豬50K 液相芯片基因組選擇效果分析

邱 奧，張梓鵬，王 雪，羅文學(xué)，王貴江，丁向東*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.河北省畜牧良種工作總站，河北石家莊 050049）

基因組選擇（Genomic Selection，GS）是動(dòng)物育 種中繼BLUP 方法后，又一具有里程碑意義的育種新技術(shù)、新方法?；蚪M選擇已成為豬育種技術(shù)的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外各大育種公司都在應(yīng)用基因組選擇進(jìn)行種豬選育。相較于基于系譜和表型信息的BLUP 方法，基因組選擇可以在豬生長(zhǎng)早期進(jìn)行育種值估計(jì)，準(zhǔn)確性與基于性能測(cè)定的常規(guī)育種相當(dāng)，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的系譜指數(shù)準(zhǔn)確性，對(duì)常規(guī)育種效率低和難以度量的性狀，如繁殖性狀、飼料報(bào)酬、肉質(zhì)、抗病力等意義重大。隨著2017年國(guó)家豬基因組選擇計(jì)劃的實(shí)施，我國(guó)逐漸建立起國(guó)家基因組選擇參考群體和基因組選擇平臺(tái)，在部分豬場(chǎng)實(shí)施基因組育種并取得良好效果。張金鑫、周子文等對(duì)北京地區(qū)的種豬場(chǎng)進(jìn)行基因組聯(lián)合育種結(jié)果表明，利用高密度的SNP 可以更有效地建立場(chǎng)間遺傳聯(lián)系，擴(kuò)大了育種群體，提高了選擇準(zhǔn)確性。Song 等研究了基于多性狀模型和考慮基因與環(huán)境互作的基因組選擇方法，能夠有效提升基因組預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性?；蚪M選擇已成為提升我國(guó)生豬育種水平的助推器。

高通量SNP 標(biāo)記基因型分型是基因組選擇的前提。在豬上，已開(kāi)發(fā)了多款SNP 芯片，其中50 000 個(gè)標(biāo)記左右的芯片（50K）是豬基因組選擇的主流。Geneseek公司和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)等先后開(kāi)發(fā)了Porcine SNP 50K Beadchip（Geneseek）和KPS Porcine Breeding Chip v2（中芯一號(hào)）2 款芯片，約50 000 個(gè)SNP 標(biāo)記覆蓋豬整個(gè)基因組。這2 款芯片基于Illumina 技術(shù)平臺(tái)，被稱為固相芯片。近年，基于靶向捕獲測(cè)序技術(shù)（Genotype by Target Sequencing，GBTS）的液相芯片逐漸成為生物芯片的革命性技術(shù)。GBTS 是繼凝膠電泳、熒光檢測(cè)、固相芯片之后的新一代檢測(cè)技術(shù)，其不僅對(duì)測(cè)序平臺(tái)有很好的普適性，還具有標(biāo)記增減靈活、檢測(cè)高效、信息可加、支撐便捷和應(yīng)用廣譜等優(yōu)勢(shì)，已在玉米和小麥等動(dòng)植物應(yīng)用中取得了良好成效。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)基于GBTS 技術(shù)開(kāi)發(fā)了國(guó)內(nèi)首款豬GenoBaits Porcine SNP50K（液相50K，專利申請(qǐng)?zhí)枺篊N202110359470.7）芯片，包含55 000 個(gè)SNP 標(biāo)記，覆蓋豬整個(gè)基因組，具有液相芯片樣本檢測(cè)靈活、成本較低和支持國(guó)產(chǎn)測(cè)序平臺(tái)等多方面優(yōu)勢(shì)，并在基因型填充方面，展示了與Geneseek 和中芯一號(hào)良好的兼容性。

目前，液相芯片在豬基因組選擇的應(yīng)用方面尚無(wú)報(bào)道。本研究將對(duì)豬50K 液相芯片基因組選擇效果進(jìn)行分析，探究液相芯片技術(shù)應(yīng)用于基因組選擇的可行性，以期為我國(guó)豬分子育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與表型數(shù)據(jù)處理 本研究所用豬只為來(lái)自河北張家口大好河山新農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司（以下簡(jiǎn)稱“大好河山”）的大白群體，表型收集2019—2021 年間的2 個(gè)生長(zhǎng)性狀：達(dá)百公斤體重日齡（AGE）和百公斤活體背膘厚（BF）及2016—2021 年間的繁殖性狀總產(chǎn)仔數(shù)（TNB）。生長(zhǎng)性狀與繁殖性狀統(tǒng)計(jì)、系譜記錄數(shù)及基因組遺傳力估計(jì)見(jiàn)表1。

