MEBT／MEBO 對(duì)大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中血管新生的影響研究

魏德華 王 成 陳世玖 劉瓏玲 劉 宇

糖尿病潰瘍是長期高糖環(huán)境刺激機(jī)體正常組織所致的局部細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損及功能改變， 常伴有周圍神經(jīng)血管病變和感染［1］。 近年來隨著對(duì)糖尿病潰瘍認(rèn)識(shí)的不斷深入， 部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)新生血管形成過程中斷可導(dǎo)致創(chuàng)面血供不足， 嚴(yán)重影響肉芽組織形成及上皮組織再生， 進(jìn)而延遲糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合［2－4］， 而血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 作為目前已知促進(jìn)血管生成的最有效且直接的血管生成因子， 具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、 促進(jìn)血管重構(gòu)及血管新生等作用， 在血管新生過程中必不可少［5］； CD34 作為重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物， 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，可反映創(chuàng)面血管新生情況［6－7］。 諸多臨床研究表明［8－9］， 創(chuàng)瘍?cè)偕t(yī)療技術(shù) （moist exposed burn treatment／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO）可促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中微血管的形成、 成纖維細(xì)胞的增殖與毛細(xì)血管的再生［10－11］， 在糖尿病潰瘍創(chuàng)面的治療中取得了較好的臨床療效。 但從VEGF 與CD34 角度分析MEBT／MEBO 作用機(jī)制的研究鮮見報(bào)道。 鑒于此， 本研究筆者對(duì)其進(jìn)行研究分析， 以期為MEBT／MEBO 的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 ～12 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只， 體質(zhì)量220 ～250 g， 均購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司， 并飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室， 室溫控制在20 ～25 ℃， 相對(duì)濕度控制在60%， 單籠飼養(yǎng)， 自由飲水、 進(jìn)食。 本研究經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與設(shè)備

濕 潤 燒 傷 膏 （moist exposed burn ointment，MEBO）： 汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn)， 國藥準(zhǔn)字Z20000004； 鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）：北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)； 一次性使用負(fù)壓引流護(hù)創(chuàng)材料： 蘇州愛得科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)， 蘇食藥監(jiān)械 （準(zhǔn)） 字2011 第2661009 號(hào)； 希迪克HB?V?B?100 便攜式負(fù)壓引流器： 河南匯博醫(yī)療股份有限公司生產(chǎn)， 豫械注準(zhǔn)20172540896； 異氟烷：深圳市瑞沃德生命科技有限公司生產(chǎn)； 免疫組化試劑盒： 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)；Rabbit?anti?CD34： 北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)； VEGF、 β?actin 引物序列： 生工生物工程（上海） 股份有限公司生產(chǎn)； One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT?PCR Kit Ⅱ（SYBR Green）： 日本TaKaRa 公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 模型制備與分組

60 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后， 禁食12 h， 采用隨機(jī)數(shù)表法將其隨機(jī)分為模型對(duì)照組、 MEBO 組和VSD 組， 每組20 只。 所有大鼠均于腹腔注射1% STZ （40 mg／kg） 建立糖尿病模型， 待出現(xiàn)多飲、 多食、 多尿、 體重明顯減輕等癥狀且隨機(jī)血糖≥16.7 mmol／L 即視為糖尿病大鼠模型制備成功； 繼而， 3%異氟烷吸入麻醉， 背部備皮、 消毒后， 于背部相同位置做直徑2.0 cm 深達(dá)筋膜層的全層皮膚缺損創(chuàng)面。

2.2 創(chuàng)面處理

模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面采用凡士林油紗換藥處理， 常規(guī)碘伏消毒、 無菌紗布拭凈后， 依次覆蓋凡士林油紗及無菌干紗布包扎固定， 每天換藥1 次；MEBO 組大鼠創(chuàng)面采用MEBO 換藥處理， 常規(guī)碘伏消毒、 無菌紗布拭凈后， 均勻涂抹MEBO， 并依次覆蓋MEBO 藥紗及無菌干紗布包扎固定， 每天換藥1 次； VSD 組大鼠創(chuàng)面采用負(fù)壓封閉引流（vacuum sealing drainage， VSD） 處理， 常規(guī)碘伏消毒、 無菌紗布拭凈后， 放置聚氨脂吸水纖維敷料（放置面積大于創(chuàng)面邊緣0.5 cm） 并固定， 疊瓦式粘貼半透膜， 連接便攜式負(fù)壓引流器持續(xù)負(fù)壓引流， 壓力控制在－100 ～－80 KPa， 每3 d 更換1 次聚氨脂吸水纖維敷料。

