豬單核/巨噬細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定和遺傳參數(shù)估計(jì)

李 航，馬福平，韓 余，劉華濤，張豐霞，楊金艷，朱冉冉，連正興，王楚端

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物育種國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

2018 年中國首次暴發(fā)非洲豬瘟，由于防控不嚴(yán)，導(dǎo)致生豬頻繁調(diào)運(yùn)，病毒隨之迅速擴(kuò)散，造成更多的豬感染非洲豬瘟而死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。其中，育種企業(yè)遭受的影響最大，不僅損失慘重，而且育種工作也停滯不前。疾病不但增加了養(yǎng)殖行業(yè)的生產(chǎn)成本和風(fēng)險(xiǎn)，降低遺傳進(jìn)展速度，也影響著食品安全問題。

在當(dāng)代豬育種中，主要關(guān)注繁殖性狀、生長性狀、耗料增重比等，對(duì)抗病性狀不夠重視，但疾病是造成養(yǎng)豬業(yè)效率低下的第一大要素，抗病育種應(yīng)得到足夠重視。生產(chǎn)性能與抗病力相關(guān)的研究較少，如何平衡好一般抗病力和生產(chǎn)性能間的關(guān)系，在不降低生產(chǎn)性能的前提下選育一般抗病力強(qiáng)的新品種值得關(guān)注?？共∮N的研究較為復(fù)雜，選擇合適的抗病指標(biāo)成為關(guān)鍵，有研究發(fā)現(xiàn)在家禽中單核/巨噬細(xì)胞的吞噬積與體液免疫呈正相關(guān)，可以作為體液免疫應(yīng)答的一個(gè)可靠指標(biāo)；對(duì)高吞噬積個(gè)體的選擇可以提高群體的體液免疫水平和抗病力。因此，本研究嘗試通過測(cè)定大白豬單核/巨噬細(xì)胞吞噬能力估計(jì)其遺傳參數(shù)，為豬的抗病育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及血樣 本研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是由北京市順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司鵬程食品分公司提供的具有系譜的277 頭大白豬，采血后，輕輕混勻血液和抗凝劑，4℃保存，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室分離單核/巨噬細(xì)胞。

1.2 主要試劑及耗材 胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）含酚紅、胎牛血清、RPMI 1640 培養(yǎng)基、D-PBS 緩沖液、DMSO、豬外周血淋巴細(xì)胞分離液、紅細(xì)胞裂解液、D-Hanks 緩沖液、0.5%的MTT 溶液、瑞氏-姬姆薩復(fù)合染色試劑盒、5 mL 負(fù)壓采血管、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、12 道可調(diào)式移液器、一次性加液槽、2 mL 96 孔深孔板、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、封板膜。

1.3 細(xì)胞系的培養(yǎng)和染色 將HCT-8 細(xì)胞從液氮中取出，于37℃水浴鍋中完全解凍后，轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中再加入1 mL RPMI1640 完全培養(yǎng)液吹打混勻，用低速離心機(jī)1 000 r/min 離心5 min；離心后，向25T培養(yǎng)瓶中加入4 mL RPMI1640 完全培養(yǎng)液，取出離心管棄上清再加入1 mL RPMI1640 完全培養(yǎng)液混勻細(xì)胞，移至加好培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中；放在37℃、5% CO的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后，用顯微鏡觀察并在培養(yǎng)基變黃之后換液。當(dāng)100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中HCT-8 細(xì)胞的匯合度達(dá)到90%左右，在避光環(huán)境中加入2 mL 0.5%的MTT 溶液；放在37℃，5% CO的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后，倒掉液體，向培養(yǎng)皿的邊緣緩慢加入3 mL D-PBS 緩沖液洗滌2 次；向培養(yǎng)皿中加入 2 mL D-PBS，將被MTT 溶液染色的貼壁細(xì)胞吹打下來，用15 mL 離心管收集，再用鋁箔紙包裹后放在4℃冰箱。