表1 生長(zhǎng)性狀和繁殖性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

1.2 基因型檢測(cè)和質(zhì)量控制 本研究對(duì)1 199 頭具有生長(zhǎng)表型數(shù)據(jù)和800 頭具有繁殖表型數(shù)據(jù)的個(gè)體進(jìn)行基因型檢測(cè)。對(duì)于生長(zhǎng)性狀，653 頭由液相50K 測(cè)定，546頭由Geneseek 測(cè)定，無(wú)共同個(gè)體；對(duì)于繁殖性狀，750頭由液相50K 測(cè)定，581 頭由Geneseek 測(cè)定，2 款芯片共同個(gè)體為531 頭。依照以下4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制：①去除性染色體和位置未知的位點(diǎn)；②去除檢出率（Call Rate）低于90% 的SNP；③去除最小等位基因頻率（MAF）低于0.05 的SNP；④去除檢出率低于90%的個(gè)體。

質(zhì)控后，本研究將2 款芯片的基因型填充至同一款芯片，參考邱奧等的文章，采用直接填充和合并填充的策略，直接填充將液相50K 填充至Geneseek 或?qū)eneseek 填充至液相50K，合并填充則是將2 款芯片生成一個(gè)新的SNP 集合。選取同時(shí)具有液相50K 與Geneseek 最年輕的100 頭作為填充群體，分別使用液相50K 和Geneseek 個(gè)體作為參考群體，對(duì)100 頭填充個(gè)體進(jìn)行填充。本文的基因型填充參考群體分別為來(lái)自不同場(chǎng)的9 939 頭Geneseek 個(gè)體和5 373 頭液相50K個(gè)體。填充準(zhǔn)確性采用相關(guān)系數(shù)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，即對(duì)3種基因型A1A1、A1A2、A2A2 分別編碼為0、1、2，然后計(jì)算填充的基因型和原始基因型之間的相關(guān)系數(shù)。

1.3 育種值估計(jì) 采用單性狀重復(fù)力模型估計(jì)總產(chǎn)仔數(shù)育種值，模型如下：

本研究采用雙性狀動(dòng)物模型估計(jì)達(dá)百公斤體重日齡和百公斤活體背膘厚育種值，模型如下：

式中，：達(dá)百公斤體重日齡或百公斤活體背膘厚觀測(cè)值；：群體均值；：場(chǎng)年季性別固定效應(yīng)；：個(gè)體隨機(jī)遺傳效應(yīng)；：窩隨機(jī)效應(yīng)；：隨機(jī)剩余殘差；為相應(yīng)的結(jié)構(gòu)矩陣：

1.4 基因組育種值估計(jì) 本研究采用一步法（Single-Step GBLUP，SSGBLUP）分別估計(jì)總產(chǎn)仔數(shù)、達(dá)百公斤體重日齡和百公斤活體背膘厚基因組育種值（GEBV）。一步法可以同時(shí)利用系譜、基因組和表型信息，能夠把有表型測(cè)定而無(wú)基因型信息的個(gè)體也估計(jì)出GEBV，從而提升準(zhǔn)確性?？偖a(chǎn)仔數(shù)GEBV 估計(jì)同傳統(tǒng)育種值估計(jì)，采用單性狀重復(fù)力模型，生長(zhǎng)性狀達(dá)百公斤體重日齡和百公斤活體背膘厚分別采用單性狀動(dòng)物模型。模型中效應(yīng)和結(jié)構(gòu)矩陣同育種值估計(jì)，唯一不同的是，育種值估計(jì)模型中的個(gè)體隨機(jī)遺傳效應(yīng)，由基于系譜構(gòu)建的A 矩陣，變?yōu)樵诨蚪M育種值模型中綜合系譜和基因組信息的H 矩陣，公式如下：

其中，H 矩陣由A 陣和G 陣2 部分構(gòu)成，A：系譜構(gòu)建的親緣關(guān)系矩陣；G：基因組信息構(gòu)建的親緣關(guān)系矩陣，具體構(gòu)建參照Vanraden 等的文章。

為保證A 陣和G 陣尺度相同，將G 陣進(jìn)行校正，Gw=（1-w）G+wA11，參照Song 等的文章，w 設(shè)定為0.05。

1.5 基因組選擇準(zhǔn)確性評(píng)價(jià) 對(duì)于繁殖性狀，同時(shí)有Geneseek 和液相50K 基因型的最年輕的100 頭個(gè)體作為驗(yàn)證群體；對(duì)于生長(zhǎng)性狀，選取199 頭年輕個(gè)體作為驗(yàn)證群體。本研究探究不同參考群體規(guī)模對(duì)基因組選擇的影響，生長(zhǎng)性狀設(shè)置500 和1000 頭2 個(gè)參考群體規(guī)模，繁殖性狀設(shè)置400 和700 頭2 個(gè)參考群體規(guī)模。需要說(shuō)明的是，當(dāng)生長(zhǎng)性狀和繁殖性狀參考群體分別為500 頭和400 頭時(shí)，由于單款芯片基因型個(gè)體足夠，沒(méi)有將填充基因型個(gè)體納入。基因組選擇準(zhǔn)確性為驗(yàn)證群體GEBV 和EBV 之間相關(guān)系數(shù)r（EBV,GEBV）。