2.3 標(biāo)本采集與處理

分別于干預(yù)第7、 14 天， 每組隨機(jī)選取6 只大鼠， 于異氟烷麻醉后在超出創(chuàng)緣0.3 cm 處完整切除整塊創(chuàng)面肉芽組織， 并將其均分為2 份后， 一份置于凍存管中， 放入液氮罐保存?zhèn)溆茫?一份用濾紙包裹置于包埋盒中， 放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 創(chuàng)面愈合率

分別于干預(yù)第3、 7、 10、 14 天， 隨機(jī)選取6只大鼠將標(biāo)尺置于創(chuàng)面邊緣后對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行拍照， 使用Image J 軟件測(cè)定創(chuàng)面面積， 計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率＝ （創(chuàng)面初始面積－ 時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積） ／創(chuàng)面初始面積×100%。

2.5 CD34 免疫組化染色檢測(cè)創(chuàng)面組織微血管密度（microvascular density， MVD）

取4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆玫慕M織， 常規(guī)予以脫水、 石蠟包埋、 切片、 脫蠟后進(jìn)行CD34 免疫組化染色， 于50 倍光學(xué)顯微鏡下選取血管密度最高的3個(gè)區(qū)域， 繼而在200 倍光學(xué)顯微鏡下選擇5 個(gè)不重疊區(qū)域， 計(jì)算微血管數(shù)量， 取其平均值。

2.6 RT?PCR 技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)面組織中VEGF mRNA 表達(dá)水平

取出液氮中凍存的創(chuàng)面組織， 采用Trizol 法將組織充分研磨、 裂解、 離心后提取總RNA， 全自動(dòng)核酸分析儀測(cè)定樣品在260 nm 和280 nm 的光密度 （optical density， OD） 值 以 及 RNA 濃 度，OD260／280 為1.8 ～2.1 視為提取成功； 在10 μl 反轉(zhuǎn)錄體系中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件為95 ℃5 min， 95 ℃15 s， 60 ℃20 s， 72 ℃40 s， 共40 個(gè) 循 環(huán)； 以 甘 油 醛?3?磷 酸 脫 氫 酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase， GAPDH）作為內(nèi)參基因， 測(cè)得Ct 值， 使用2－△△Ct法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。 引物序列： VEGF 上游5’ ?AACCTCACCAAAGCCAGCACAT?3 ’， 下 游 5 ’ ?CCGCTCTGAACAAGGCTCACA?3’； GAPDH 上 游5’ ?AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA?3’， 下游5’ ?CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG?3’。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示， 多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)， 均以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率對(duì)比

干預(yù)第3、 7、 10、 14 天， 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯低于MEBO 組與VSD 組（P均＜0.05）； 干預(yù)第14 天， MEBO 組大鼠創(chuàng)面愈合率明顯高于VSD 組（P＜0.05）， 其余各時(shí)間點(diǎn)MEBO 組與VSD 組間無明顯差異（P均＞0.05）， 詳見表1、 圖1。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合情況對(duì)比圖Fig.1 Comparison of the healing condition of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points

表1 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率對(duì)比（%， ±s）Table 1 Comparison of healing rates of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points （%， ±s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率對(duì)比（%， ±s）Table 1 Comparison of healing rates of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points （%， ±s）

注： MEBO 為濕潤燒傷膏， VSD 為負(fù)壓封閉引流； 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面采用凡士林油紗換藥處理， MEBO 組大鼠創(chuàng)面采用MEBO換藥處理， VSD 組大鼠創(chuàng)面采用VSD 處理。 與模型對(duì)照組對(duì)比，aP ＜0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與MEBO 組對(duì)比， bP ＜0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage； The wounds in control group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Sta?tistically significant differences were observed as compared with control group （aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

