蝦青素和平衡時間對豬精子冷凍保存效果的影響

劉浩域，郭建華，羅 蘭，韓先杰，于光輝*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109；2.膠州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266300）

自2018 年以來，非洲豬瘟在全球多個國家相繼爆發(fā)，嚴重時可致豬群大規(guī)模死亡，開展豬育種工作極其困難。在面臨像非洲豬瘟這樣的烈性傳染病突襲時，豬冷凍精液技術可以保護群體的遺傳資源，迅速重新建立種質(zhì)資源。與鮮精相比，冷凍精液可以解決場間精液交流的生物安全問題、遠程精液運輸?shù)臅r效性問題、優(yōu)質(zhì)種公豬遺傳物質(zhì)的最大限度的利用、地方豬遺傳資源的靜態(tài)保存、夏季常溫精液質(zhì)量差等一系列常溫精液不能解決的問題，冷凍精液在提高種公豬利用率的同時還可以提高群體生產(chǎn)力，并且大大降低疾病傳播的風險。但豬精子細胞膜中富含多不飽和脂肪酸，且抗氧化物質(zhì)含量相對較少，其質(zhì)膜成分也與其他動物精子存在差異，因此，豬精子對活性氧（ROS）的反應更為敏感。近年來研究表明，在豬精液冷凍過程中添加維生素E、白藜蘆醇、抗壞血酸等抗氧化物質(zhì)可在一定程度上能夠減少ROS 對豬精子的侵害，有效提高豬冷凍精液質(zhì)量。

蝦青素（Astaxanthin，AST）是一種天然的類胡蘿卜素，作為一種脂溶性的萜烯類不飽和化合物，蝦青素中的共軛烯烴結構可以減少細胞中的單線態(tài)氧造成的氧化損傷并降低自由基的生成，有效增加抗氧化酶活性并降低DNA 氧化損傷。研究表明，添加蝦青素可以有效提高公羊和公牛精子液態(tài)保存的精子活力，對于豬精液的液態(tài)保存也起著很好的調(diào)控作用。目前，有關蝦青素在豬冷凍精液的保存效果方面研究較少，本實驗擬在冷凍保存I 液中添加0.5 mmol/L 蝦青素（參考文獻推薦濃度），在冷凍過程中與豬精子平衡不同時間，探究添加蝦青素與豬精子平衡不同時間對冷凍保存效果的影響，以期為豬精液超低溫冷凍保存研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器 低溫離心機（D-37520，Thermo）、液氮罐、恒溫箱、光學顯微鏡（CX21，Olympus，日本）、熒光顯微鏡（BX63，Olympus，日本）、pH 計（FE20-K，梅特勒）、酶標儀（RZ-9618，天津瑞澤分析儀器有限公司）、Luminometer（GloMax 20/20，Promega）、熒光分光光度計（F98，上海棱光技術有限公司）、計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASAS-QH-III，西班牙）。

1.2 實驗試劑 丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、ATP 含量等檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；ROS、JC-1 等檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司；蝦青素、SYBR Green I、PI 染液、AO 染色試劑盒、臺盼藍染液等購自索萊寶公司；OEP 購自德國米尼圖、封口粉和0.5 mL 凍精細管購自法國卡蘇；基礎稀釋液的藥品購自國藥集團（分析純）。

1.3 稀釋液配制 將Modena 稀釋液做為基礎稀釋液：稱取葡萄糖2.75 g、檸檬酸三鈉0.69 g、檸檬酸0.29 g、碳酸氫鈉0.125 g、EDTA-2Na 0.235 g、Tris 0.565 g、青霉素鈉1 000 IU/mL、硫酸鏈霉素0.1 g，用滅菌超純水定容至100 mL，調(diào)整pH 為7.2，然后用0.22 μm 濾頭過濾后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。冷凍保存液（I 液）：11%的乳糖溶液80%、卵黃20%、2 mol/L 蝦青素，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。冷凍保存液（II 液）：95.5%的II 液、3%甘油、1.5% OEP，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 精液的采集與處理