1.4 外周血單核/巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 將豬外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒中的稀釋液0.5 mL，加入到一個(gè)2 mL 96 孔深孔板中，再加入等體積抗凝血混勻稀釋；然后把淋巴細(xì)胞分離液1 mL，加入到另一個(gè)2 mL 96孔深孔板中，將稀釋后的血液緩慢加入到分離液之上，貼上封板膜，用平板離心機(jī)2 500 r/min 離心5 min；離心后的液體分為4 層，將上面3 層吸取到新的2 mL 96孔深孔板中，用D-Hanks 緩沖液配平，2 000 r/min 離心5min；緩慢倒掉上清，向有紅細(xì)胞的孔中加入1mL紅細(xì)胞裂解液，混勻細(xì)胞，5 min 后，加入清洗液配平，2 000 r/min 離心5min；再緩慢倒掉上清，得到的細(xì)胞沉淀每孔用600 μL RPMI1640 完全培養(yǎng)液吹打混勻后，轉(zhuǎn)移到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)個(gè)體3 個(gè)處理，3 個(gè)對(duì)照，每孔100 μL；放在37℃，5% CO的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d 后，用12 道可調(diào)式移液器吸走培養(yǎng)液，并用100 μL D-PBS 緩沖液洗滌1 次；每孔加入150 μL RPMI1640 完全培養(yǎng)液，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d；2 d 后，吸走培養(yǎng)液，用100 μL D-PBS 緩沖液洗滌1 次，加入100 μL RPMI1640 完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；12 h 后得到所需要的單核/巨噬細(xì)胞。

1.5 瑞氏-姬姆薩染色單核/ 巨噬細(xì)胞 將需要染色的孔中培養(yǎng)液棄掉，用100 μL D-PBS 緩沖液洗滌一次，加入2～3 滴WG 染色液，等待3～5 min；滴加等量的WG 緩沖液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，相同時(shí)間后，吸出液體，用顯微鏡觀察并拍照。

1.6 檢測(cè)外周血單核/巨噬細(xì)胞的吞噬積 在避光條件下，將15 mL 離心管中MTT 處理的HCT-8 細(xì)胞搖勻后，吸入到一次性加液槽中，用12 道可調(diào)式移液器向每個(gè)個(gè)體3 個(gè)處理孔加入20 μL；放入培養(yǎng)箱6 h 后，在避光條件下，向每個(gè)個(gè)體3 個(gè)對(duì)照孔加入20 μL 的0.5%的MTT 溶液；再放入培養(yǎng)箱4 h 后，吸出每個(gè)孔中的液體，用100 μL D-PBS 緩沖液輕輕洗滌一次后，加入150 μL DMSO（不接觸孔壁）；用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板在570 nm 和630 nm 處的吸光值；吞噬積的計(jì)算方式為MTT（噻唑藍(lán)）染色后的人回盲腸癌細(xì)胞（HCT-8）被吞噬的數(shù)量除以總的單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量，即吞噬積=（OD 處理孔570nm-OD 處理孔630nm）/（OD 對(duì)照孔570nm-OD 對(duì)照孔630nm）。

1.7 生產(chǎn)性狀的測(cè)定 大白豬屠宰后，依據(jù)《瘦肉型豬胴體性狀測(cè)定技術(shù)規(guī)范》、《豬肌肉品質(zhì)測(cè)定技術(shù)規(guī)范》測(cè)定胴體性狀和肉質(zhì)性狀。胴體性狀包括胴體重、胸腰長、胴體長、胴體直長、胴體斜長、最后肋骨處背膘厚、肋骨數(shù)、眼肌面積；肉質(zhì)性狀包括肌內(nèi)脂肪含量、24 h滴水損失、48 h 滴水損失、pH、肉色亮度（L）、肉色紅度（a）、肉色黃度（b）。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 整理系譜和試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，應(yīng)用 SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和性狀間表型相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)大部分?jǐn)?shù)據(jù)符合正態(tài)分布，其中吞噬積結(jié)果不符合正態(tài)分布，對(duì)其通過JMP 軟件進(jìn)行正態(tài)轉(zhuǎn)換后再分析。整理好兩個(gè)輸入文件（記錄數(shù)據(jù)文件、系譜文件）和一個(gè)參數(shù)文件，使用DMU 軟件中dmuai 模塊（約束性最大似然法估計(jì)方差組分）估計(jì)吞噬積、胴體性狀和肉質(zhì)性狀的遺傳參數(shù)。所使用的模型如下：