組別Group只數(shù)Number of rats第3 天Day 3第7 天Day 7第10 天Day 10第14 天Day 14模型對(duì)照組Control group 6 11.6 ±2.5 33.8 ±2.3 56.4 ±1.9 79.9 ±1.5 MEBO 組MEBO group 6 17.5 ±1.8a 51.2 ±1.1a 73.0 ±1.9a 92.8 ±1.4a VSD 組VSD group 6 15.8 ±1.8a 49.0 ±1.5a 70.4 ±1.8a 89.7 ±1.9ab F 值F value 13.042 184.677 137.185 104.371 P 值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.2 3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中MVD 對(duì)比

干預(yù)第7、 14 天， 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面組織中MVD 均明顯低于MEBO 組與VSD 組 （P均＜0.05）， 且VSD 組大鼠創(chuàng)面組織中MVD 又明顯低于MEBO 組（P均＜0.05）， 詳見表2。 干預(yù)第7天， 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面組織中可見極少量散在分布的棕黃色顆粒， 而MEBO 組和VSD 組大鼠創(chuàng)面組織中均可見較多密集分布的棕黃色顆粒； 干預(yù)第14 天， 模型對(duì)照組、 MEBO 組、 VSD 組大鼠創(chuàng)面組織中均可見大量密集分布的棕黃色顆粒， 且MEBO組和VSD 組棕黃色顆粒量明顯多于模型對(duì)照組， 詳見圖2。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織CD34 免疫組化染色圖（ ×400）Fig.2 Immunohistochemical staining of CD34 in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ×400）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中MVD 對(duì)比（條／mm2， ±s）Table 2 Comparison of MVD in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （microvessel／mm2， ±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中MVD 對(duì)比（條／mm2， ±s）Table 2 Comparison of MVD in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （microvessel／mm2， ±s）

注： MEBO 為濕潤燒傷膏， VSD 為負(fù)壓封閉引流， MVD 為微血管密度； 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面采用凡士林油紗換藥處理， MEBO組大鼠創(chuàng)面采用MEBO 換藥處理， VSD 組大鼠創(chuàng)面采用VSD 處理。與模型對(duì)照組對(duì)比， aP ＜0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與MEBO 組對(duì)比， bP ＜0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage， MVD－microvascular density； The wounds in control group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Statistically significant differences were observed as compared with control group （ aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

組別Group只數(shù)Number of rats第7 天Day 7第14 天Day 14模型對(duì)照組Control group 6 33.81 ±1.49 45.65 ±5.98 MEBO 組MEBO group 6 59.58 ±2.64a 76.33 ±4.70a VSD 組VSD group 6 49.22 ±5.42ab 64.19 ±3.08ab F 值F value 78.480 63.815 P 值P value ＜0.001 ＜0.001

3.3 3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中VEGF mRNA表達(dá)水平對(duì)比

干預(yù)第7、 14 天， 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF mRNA 表達(dá)水平均明顯低于MEBO 組與VSD組（P均＜0.05）， VSD 組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF mRNA 表達(dá)水平又明顯低于MEBO 組 （P均＜0.05）， 詳見表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中VEGF mRNA 表達(dá)水平對(duì)比（ ±s）Table 3 Comparison of expression levels of VEGF mRNA in wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ±s）

表3 不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中VEGF mRNA 表達(dá)水平對(duì)比（ ±s）Table 3 Comparison of expression levels of VEGF mRNA in wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ±s）

注： MEBO 為濕潤燒傷膏， VSD 為負(fù)壓封閉引流， VEGF 為血管內(nèi)皮生長因子； 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面采用凡士林油紗換藥處理，MEBO 組大鼠創(chuàng)面采用MEBO 換藥處理， VSD 組大鼠創(chuàng)面采用VSD處理。 與模型對(duì)照組對(duì)比， aP ＜0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 與MEBO 組對(duì)比， bP ＜0.05， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage， VEGF－vascular endothelial growth factor； The wounds in con?trol group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Statistically significant differences were observed as compared with control group （ aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