本研究性狀遺傳參數(shù)估計(jì)使用DMU，育種值估計(jì)和基因組育種值估計(jì)使用自編程序fastBLUP 完成。

2 結(jié)果

2.1 芯片質(zhì)控及基因型填充準(zhǔn)確性 表2 展示了液相50K 和Geneseek 質(zhì)控與填充前后芯片的基本數(shù)據(jù)。質(zhì)控后，液相50K 和Geneseek 2 款芯片的位點(diǎn)數(shù)分別為42 302 和41 296，并集芯片位點(diǎn)數(shù)為62 039。在直接填充中，液相50K 和Geneseek 作為參考群時(shí)填充準(zhǔn)確性更高，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.97，而在合并填充策略中，Geneseek+液相50K 并集作為參考群體的相關(guān)系數(shù)為0.93，合并填充準(zhǔn)確性略低于直接填充。

表2 基因型質(zhì)量控制前后芯片基本統(tǒng)計(jì)

2.2 基因組選擇準(zhǔn)確性 表3 和表4 展示了直接利用2款芯片和合并芯片對(duì)生長(zhǎng)性狀和繁殖性狀的基因組選擇準(zhǔn)確性。表3 結(jié)果表明，對(duì)于生長(zhǎng)性狀，液相50K 對(duì)于AGE、BF 2 個(gè)性狀的基因組選擇準(zhǔn)確性更高，參考群體大小為500 和1 000 時(shí)，液相50K 的AGE 和BF基因組選擇準(zhǔn)確性達(dá)到了0.525、0.605 和0.598、0.694，高于Geneseek 的0.514、0.589 和0.589、0.689，液相50K 在2 個(gè)生長(zhǎng)性狀的基因組選擇準(zhǔn)確性比Geneseek平均高出1.7%。同樣，表4 也表明液相50K 對(duì)總產(chǎn)仔數(shù)（TNB）的基因組選擇準(zhǔn)確性略高于Geneseek，但提升幅度較小。表3 和表4 同時(shí)表明，2 款芯片的并集由于增加了SNP 標(biāo)記數(shù)，基因組選擇準(zhǔn)確性比2 款芯片單獨(dú)使用更高，當(dāng)參考群體規(guī)模為500 頭和1 000 頭時(shí)，AGE 和BF 2 個(gè)生長(zhǎng)性狀的基因組選擇準(zhǔn)確性提升至0.533、0.616 和0.608、0.713，平均提升2.9%；對(duì)于繁殖性狀，當(dāng)參考群體規(guī)模為400 頭和700 頭時(shí)，總產(chǎn)仔數(shù)基因組選擇準(zhǔn)確性上升至0.561 和0.602，高于液相芯片的0.544 和0.596，也高于Geneseek 的0.542 和0.595。

表3 和表4 也表明，無(wú)論是單款芯片為主，還是2款芯片的并集，隨著參考群體規(guī)模擴(kuò)大，基因組選擇準(zhǔn)確性得到了提高。當(dāng)生長(zhǎng)性狀和繁殖性狀參考群大小為500 頭和400 頭時(shí)，主要用芯片的原始基因型，經(jīng)過(guò)基因型填充后，參考群體分別擴(kuò)大為1 000 頭和700 頭。對(duì)于繁殖性狀，參考群由400 頭擴(kuò)大至700 頭，液相50K 總產(chǎn)仔數(shù)的基因組選擇準(zhǔn)確性提升了9.7%。而生長(zhǎng)性狀則提升更加明顯，AGE 和BF 的提升幅度達(dá)到了13.9%和14.7%。Geneseek 芯片和2 款芯片并集亦是如此，尤其是2 款芯片的并集，當(dāng)參考群大小經(jīng)合并填充達(dá)到700 頭時(shí)，相較于參考群體大小400 頭，合并填充的TNB 性狀的基因組選擇準(zhǔn)確性提高到0.602，提升了7.3%，生長(zhǎng)性狀的合并填充基因組選擇準(zhǔn)確性也有較大幅度提升。結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)任何一種基因型填充方式擴(kuò)大參考群體，生長(zhǎng)性狀和繁殖性狀的基因組選擇準(zhǔn)確性均有較大提升，說(shuō)明通過(guò)基因型填充擴(kuò)大參考群來(lái)提高基因組選擇準(zhǔn)確性是非常可行的。

