豬EEPD1 基因變異篩選鑒定及其對(duì)豬肌內(nèi)脂肪含量性狀的影響

吳俊靜，陳南琦，劉曉哲，喬 木，周佳偉，彭先文，梅書棋

（動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北武漢 430064）

隨著居民消費(fèi)提質(zhì)升級(jí)，豬肉消費(fèi)已由滿足“量”的需求，向“量質(zhì)并舉”的優(yōu)質(zhì)化、多元化方向發(fā)展，迫切需要構(gòu)建兼顧生產(chǎn)效率與肉品質(zhì)的優(yōu)質(zhì)豬生產(chǎn)體系，滿足人民對(duì)幸福生活的向往。因此，近年來豬肉質(zhì)性狀的選育與提高已備受關(guān)注。然而，豬肉品質(zhì)性狀難以活體測(cè)量，屠宰成本高，制約了該性狀的選育進(jìn)展。因此，尋找調(diào)控豬肉質(zhì)關(guān)鍵性指標(biāo)肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat，IMF）含量性狀的功能基因和有效分子育種標(biāo)記對(duì)該性狀的快速選育具有重要意義。

核酸內(nèi)切酶/ 核酸外切酶/ 磷酸酶家族結(jié)構(gòu)域1（Endonuclease/Exonuclease/Phosphatase Family Domain Containing 1，EEPD1）是一種DNA 5'端核酸內(nèi)切酶，參與DNA 修復(fù)，促進(jìn)DNA 雙鏈斷裂處的應(yīng)激復(fù)制叉的重啟，同時(shí)EEPD1 通過經(jīng)典非同源末端連接和微量同源介導(dǎo)末端連接抑制DNA 損傷修復(fù)。研究表明，EEPD1 參與膽固醇外排的正向調(diào)節(jié)，提示EEPD1 可能在脂質(zhì)代謝的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

硒都黑豬是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牽頭培育的優(yōu)質(zhì)黑豬新品種，具有肉質(zhì)優(yōu)良、繁殖性能好、抗逆性強(qiáng)等突出特色。為了挖掘影響其肉質(zhì)的關(guān)鍵基因，課題組利用RNA-seq 技術(shù)分析了IMF 高低極端差異個(gè)體的硒都黑豬背最長肌組織中基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)基因在高低IMF 個(gè)體中顯著差異表達(dá)，推測(cè)基因可能對(duì)IMF 性狀有影響。因此，本研究擬在硒都黑豬群中篩選鑒定豬基因的遺傳變異及其對(duì)IMF 性狀的影響，為IMF 性狀的遺傳改良提供新的分子育種標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 218 頭健康硒都黑豬飼養(yǎng)于建始縣紅巖寺湖北天之力育種科技有限公司，當(dāng)體重達(dá)95～105 kg時(shí)進(jìn)行屠宰，采集背肌、腰肌、比目魚肌、股二頭肌、心、肝、脾、肺、腎、胃、皮下脂肪、腹脂、腸脂、十二指腸、小腸、盲腸、卵巢、子宮等組織黃豆大小樣本于2 mL 凍存管中，置于液氮保存。同時(shí)，采集200 g 左右背肌低溫條件（4℃）下保存帶回實(shí)驗(yàn)室，收集并記錄屠宰日齡、屠宰日期、屠宰體重、系譜等基本信息備用。

1.2 IMF 性狀測(cè)定 IMF 測(cè)定采用索氏抽提法，具體參見姜愛文等文章。

1.3 基因組DNA 和RNA 提取 采用天根生化科技有限公司動(dòng)物組織DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，利用Invitrogen TRIzol 和氯仿試劑提取組織總RNA。通過1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 和RNA 質(zhì)量，并用Nanodrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)核酸濃度。

1.4 豬基因變異位點(diǎn)篩選 根據(jù)豬基因序列（GenBank 登錄號(hào)：NC_010460.4），采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)正向和反向引物對(duì)（表1），由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。將隨機(jī)選擇的37 個(gè)硒都黑豬DNA樣本組成混合DNA 池作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收、純化后送北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行Sanger 測(cè)序，結(jié)合測(cè)序峰形圖篩選基因變異位點(diǎn)。