1.4.1 精液采集 采用手握法采集山東省平度市環(huán)山托佩克種豬場的10 頭杜洛克種公豬的中段精液。采精前確保種公豬具備體質(zhì)強健、性欲旺盛和品質(zhì)優(yōu)良等特點。采精后初步進行精液質(zhì)量評價，保證采集的精子活率達到80%～90% 以上且精子畸形率≤20%。將符合上述條件的精液經(jīng)4～5 層無菌紗布過濾，將過濾完成的精液混合均勻，以消除個體差異，再用基礎稀釋液與混勻好的精液1:1 比例混合均勻后置于17℃恒溫箱內(nèi)，并在2 h內(nèi)用17℃恒溫箱保存運送至實驗室。

1.4.2 精液降溫平衡 精液稀釋平衡為通用步驟操作，分為3 個階段進行：第1 階段先使用恒溫箱保存的基礎稀釋液與精液1:1 比例混合均勻，再用預冷17℃的冷凍離心機800 ×g 離心10 min，棄上清液。第2 階段用冷凍保存I 液對棄上清的精子進行1:1～1:2 稀釋，隨后將離心管用紗布包裹好置于4℃冰箱平衡約2 h（空白對照組），或者在冷凍保存I 液中添加0.5 mmol/L蝦青素，置于4℃冰箱分別平衡2、4、6、8、12 h（試驗組）。第3 階段使用含甘油的冷凍保存II 液對已平衡降溫至4℃的精液進行第2 次稀釋，精子計數(shù)并調(diào)整最終濃度為5×10個/mL，做好標記后放入4℃冰箱平衡內(nèi)0.5 h，最大限度減少降溫對精子造成的損傷。

1.4.3 精液冷凍與解凍程序 精液冷凍：精液稀釋平衡通用步驟操作完成后，分別把樣品快速用口吸法灌裝進0.5 mL 細管，再用封口粉封口并做好標記。將細管平鋪在細管托架上并迅速放入泡沫箱內(nèi)進行熏蒸，熏蒸時保證每根細管之間間隔0.5 cm，細管托架距液氮面高4 cm，蓋上泡沫箱蓋子熏蒸10 min 后迅速置于液氮中。按時間做好標記后將細管分別裝進拇指管內(nèi)，然后裝入無菌紗布袋中，最后將紗布袋置于液氮罐中保存。解凍時將細管從液氮罐中取出，置于37℃水浴鍋中解凍20 s后撈出用紙巾擦干細管表面水漬，剪開細管后與解凍液1:4 混勻，于37℃水浴孵育10 min 后進行檢測。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 精子運動參數(shù) 參照Zhu 等的方法，將精子樣品解凍后600 ×g 4℃離心3 min，棄上清，PBS 重復清洗3 次，再用PBS 重懸，吸取5 μL 精液涂抹于載玻片上并將載玻片置于分析儀預熱好的37℃操作孔內(nèi)，每組各取3 份樣品使用計算機輔助精子分析系統(tǒng)（CASA）進行精子活力檢測。運動參數(shù)包括曲線速度（VCL）、直線速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）、直線性（LIN）即VSL/VCL；向前性（STR）即VSL/VAP；擺動性（WOB）即VAP/VCL。

1.5.2 質(zhì)膜完整率和頂體完整率 根據(jù)Zhu 等的方法，使用SYBR-14/PI 染色和異硫氰酸酯-花生凝集素FITC-PNA 染色對精子質(zhì)膜完整性和頂體完整性進行評估，樣品前處理同上，重懸后與染液充分混合，30 min后觀察并計數(shù)。每組各取3 份樣品在熒光顯微鏡下使用200×鏡頭計數(shù)，每組保證至少分析200 個精子。

精子質(zhì)膜完整率=質(zhì)膜完整的精子（綠色）/計數(shù)的總精子數(shù)×100%

精子頂體完整率=頂體完整的精子（綠色）/計數(shù)的總精子數(shù)×100%

1.5.3 線粒體膜電位 采用JC-1 熒光探針法檢測，JC-1作為理想熒光探針，準確反映了線粒體低電位時發(fā)散綠色熒光；線粒體高電位時發(fā)散紅色熒光。樣品前處理同上，每組各取3 份樣品在光顯微鏡下使用200×鏡頭計數(shù)，每組保證至少分析200 個精子。

