、Ang-1、PPAR-α 以 及ADRB3 的mRNA 含量比較無顯著性差異，其余各個不同時相點含藥血清誘導組和空白血清誘導組中VEGF、Ang-1、PPAR-α 以及ADRB3 的mRNA 含量均明顯高于模型組；VEGF、Ang-1、PPAR-α以及ADRB3的mRNA 含量在含藥血清誘導組的心肌組織中隨著灌胃時間的延長而逐步升高，14 d 時達到峰值，且各個時相點VEGF、Ang-1、PPAR-α 以及ADRB3 的mRNA 含量均高于空白血清誘導組（P＜0.05）。

表7 各組心肌組織中VEGF mRNA的含量表達 （±s）

表7 各組心肌組織中VEGF mRNA的含量表達 （±s）

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n 8 8 8 8 3 d 0.85±0.03 1.61±0.06①1.64±0.08①2.84±0.21①②③7 d 0.88±0.09 1.77±0.07①2.65±0.13①②5.07±0.20①②③14 d 0.84±0.09 1.93±0.07①2.73±0.12①②10.08±0.25①②③

表8 各組心肌組織中Ang-1 mRNA的含量表達 （±s）

表8 各組心肌組織中Ang-1 mRNA的含量表達 （±s）

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n 8 8 8 8 3 d 0.97±0.05 1.81±0.06①1.89±0.06①2.93±0.05①②③7 d 1.13±0.04 1.96±0.06①2.21±0.11①②3.48±0.15①②③14 d 1.10±0.04 1.97±0.05①2.49±0.08①②4.49±0.07①②③

表9 各組心肌組織中PPAR-α mRNA的含量表達 （±s）

表9 各組心肌組織中PPAR-α mRNA的含量表達 （±s）

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n 8 8 8 8 3 d 0.87±0.04 1.57±0.08①1.60±0.07①1.99±0.03①②③7 d 0.90±0.02 1.47±0.06①2.09±0.03①②3.08±0.14①②③14 d 0.82±0.01 1.58±0.05①2.40±0.07①②4.86±0.06①②③

表10 各組心肌組織中ADRB3 mRNA的含量表達 （±s）

表10 各組心肌組織中ADRB3 mRNA的含量表達 （±s）

組別假手術組模型組空白血清誘導組含藥血清誘導組n 8 8 8 8 3 d 0.88±0.04 1.43±0.07①1.56±0.21①1.92±0.10①②③7 d 0.91±0.03 1.53±0.02①1.94±0.43①②2.60±0.10①②③14 d 0.99±0.04 1.52±0.01①2.17±0.26①②3.92±0.02①②③

4 討 論

缺血發(fā)生時，腺苷酸環(huán)化酶活性和細胞內cAMP水平降低，從而打破內皮細胞屏障，增加血管通透性和滲漏，減少線粒體ATP 的產生［6］。再灌注時，線粒體產生的活性氧簇ROS 增加，ATP 生成進一步減少，線粒體通透性轉移水平提高，從而進一步加重內皮功能障礙，DNA 受到損傷［7-8］。長期的I/R 損傷會引起纖維化瘢痕組織的生成，以及受損部位的結構改變和功能降低［9］。

BMSCs 是在標準培養(yǎng)條件下能夠保持可塑性的多能細胞，其內皮細胞表面抗原CD90 表達水平較高，CD45、CD34 表達相對較低［10］。本文觀察結果與此一致，培養(yǎng)得到的內皮細胞表面抗原CD90 陽性表達率為94.2%，CD45陽性表達率為0.7%，CD34陽性表達率為0.4%，說明本研究中BMSCs 貼壁生長良好，純度較高。