式中，y是吞噬積、胴體性狀和肉質(zhì)性狀的測(cè)定值；是各測(cè)定值的群體均值；s是性別的固定效應(yīng)；id是動(dòng)物個(gè)體的加性遺傳效應(yīng)向量；e為隨機(jī)殘差向量。

2 結(jié)果

2.1 豬單核/ 巨噬細(xì)胞的吞噬能力 在100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿傳代培養(yǎng)4 h 后，有的細(xì)胞呈現(xiàn)圓形，有的細(xì)胞已經(jīng)貼壁生長（圖1-A），培養(yǎng)24 h HCT-8（人回盲腸癌細(xì)胞）的匯合度達(dá)到70% 左右（圖1-B），培養(yǎng)48 h HCT-8 的匯合度達(dá)到90%左右（圖1-C），用0.5%的MTT 溶液處理，HCT-8 細(xì)胞死亡并產(chǎn)生藍(lán)紫色的結(jié)晶（圖1-D）。

圖1 HCT-8 細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)

圖2-A 是分離培養(yǎng)84 h 后，在200 倍顯微鏡下觀察的豬單核/巨噬細(xì)胞；圖2-B 是用瑞氏-姬姆薩將其染色，可以看出細(xì)胞核處于細(xì)胞的一側(cè)，較大且不規(guī)則，細(xì)胞沖洗后不脫落具有貼壁的性質(zhì)；MTT 處理的HCT-8 細(xì)胞會(huì)在單核/巨噬細(xì)胞處聚集（圖2-C）；圖2-D 是用MTT 處理的單核/巨噬細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞與MTT 反應(yīng)形成藍(lán)紫色結(jié)晶。

圖2 單核/巨噬細(xì)胞的形態(tài)和處理

不同個(gè)體豬外周血單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量和吞噬能力相差較大，在倒置顯微鏡下觀察可以明顯看到差別，藍(lán)紫色的HCT-8 細(xì)胞聚集在單核/ 巨噬細(xì)胞的周圍，圖3-A 是單核/ 巨噬細(xì)胞數(shù)量和吞噬MTT-HCT-8 細(xì)胞多的個(gè)體，而圖3-B 是單核/ 巨噬細(xì)胞數(shù)量和吞噬MTTHCT-8 細(xì)胞少的個(gè)體。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)DMSO溶解MTT 染色細(xì)胞后的吸光度值可以反映出被吞噬細(xì)胞的數(shù)量。

圖3 單核/巨噬細(xì)胞吞噬MTT-HCT-8 能力

2.2 各性狀的基本統(tǒng)計(jì)量 如表1 所示，本實(shí)驗(yàn)中大白豬吞噬積的平均值為3.05，標(biāo)準(zhǔn)差為1.87，最大值為14.13，最小值為1.01，變異系數(shù)為0.61。

表1 吞噬積的基本描述性統(tǒng)計(jì)

胴體性狀的測(cè)定結(jié)果如表2 所示，平均值的范圍為14.23（肋骨數(shù)）到103.16（胴體長）；標(biāo)準(zhǔn)差的范圍為0.80（肋骨數(shù)）到8.20（胴體重）；最大值的范圍為17.00（肋骨數(shù)）到114.00（胴體長）；最小值的范圍為9.32（最后肋骨處背膘厚）到94.00（胴體長）；變異系數(shù)的范圍為0.03（胴體長）到0.23（最后肋骨處背膘厚）。

表2 胴體性狀的基本描述性統(tǒng)計(jì)

肉質(zhì)性狀的測(cè)定結(jié)果如表3 所示，平均值的范圍為1.83（24 h 滴水損失）到46.09（肉色L值）；標(biāo)準(zhǔn)差的范圍為0.25（pH）到2.02（48 h 滴水損失）；最大值的范圍為3.92（肌內(nèi)脂肪含量）到52.87（肉色L值）；最小值的范圍為0.38（24h 滴水損失）到40.77（肉色L值）；變異系數(shù)的范圍為0.04（pH）到0.65（24 h滴水損失）。

