大白豬繁殖性狀全基因組關聯分析

張 宇，周佳偉，吳俊靜，喬 木，徐 忠，李梓芃，彭先文，梅書棋

（動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064）

生豬養(yǎng)殖業(yè)是我國農業(yè)生產發(fā)展的重要支柱產業(yè)，國家統計局數據顯示2021 年度我國生豬存欄44 922 萬頭，出欄生豬67 128 萬頭，豬肉產量5 296 萬t，生豬飼養(yǎng)量和豬肉產量均居世界第一，占世界總量的50%以上。在生豬養(yǎng)殖和生產中，母豬繁殖能力的高低直接影響豬場的生產和經濟效益。然而由于繁殖力屬于低遺傳力性狀，其遺傳力在0.06～0.30 之間，因此常規(guī)的育種工作很難有效提高繁殖性狀的遺傳進展。

隨著分子生物學的發(fā)展，一批與繁殖性狀相關的重要功能基因，包括雌激素受體基因（ESR），卵泡生成素基因（FSHB）等在育種工作中廣泛應用，有效提高了繁殖性狀的遺傳進展。因此，進一步挖掘繁殖性能相關的分子標記和候選基因，并利用標記輔助選擇和基因組選擇技術，能夠有效提升繁殖性狀等低遺傳力性狀的選育進展。

基于高通量測序或者SNP 芯片的全基因組關聯分析（Genome-wide Association Study，GWAS）已經成為畜禽重要經濟性狀候選基因挖掘的主要方法。例如，在清平豬的研究中，針對乳頭數性狀進行GWAS 分析，挖掘到包括14 號染色體QTL 區(qū)域在內的一系列候選基因和分子標記。對于大白豬的研究中針對產仔數性狀進行GWAS 分析，分別鑒定出1 號染色體、7 號染色體和18 號染色體上多個QTL 區(qū)域并確定和為繁殖性能的候選基因。

本研究收集1 100 頭大白豬繁殖群體，記錄總產仔數（Total Number Born，TNB）、產活仔數（Number Born Alive，NBA）和健仔數（Number Healthy Piglet，NHP）進行GWAS 分析，鑒定與繁殖性狀相關的SNPs及候選基因，為后續(xù)通過分子育種手段進一步加快繁殖性能的選育提供分子標記并奠定遺傳基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和樣品采集 本研究中1 100 頭純種大白豬群體來自于貴州某商品豬育種場，采集群體耳尾組織，并記錄繁殖性狀和相關信息，包括TNB、NBA、NHP、與配公豬、分娩日期等。

1.2 “中芯一號”芯片基因分型 利用動物組織DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號DP304）提取群體樣品耳尾組織的基因組DNA，將質檢合格的DNA 樣品利用“中芯一號”芯片進行基因分型。利用PLINK v1.9 軟件對基因型數據進行質量控制，剔除檢出率<90%、最小等位基因頻率（MAF）<0.05 以及哈代-溫伯格平衡<1×10的SNPs，剔除基因型缺失率>10%的個體。

1.3 群體結構分析 為了確定樣本群體是否存在分層現象，本研究利用PLINK v1.9 軟件對有效SNPs 進行主成分分析（PCA），獲得基因組數據特征值和特征向量，并利用MEGA X 軟件進行鄰接樹分析，繪制個體間的遺傳距離圖譜。

1.4 統計分析 本研究采用rMVP 軟件進行關聯分析。rMVP 是一個用于GWAS 分析的經典軟件，利用軟件中的混合線性模型（MLM）方法，將與配公豬效應作為固定效應加入關聯分析模型中，本實驗采用的關聯分析模型如下：

其中，為對應的繁殖性狀表型值包括總TNB、NBA和NHP；表示效應矩陣；表示固定效應向量，包括前3 個主成分和與配公豬效應；表示SNPs 標記分型向量；表示SNPs 標記效應向量；是隨機效應，為的相關矩陣；表示殘差；其中服從正態(tài)分布N（0，K），表示SNPs 標記解釋的加性遺傳方差；K 表示親緣關系矩陣。本研究采用 Bonferroni 多重檢驗方法確定關聯顯性閾值，基因組水平顯著閾值為0.05/有效 SNPs 位點數量，染色體水平顯著閾值為1/ 有效SNP s 位點數量。

1.5 候選基因注釋 利用ENSEMBL（http://ftp.ensembl.org/pub/release-89/）數據庫，對GWAS 分析中顯著的SNPs 位點，在其上下游200 kb 區(qū)域進行注釋，并結合文獻挖掘繁殖性狀相關候選基因。

2 結果

2.1 表型數據分析 對1 100 頭大白豬的頭胎產仔數進行統計，TNB 平均為13.13 頭，NBA 數平均為12.84 頭，NHP 平均為12.10 頭。考慮到與配公豬可能對繁殖性能產生影響，通過廣義線性模型對TNB、NBA 和NHP分別進行分析，結果表明不同的與配公豬對產仔數性狀具有顯著影響（表1），因此在GWAS 分析過程中需要將與配公豬作為固定效應，以提高關聯分析的準確性。

表1 與配公豬對大白豬繁殖性狀的影響

2.2 群體結構分析 利用PLINK 將“中芯一號”芯片檢測數據進行過濾，共得到1 100 個有效個體及41 241個有效SNPs 位點，用于后續(xù)分析。通過主成分分析，繪制基于前2 個特征向量的主成分結構圖（圖1），結果表明群體結構穩(wěn)定，僅有少數個體表現出群體分層，因此須在關聯分析模型中加入相應主成分進行矯正，以減少關聯分析的假陽性。根據SNPs 位點計算遺傳距離，利用MEGA X 繪制群體鄰接樹（圖2），結果表明群體分支與系譜關系高度一致，可用于后續(xù)的關聯分析。