組別Group只數(shù)Number of rats第7 天Day 7第14 天Day 14模型對(duì)照組Control group 6 1.10 ±0.08 1.06 ±0.20 MEBO 組MEBO group 6 2.13 ±0.29a 3.30 ±0.57a VSD 組VSD group 6 1.49 ±0.23ab 2.04 ±0.29ab F 值F value 33.946 50.550 P 值P value ＜0.001 ＜0.001

4 討論

血管新生是創(chuàng)面愈合過程中的重要環(huán)節(jié)， 貫穿創(chuàng)面愈合全程［12］， 繼發(fā)性外周血管破壞和血管再生困難是導(dǎo)致糖尿病潰瘍創(chuàng)面難以愈合的關(guān)鍵［13－14］。 相關(guān)研究顯示， VEGF 可通過促使血管內(nèi)皮通透性增加、 細(xì)胞外基質(zhì)成分改變誘導(dǎo)新生血管的形成［15］。 MEBT／MEBO 的核心藥物MEBO 通過有效液化排除創(chuàng)面壞死組織、 激活創(chuàng)面潛能再生細(xì)胞、 促進(jìn)肉芽組織中新生血管形成等作用在糖尿病潰瘍等創(chuàng)面愈合中取得了較好的臨床療效［16－18］。本研究筆者為進(jìn)一步探究MEBO 在糖尿病潰瘍創(chuàng)面新生血管形成方面的作用機(jī)制， 觀察了MEBO 對(duì)大鼠糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合率及創(chuàng)面組織中MVD 與VEGF mRNA 表達(dá)水平的影響。

VEGF 是一種高度特異性的血管內(nèi)皮生長因子，通過自分泌、 旁分泌、 胞內(nèi)分泌等方式作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞受體， 促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、 細(xì)胞外基質(zhì)降解、 血管管型結(jié)構(gòu)形成； 還可通過提高血漿酶原活化因子的活性， 促使細(xì)胞外蛋白水解， 進(jìn)而促進(jìn)新生毛細(xì)血管形成［19－20］。 CD34 是高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白， 參與造血干細(xì)胞的運(yùn)輸、 定植，其免疫組化檢測(cè)可作為血管生成的標(biāo)志。 呂國忠等［21］的研究發(fā)現(xiàn)， VSD 可通過調(diào)控表皮生長因子受體、 VEGF 等因子的表達(dá)， 加速血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、 分化以及創(chuàng)面血管網(wǎng)重建， 促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合。 劉明等［18］的研究顯示， MEBT／MEBO 可通過提高糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中VEGF 的表達(dá)， 促進(jìn)創(chuàng)面血管新生及成熟， 提高糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合能力。 本研究結(jié)果顯示， 干預(yù)第3、 7、 10、 14天， 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面愈合率均明顯低于MEBO組與VSD 組， 且干預(yù)第14 天VSD 組大鼠創(chuàng)面愈合率又明顯低于MEBO 組； 干預(yù)第7、 14 天， 模型對(duì)照組大鼠創(chuàng)面組織中MVD 及VEGF mRNA 表達(dá)水平均明顯低于MEBO 組與VSD 組， 且VSD 組又明顯低于MEBO 組； 干預(yù)第14 天， 模型對(duì)照組、MEBO 組、 VSD 組大鼠創(chuàng)面組織中均可見大量密集分布的棕黃色顆粒， 且MEBO 組與VSD 組棕黃色顆粒量明顯多于模型對(duì)照組。 可見， MEBT／MEBO和VSD 均能明顯增加糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中VEGF mRNA 的表達(dá)水平， 促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面組織中微血管的生成， 進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合， 且MEBT／MEBO的效果更加明顯。 其原因可能與MEBT／MEBO 在糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合后期的促血管生成能力較VSD更強(qiáng)［22－23］有關(guān)。

綜上所述， MEBT／MEBO 可通過提高VEGF mRNA 的表達(dá)水平促進(jìn)血管生成， 進(jìn)而促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合， 效果明顯優(yōu)于凡士林油紗與VSD。但本研究樣本量較小， 結(jié)果可能存在偏倚， 且研究時(shí)間較短， 糖尿病潰瘍創(chuàng)面未能全部愈合， 還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。