表3 生長(zhǎng)性狀基因組選擇準(zhǔn)確性

表4 繁殖性狀基因組選擇準(zhǔn)確性

3 討 論

本研究中，液相50K 和Geneseek 直接填充準(zhǔn)確性最高，達(dá)到了0.97；2 款芯片合并填充的準(zhǔn)確性低于直接填充的準(zhǔn)確性，這意味著2 款芯片的合并會(huì)影響整體的填充效果，與之前研究結(jié)果一致。這可能是由于2 款芯片合并標(biāo)記數(shù)增加，導(dǎo)致填充準(zhǔn)確性下降。液相50K 和Geneseek 2 款芯片有相同位點(diǎn)33830，因此互相填充準(zhǔn)確性很高，此外，2 款芯片衡量大白群體的連鎖不平衡程度（）分別為0.29 和0.32，很接近，表明2 款芯片兼容性很好。

通過(guò)基因型填充，不僅能夠填充缺失基因型，更能夠統(tǒng)一芯片類型，從而擴(kuò)大基因組選擇的參考群體，甚至增加標(biāo)記數(shù)量。本研究2 款芯片的基因組選擇結(jié)果表明，液相50K 的基因組選擇效果優(yōu)于Geneseek。對(duì)于使用多款芯片的群體，通過(guò)直接填充和合并填充2 種策略，均能擴(kuò)大基因組選擇參考群體，從而不同程度地提升基因組選擇準(zhǔn)確性。這與其他研究的結(jié)論一致。Geneseek+液相50K 并集的基因組選擇準(zhǔn)確性高于單款芯片，主要是因?yàn)? 款芯片的位點(diǎn)合并，使標(biāo)記由Geneseek 或液相50K 單款芯片的4 萬(wàn)多SNP 增加到并集的62039，使得在參考群體大小相同的情況下，極大增加了基因組選擇可用的信息，從而提升了基因組選擇準(zhǔn)確性，這與之前的研究相似。雖然合并填充準(zhǔn)確性（Cor=0.93）低于直接填充準(zhǔn)確性（Cor=0.97），但由于Cor>0.95 的位點(diǎn)數(shù)量較多，占總填充位點(diǎn)數(shù)的96.2%（59 934 個(gè)），仍然多于單款芯片的標(biāo)記數(shù)，使得基因組選擇有效位點(diǎn)數(shù)增加，在相同參考群體規(guī)模下，基因型填充后并集的基因組選擇準(zhǔn)確性仍然最高。也有研究表明，當(dāng)填充群體的基因型填充準(zhǔn)確性較低時(shí)，SNP 位點(diǎn)數(shù)的增加并未使基因組選擇準(zhǔn)確性得到提升，反而略有降低。因此，在實(shí)際操作中，需要綜合考慮基因型填充準(zhǔn)確性下降和SNP 位點(diǎn)數(shù)增加2 個(gè)因素的拮抗。

豬Geneseek 50K 芯片是目前在豬性狀遺傳解析和基因組選擇中使用最為廣泛的芯片，本研究表明，液相50K 與Geneseek 具有很好的兼容性，液相50K 能應(yīng)用于基因組選擇，且有優(yōu)勢(shì)。液相50K 主要依托靶向捕獲測(cè)序技術(shù)，GBTS 作為高通量低成本的液相芯片檢測(cè)技術(shù)，同一套標(biāo)記可以通過(guò)控制測(cè)序深度來(lái)滿足不同群體基因組選擇對(duì)標(biāo)記數(shù)量的需求。本研究使用的豬液相50K 芯片，可拆分為10K 和40K 2 款獨(dú)立的芯片，更靈活應(yīng)用于豬基因組選擇。針對(duì)我國(guó)豬基因組選擇實(shí)施存在的問(wèn)題，丁向東等提出了“先低后高，先多后少”的液相芯片基因組選擇策略，早期利用10K 低密度芯片對(duì)小豬進(jìn)行大量基因型檢測(cè)，提高早期選擇的準(zhǔn)確性和選擇強(qiáng)度；后期對(duì)進(jìn)入性能測(cè)定的個(gè)體使用40K 芯片進(jìn)行測(cè)定，評(píng)估出最優(yōu)秀個(gè)體進(jìn)入核心群，大大降低了豬基因組選擇實(shí)施成本，并且提高了基因組育種效益，這使液相芯片更容易在我國(guó)豬基因組選擇中得到廣泛應(yīng)用。

4 結(jié) 論

在單款芯片使用中，液相50K 比Geneseek 的基因組選擇準(zhǔn)確性更高；相比單款芯片，通過(guò)基因型填充得到的合并芯片，其位點(diǎn)數(shù)增加，相同參考規(guī)模下基因組選擇準(zhǔn)確性更高；通過(guò)基因型填充，可以擴(kuò)大參考群體規(guī)模，從而提升基因組選擇準(zhǔn)確性。這為液相50K 在豬基因組選擇領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考。

致謝：感謝河北張家口大好河山新農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司提供豬只樣品和數(shù)據(jù)。