在血管新生過程中，CD34 和Ⅷ因子是內皮細胞主要的表面標志物［11］，其機制可能與CD34 細胞表面蛋白的分化、細胞遷移和黏附作用相關，CD34 基因敲除老鼠最明顯的功能缺陷之一是HSC 的嚴重遷徙障礙，從而降低骨髓的再增殖能力［12］；而與Ⅷ因子相對應的抗原位于內皮細胞的Weibel-palada小體上，可以較好地顯示觀察目標中的小動脈、小靜脈和毛細血管，因此本實驗選擇此兩種因子來判斷IRI 模型大鼠梗死心肌邊緣區(qū)的恢復情況。此外，BMSCs 能夠促進并分泌功能性Ⅷ蛋白因子［13］。本研究結果顯示：7 d 后含藥血清誘導組中CD34 和Ⅷ因子的含量明顯高于空白血清誘導組（P＜0.05），14 d時CD34和Ⅷ因子在含藥血清誘導組以及空白血清誘導組中的表達均達到峰值。由此可知，防栓膠囊能夠加強BMSCs 促進缺血心肌新生血管的生成，改善缺血區(qū)的血液灌注，從而發(fā)揮保護缺血心肌的作用。

BMSCs具有免疫抑制和促血管生成的作用［14］，能夠在缺血組織中產生血管生成因子，從而促進IRI 組織的恢復［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，再灌注后，同時相點的模型組、空白血清誘導組以及含藥血清誘導組與假手術組相比，心肌組織中VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達均有不同程度的升高（P＜0.05），再灌注3 d 時，空白血清誘導組和模型組中VEGF 的表達無顯著性差異，其余各個不同時相點含藥血清誘導組和空白血清誘導組中VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達均明顯高于模型組；VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達在含藥血清誘導組的心肌組織隨著時間的延長而逐步升高，于14 d 時達到峰值，且各個時相點VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達均高于空白血清誘導組。VEGF 屬于酪氨酸激酶受體，其受體只存在于內皮細胞中，在血管新生過程中具有重要作用［16］。Ang-1 和其受體Tie1、Tie2 在血管新生過程中具有重要調控作用，可促進血管穩(wěn)定性和抑制纖維化，與VEGF 發(fā)揮協(xié)同作用，能夠誘導血管出芽生長，使其形成血管，并且外源性使用或局部使用Ang-1可減少心肌梗死面積，促進新生血管，提高組織灌注，改善心臟功能，為血管形成末期特異標志［17］。PDGFB具有趨化、縮血管、促分裂、激活磷酸酰脂酶和前列腺素代謝等作用，激活創(chuàng)傷部位的免疫系統(tǒng)，誘導受損的內皮細胞分裂增殖，促進血管形成和再生。再灌注損傷發(fā)生時，VEGF、Ang-1、PDGFB 被激活，對損傷的內皮細胞起到保護作用，BMSCs 能夠進一步提高VEGF、Ang-1、PDGFB 的表達，從而進一步修復受損的內皮和促進血管的新生。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)VEGF、Ang-1、PPAR-α 以及ADRB3 的mRNA 含量在含藥血清誘導組的心肌組織中隨著灌胃時間的延長而逐步升高，14 d 時達到峰值。ADRB3 作為G 蛋白耦聯(lián)受體超家族成員之一，能夠通過交感神經動員MSCs 遷移和分化［18］。PPAR-α 作為核超家族的一類依賴配體的轉錄因子，能夠通過ERK1/2 信號通路參與抑制心肌重塑［19］，通過抑制AKT/mTOR，間接抑制VEGF的釋放，因此PPAR-α可間接刺激VEGF的釋放并最終導致血管新生［20］。

本研究發(fā)現(xiàn)，防栓膠囊含藥血清體外誘導BMSCs移植能夠上調BMSCs 細胞表面抗原CD34 表達，從而促進BMSCs 分化、增殖；并通過自分泌或旁分泌的方式分泌血管生長相關因子VEGF、Ang-1、PDGFB，上調VEGF、Ang-1、PPAR-α 以及ADRB3 的mRNA 表達，促進血管新生，從而保護IRI造成的心肌損傷。