表3 肉質(zhì)性狀的基本描述性統(tǒng)計(jì)

生長性狀的測(cè)定結(jié)果如表4 所示，日增重的平均值為0.60，標(biāo)準(zhǔn)差為0.06，最大值為0.76，最小值為0.46，變異系數(shù)為0.10。

表4 肉質(zhì)性狀的基本描述性統(tǒng)計(jì)

2.3 吞噬積的遺傳參數(shù)估計(jì) 吞噬積遺傳力的估計(jì)值如表5 所示，遺傳力為0.13，加性遺傳方差為0.47，表型方差為3.55，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.12，屬于低遺傳力。

表5 吞噬積遺傳力估計(jì)值

2.4 吞噬積與不同性狀的相關(guān)性分析 大白豬吞噬積與胴體性狀間的表型相關(guān)和遺傳相關(guān)見表6，表型相關(guān)的范圍為-0.22～0.015，其中吞噬積與胴體重表型相關(guān)為-0.15（<0.05），與胸腰長表型相關(guān)為-0.22（<0.01）；遺傳相關(guān)的范圍為-0.82～0.047，絕大部分都呈負(fù)遺傳相關(guān)。

表6 吞噬積與胴體性狀間的表型相關(guān)和遺傳相關(guān)

由表7 可知，吞噬積與肉質(zhì)性狀間的表型相關(guān)的范圍為-0.08～0.038（>0.05）；遺傳相關(guān)的范圍為-0.87～0.3，大部分表型相關(guān)和遺傳相關(guān)都呈負(fù)相關(guān)。

表7 吞噬積與肉質(zhì)性狀間的表型相關(guān)和遺傳相關(guān)

如表8 所示，吞噬積與日增重的表型相關(guān)為-0.047（>0.05），遺傳相關(guān)為0.21。

表8 吞噬積與日增重間的表型相關(guān)和遺傳相關(guān)

3 討 論

在豬育種中納入與健康相關(guān)的性狀或遺傳標(biāo)記，可能有助于培育出更具抗病能力的品種。先天免疫系統(tǒng)是宿主抵御感染性病原體的第一道防線，血液學(xué)性狀和應(yīng)激參數(shù)也是家畜生理健康狀況的重要指標(biāo)。在過去的幾年里，一些研究已經(jīng)報(bào)道了豬的某些免疫和血液學(xué)性狀具有中到高的遺傳力，表明這些性狀的表型變異有重要的遺傳貢獻(xiàn)。

在不同研究中，對(duì)抗病性狀遺傳力估計(jì)值也不同，有些抗病性狀屬于低遺傳力，而有些抗病性狀具有中高遺傳力。麻慧利用單性狀動(dòng)物模型估計(jì)矮小雞外周血單核細(xì)胞吞噬積的遺傳力為0.31±0.06，加性遺傳方差為0.46，表型方差為1.50，殘差方差為1.03，指出應(yīng)用單核/ 巨噬細(xì)胞吞噬能力作為抗病育種的選育指標(biāo)從而培育抗病品系成為可能。歐陽解秀用MTDFREML 法求得大白豬和中畜黑豬中性粒細(xì)胞吞噬力的遺傳力分別為0.422 和0.385。Ballester 等估計(jì)杜洛克血液?jiǎn)魏思?xì)胞遺傳力為0.767，但與吞噬作用相關(guān)的表型屬于低到中等遺傳力，在0.118～0.495。本實(shí)驗(yàn)中估計(jì)豬外周血單核/巨噬細(xì)胞吞噬積的遺傳力為0.13，相比與其他研究較低，可能是由于采樣限制，實(shí)驗(yàn)個(gè)體較少，對(duì)吞噬積遺傳力估計(jì)誤差較大。