精子線粒體膜電位=發(fā)紅光的精子/發(fā)綠光的精子數(shù)×100%

1.5.4 DNA 完整性檢測 采用AO 熒光染色標記法檢測，樣品前處理同上，通過AO 熒光染料與細胞結合可區(qū)別細胞的生存狀況。AO 可透過完整細胞膜，使細胞核呈現(xiàn)黃綠色或綠色熒光，壞死細胞熒光減弱甚至消失。每組各取3 份樣品在熒光顯微鏡下使用200×鏡頭計數(shù)，每組保證至少分析200 個精子。

精子DNA 完整率=DNA 完整的精子/計數(shù)的總精子數(shù)×100%

1.5.5 ROS 水平檢測 采用DCFH-Da 熒光檢測法檢測，DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內(nèi)后，可以被細胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH 不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內(nèi)。細胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH 生成有熒光的DCF。樣品前處理同上，每組各取3 份樣品用熒光分光光度計檢測。

1.5.6 ATP 含量、MDA 水平以及SOD、GSH-Px 和CAT檢測 用相應的測試劑盒進行檢測，樣品前處理同上，每組各取3 份樣品，按照試劑盒操作說明進行處理，然后使用酶標儀進行檢測。

1.6 統(tǒng)計分析 試驗采用單次試驗中設置組內(nèi)重復的方法，所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析（LSD）采用 Duncan's 法進行數(shù)據(jù)多重比較，結果均用平均值± 標準差表示，<0.05 表示差異顯著，>0.05 表示差異不顯著。

2 結果

2.1 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后運動參數(shù)的影響 如表1 所示，平衡2、4、6、8、12 h 后，與空白對照組相比，平衡4、6、8、12 h 的VCL、LIN、WOB 均顯著提高，其中以平衡6 h 的效果最為顯著，平衡8 h 次之，而平衡2 h 的對于LIN、WOB作用效果不顯著。與空白對照組相比，只有平衡6 h 的VSL、VAP 顯著提高，其余平衡不同時間較對照組變化不顯著。與空白對照組相比，平衡4、6、8 h 組STR顯著提高，其中以平衡6 h 的試驗組最為顯著，平衡4 h次之。相較于平衡不同時間而言，平衡6 h 的豬精子在解凍后各項運動參數(shù)均顯著提高，平衡4、8 h 的對于部分運動參數(shù)來說也有一定提高，而平衡2 h 的對于各項運動參數(shù)不提高反而會造成部分運動參數(shù)降低。

表1 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后運動參數(shù)的影響

2.2 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA 完整率以及ROS 水平的影響 由表2 可知，與空白對照組相比，平衡4、6、8 h 的質(zhì)膜完整性顯著提高。與空白對照組相比，試驗組頂體完整率均有顯著提高，其中平衡6 h的效果最顯著，提高12.69%（<0.05），平衡4、8 h組次之，分別提高8.39%、8.44%。與空白對照組相比，除平衡2 h 外，其他試驗組的線粒體膜電位、DNA 完整率均顯著提高，其中以平衡4、6 h 的效果最顯著，線粒體活性分別顯著提高11.75%、12.27%，DNA 完整率分別顯著提高6.84%、7.03%。與空白對照組相比，平衡2、12 h 的 ROS 水平顯著上升，其余組ROS 水平均顯著下降，其中平衡6 h 的效果最為顯著，降低12.24%。結果顯示，平衡4～8 h 對精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性、線粒體膜電位、DNA 完整率均有顯著的提高作用，對于ROS 水平均具有顯著的降低作用。

表2 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA 完整率以及ROS 水平的影響

2.3 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后ATP 含量、抗氧化機能的影響 由表3 可知，與空白對照組相比，平衡4、6 h 的ATP 含量顯著提高，平衡8、12 h的ATP 含量反而顯著降低。與空白對照組相比，除平衡2 h 的MDA 變化不顯著外，其余試驗組均顯著降低，其中平衡6 h 的降低了4.74%（<0.05）。與空白對照組相比，SOD 酶的活性較對照組均顯著提高，其中平衡6 h 的效果最好，增加9.74%（。與空白對照組相比，平衡2、4、6 h 的GSH-Px 酶活性顯著提高，而CAT酶效果不顯著。平衡2、4、6 h 的SOD、CAT、GSHPx3 種抗氧化酶活性均顯著提高，平衡4、6 h 的ATP含量顯著提高，其余作用不太明顯，平衡6 h 的MDA水平下降最為顯著，下降4.74%。