圖1 群體主成分分析圖

圖2 群體結構NJ-Tree 圖

2.3 GWAS 分析 采用rMVP 軟件分別對TNB、NBA和NHP 進行GWAS 分析，檢測影響繁殖性能的顯著SNPs 位點，基因組水平顯著的閾值為1.21×10，染色體顯著水平為2.42×10，見圖3。結果表明，對于TNB 性狀，共有3 個顯著的標記，分別位于3 號染色體10 004 418 bp、13 號染色體88 261 322 bp 和13 號染色體8 889 672 bp。對于NBA，顯著的標記共有4 個，分別位于13 號染色體和X 染色體上，其中13 號染色體上有2 個位點與TNB 位點相同，另一位點位于84 631 745 bp處，X 染色體上的顯著位點位于7 643 578 bp 處。NHP相關的SNPs 共有18 個，其中1 號染色體上1 個，位于16 919 223 bp 處，其余均位于13 號染色體上，集中在84.5～85.6 Mb 之間。QQ 圖也表明模型擬合程度較好，3 個產仔數相關性狀均有顯著SNPs 位點呈現顯著關聯。

圖3 繁殖性狀GWAS 分析曼哈頓圖和QQ 圖

進一步對上述顯著位點上下游200 kb 的區(qū)域內挖掘繁殖性狀相關候選基因，結果如表2 所示?？梢?，1 號染色體上與NHP 有關的位點附近包含基因；3 號染色體上與TNB 有關的位點附近包含基因；13 號染色體上與繁殖性狀相關的區(qū)域包含等17 個候選基因。以上基因中等基因均被報道與繁殖性狀相關。

表2 繁殖性狀全基因組關聯分析顯著位點信息

3 討 論

繁殖性能是養(yǎng)豬業(yè)重要的經濟性狀，為了提升母豬繁殖性能，挖掘繁殖性狀相關候選基因和分子標記，本研究收集1 100 頭純種大白豬的繁殖記錄，利用“中芯一號”芯片進行基因分型，并分別對總TNB、NBA 和NHP 性狀進行全基因組關聯分析。

通過對繁殖性狀和相關數據的統計分析，1 100 窩母豬的與配公豬共計19 頭，廣義線性模型和鄧肯多重比較的結果表明，不同與配公豬的繁殖性狀存在顯著差異，以TNB 性狀為例，與配公豬Y206402 相關的窩中，TNB 均值僅為10.45 頭，低于群體均值13.13 頭，因此GWAS 分析模型中考慮將與配公豬作為固定效應。通過對群體進行PCA 分析，結果表明少數個體存在分層，結合系譜信息和鄰接樹信息發(fā)現分層個體與血統相關，因此為了提高GWAS 分析的準確性，考慮將前3 個主成分作為固定效應加入關聯分析模型中。

通過關聯分析，鑒別到包括在內的6個繁殖性狀相關候選基因，其中編碼雌激素受體基因1，是豬產仔數的主效基因之一，大量研究表明基因與不同品種豬的繁殖性狀相關?；蚴蔷幋a豬透明帶的一種重要的硫酸化糖蛋白，在精卵識別和結合的過程中發(fā)揮重要的作用，在豬中的相關研究表明ZP3 與透明帶粘粘蛋白的結合具有重要的生物學意義，關聯分析結果也表明，該基因與繁殖性狀相關?；蛉Q酪氨酸3 單加氧酶/色氨酸5 單加氧酶激活蛋白、肽，與癲癇等疾病相關，有報道指出，在該基因在豬卵巢從卵泡期到黃體期的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，因此可能是母豬卵巢發(fā)育相關的重要分子標記。編碼熱休克27 kDa 蛋白1，主要參與細胞凋亡等多種免疫過程，研究表明初生時體重較輕的仔豬該基因表達量低于同窩較重的仔豬，因此基因可能與初生重性狀相關，可作為繁殖性狀的候選基因之一?；蚓幋a蘋果酸脫氫酶2，在大量動物的研究中表明在可育精子中均呈現出較高的表達水平，可能是生育能力的重要生物標記?；蚓幋a丙酰輔酶A 羧化酶的肽，大量報道與丙酸血癥有關，在牛的繁殖性狀相關研究中發(fā)現該基因與牛的妊娠率和生育率都有顯著的關聯，因此基因也可能作為繁殖性狀的分子標記。

此外，基因編碼視黃醇結合蛋白1，是維生素A 代謝和維甲酸轉運的細胞內調節(jié)因子，在針對非洲爪蟾的研究中發(fā)現該基因對神經組織的發(fā)育至關重要，本研究發(fā)現該基因與NHP 性狀有關?；蚓幋a基質抗原1，參與細胞周期、細胞分裂等多種生物學過程，研究表明與該基因同一家族的基因與人類的原發(fā)性卵巢功能不全有關，本研究結果表明基因可能與NBA 和NHP 有關，因此可能作為潛在的繁殖性狀相關候選基因。

4 結 論

本研究通過“中芯一號”芯片檢測1 100 頭經產大白豬，并對繁殖性狀進行全基因組關聯分析，共檢測到22 個顯著的SNPs，根據上下游的基因和注釋篩選了包括和等重要基因可作為大白豬繁殖性狀相關候選基因，為后續(xù)通過基因組育種技術提高大白豬繁殖性能提供了遺傳基礎。