與生產(chǎn)性狀研究相比，生豬抗病性狀的研究較少。由于抗病力的研究較為復(fù)雜，抗病力與生產(chǎn)性狀的關(guān)系還不是十分清楚，相關(guān)報(bào)道結(jié)果也有所差異，有的研究表明抗病性能與生產(chǎn)性能呈負(fù)相關(guān)，而另一些研究表明選育抗病性能不會(huì)降低生產(chǎn)性能。如原一桐測(cè)定了不同周齡高吞噬積個(gè)體和低吞噬積個(gè)體的體重和脛長，結(jié)果顯示它們之間并沒有顯著差異，對(duì)吞噬積的選擇并未影響個(gè)體的體型和發(fā)育；但高吞噬積個(gè)體產(chǎn)蛋初期的產(chǎn)蛋率和平均蛋重比低吞噬積個(gè)體小，對(duì)于卵泡發(fā)育和排卵能力，低吞噬積個(gè)體也強(qiáng)于高吞噬積個(gè)體；在繁殖性能方面，低吞噬積個(gè)體孵化率和受精率顯著高于高吞噬積個(gè)體，表明某些抗病性能與生產(chǎn)性能呈負(fù)相關(guān)。麻慧對(duì)單核/ 巨噬細(xì)胞吞噬能力的選育，發(fā)現(xiàn)高吞噬能力個(gè)體的后代抗病力強(qiáng)，不會(huì)降低個(gè)體增重，可以提高母雞的孵化性能和后代的健雛率。有研究表明，減少疾病給動(dòng)物造成的損失后，也能提高其生產(chǎn)性能。Mallard等通過選育得到了高和低兩種免疫應(yīng)答品系的豬，發(fā)現(xiàn)高免疫應(yīng)答品系的豬增重率顯著高于低免疫應(yīng)答品系和對(duì)照組，能較早達(dá)到上市體重。劉榜等研究了161 頭豬部分免疫指標(biāo)和生產(chǎn)性狀間的關(guān)系，得到免疫指標(biāo)與肉質(zhì)性狀呈有利相關(guān)，而與生長性狀和胴體性狀呈不利相關(guān)。魏國生等測(cè)定結(jié)果顯示哈白、杜洛克豬的生產(chǎn)性狀和免疫性狀相關(guān)較小。本研究分析大白豬吞噬積與胴體性狀和肉質(zhì)性狀的表型相關(guān)，結(jié)果表明性狀間相關(guān)較小，與上述的研究結(jié)果相似。

平衡好抗病性能和生產(chǎn)性能需知道兩者間的遺傳關(guān)系。Wilkie等分析豬易感疾病和生產(chǎn)性狀的遺傳相關(guān)，結(jié)果顯示它們并沒有顯著的相關(guān)，但是患病的個(gè)體具有生長速度慢，體型偏小和眼肌面積減小的趨勢(shì)。歐陽解秀對(duì)312 頭大白豬的免疫指標(biāo)與生產(chǎn)性狀做了相關(guān)性分析，得到兩性狀遺傳相關(guān)較小，范圍在-0.22～0.239，遺傳相關(guān)與表型相關(guān)接近，說明遺傳因素對(duì)表型值貢獻(xiàn)較大，所以對(duì)免疫性能的選擇不會(huì)對(duì)生產(chǎn)性狀產(chǎn)生大的影響。與之前研究結(jié)果不同，本研究表明吞噬積與胴體性狀和肉質(zhì)性狀中某些指標(biāo)呈現(xiàn)較高的負(fù)遺傳相關(guān)，遺傳相關(guān)與表型相關(guān)相差較大，分析原因可能是由于計(jì)算模型導(dǎo)致。

4 結(jié) 論

本研究采用MTT-HCT-8 法檢測(cè)大白豬單核/巨噬細(xì)胞的吞噬積，使用DMU 軟件單性狀模型估計(jì)其遺傳力為0.13，為低遺傳力；吞噬積與胴體性狀、肉質(zhì)性狀的指標(biāo)表型相關(guān)較弱，遺傳相關(guān)較強(qiáng)，大多呈負(fù)相關(guān)，遺傳相關(guān)與表型相關(guān)相差較大。