表3 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后ATP 含量、抗氧化機能的影響

圖1 豬精液冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、DNA 完整率、線粒體膜電位熒光顯微鏡圖

3 討 論

3.1 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后運動參數(shù)的影響 近年來，在冷凍精子制備過程中加入抗氧化劑以改善冷凍后精子質(zhì)量的研究越來越多，在人、雞、羊、牛上研究表明蝦青素可以有效提高精子質(zhì)量。本實驗表明，與空白對照組相比，平衡6 h 的豬精子在解凍后各項運動參數(shù)均提高顯著，平衡4、8 h的對于部分運動參數(shù)來說也具有一定提高的作用，而平衡2 h 的對于各項運動參數(shù)提高作用不明顯反而會造成部分運動參數(shù)降低。在小型豬冷凍精子的研究中發(fā)現(xiàn)，添加500 μmol/L 的蝦青素精子活力和進行性活動精子數(shù)均顯著高于對照組，與本研究結果具有一定的相關一致性。

3.2 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位、DNA 完整率以及ROS 水平的影響 精子低溫保存過程與氧化應激和過量的ROS 產(chǎn)生有關。有研究表明，在冷凍稀釋液中添加2 μmol/L 蝦青素可抑制脂質(zhì)過氧化和調(diào)節(jié)精子膜的脂肪酸組成，改善解凍后的精子質(zhì)量。在冷凍稀釋液中添加1 μmol/L 蝦青素有利于提高狗精子凍融后的質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體膜電位以及DNA完整率等。陳海敏等研究得出，在冷凍稀釋液中添加蝦青素能有效減少核DNA 受損，質(zhì)膜和線粒體明顯受到保護。在關于心肌細胞氧化應激損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，蝦青素可以減弱信號刺激從而減少ROS 水平的提高，對心肌細胞氧化應激損傷具有保護作用。本研究中，蝦青素平衡4～8 h 對ROS 水平均具有顯著的降低作用，對精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整性、線粒體膜電位、DNA 完整率均有顯著的提高作用。

3.3 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍后ATP 含量及抗氧化機能的影響 蝦青素作為一種有效的抗氧化劑，在冷凍精液過程中發(fā)揮重要作用。在冷凍稀釋液中添加25 mg/kg 的蝦青素，在保護公雞睪丸免受鎘誘導的氧化應激方面起到了有效的抗氧化劑作用。Liu 等證實蝦青素能有效提高大鼠的精子中的GSH-Px、CAT和SOD 活性，而MDA 含量顯著降低。Mansour 等研究表明在飼料中添加蝦青素可抑制精液中的脂質(zhì)過氧化。本研究中，平衡2～6 h 對SOD、CAT、GSH-Px3種抗氧化酶活性均顯著提高，平衡4～6 h 的ATP 含量顯著提高。

3.4 蝦青素平衡不同時間對豬精子冷凍-解凍的影響目前關于冷凍保存液中添加抗氧化物質(zhì)來減少氧化損傷方面的研究較多，并且也取得了較好的效果。但是添加物質(zhì)的作用時間方面研究甚少，本試驗證明添加蝦青素后需要跟精子作用一段時間才能獲得較好的效果。陳世偉等研究發(fā)現(xiàn)，將雞精液與加有抗凍劑的稀釋液平衡不同時間，解凍后精子活力隨著平衡時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。薛曉蓉等研究發(fā)現(xiàn)，將藏獒精液稀釋后平衡1、2、3.5 h，解凍后平衡2 h 組的各項質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)最好。由于不同物質(zhì)分子量和理化性質(zhì)不同，對精子細胞膜的通透性不同，需要作用的時間也不一樣，本研究選用的蝦青素是一種類胡蘿卜素，具有脂溶性，不溶于水，易溶于有機溶劑，所以與豬精子作用6 h 效果較好。

4 結 論

綜上所述，冷凍保存I 液中添加0.5 mmol/L 蝦青素對豬冷凍精液保存具有良好的效果，其中以平衡6 h的效果最佳。盡管本試驗對于豬冷凍精液的各項指標檢測顯示，添加蝦青素對豬冷凍精液保存品質(zhì)具有良好的效果，但冷凍后的精液并未進行人工授精檢驗其是否真正可以提高受胎率，關于此方面的研究還需進一步研究。