1.5 豬基因變異位點(diǎn)基因分型 利用上述EEPD1-E8 引物對(duì)，采用上述PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序法在218 頭硒都黑豬群中進(jìn)行基因分型檢測(cè)。

1.6 豬基因熒光定量檢測(cè) 取1 μg 的RNA 樣本，利用Thermo ScientificRevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 試劑盒，在Applied Biosystems 公司QuantStudio 6 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。以基因?yàn)閮?nèi)參，采用2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每組實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。qPCR 引物及退火溫度見表1，采用20 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，循環(huán)40 次。

表1 豬EEPD1 基因序列引物信息

1.7 生物信息學(xué)分析與統(tǒng)計(jì)分析 利用RNAfold WebServer 在線軟件（http://nibiru.Tbi.univie.ac.at/cgibin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）預(yù)測(cè)mRNA 最小自由能和質(zhì)心二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用SPSS 26 統(tǒng)計(jì)軟件的GLM 模型進(jìn)行SNP 位點(diǎn)與IMF 的關(guān)聯(lián)分析。所采用模型為：Y=+G+A+X+S+e，其中：Y表示表型值；表示群體均值；G表示基因型效應(yīng)；A表示年季效應(yīng)；X表示性別效應(yīng)；S表示父本效應(yīng)；e表示隨機(jī)殘差效應(yīng)。結(jié)果以最小二乘均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，<0.05判定為差異顯著；<0.01 判定為差異極顯著。應(yīng)用檢驗(yàn)檢測(cè)是否符合哈代-溫伯格平衡（>0.05 表示處于遺傳平衡狀態(tài)，<0.05 則相反）。

2 結(jié)果與分析

2.1基因組織表達(dá)譜 利用qPCR 方法檢測(cè)了豬基因組織表達(dá)譜情況，發(fā)現(xiàn)該基因在肌肉、脂肪、各內(nèi)臟器官等組織中廣泛表達(dá)，在背肌組織中表達(dá)量最高，其次是小腸和皮下脂肪組織（圖1）。同時(shí)，選取4 頭IMF 低組（平均IMF 為1.49%）和4 頭IMF 高組（平均IMF 為4.48%）硒都黑豬背肌組織樣本RNA，檢測(cè)基因表達(dá)水平與IMF 的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因的表達(dá)量在IMF 低組個(gè)體中極顯著高于IMF 高組個(gè)體（圖2）。

圖1 豬EEPD1 基因組織表達(dá)譜

圖2 豬EEPD1 基因在高低IMF 背肌組織表達(dá)量

2.2 豬基因變異檢測(cè)結(jié)果 利用DNA 混合池PCR 測(cè)序方法，在基因第8 外顯子中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5 個(gè)SNP 位點(diǎn)，分別為g.123857 C>G、g.123907 A>G、g.124024 A>G、g.124050 G>A 和g.124222 A>G，如圖3 所示。

圖3 豬EEPD1 基因第8 外顯子SNP 位點(diǎn)的Sanger 測(cè)序圖譜

2.3 豬基因變異對(duì)IMF 性狀的影響 屠宰測(cè)定了218 頭硒都黑豬100 kg 體重IMF 性狀，其表型分布頻率如圖4 所示。利用PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)獲得這218 頭個(gè)體基因各SNP 位點(diǎn)的基因型，并將基因型與其IMF 性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，g.123857 C>G、g.123907 A>G、g.124024 A>G、g.124050 G>A和g.124222 A>G 均顯著影響IMF 性狀（表2），且這5 個(gè)位點(diǎn)均符合哈代-溫伯格平衡。例如，g.123907 A>G 位點(diǎn)GG 純合基因型個(gè)體的IMF 極顯著高于AA純合基因型個(gè)體，且IMF 性狀存在GG>AG>AA 的關(guān)系。

表2 豬EEPD1 基因SNP 位點(diǎn)與硒都黑豬肌內(nèi)脂肪含量性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

圖4 群體IMF 性狀分布頻率

2.4 豬基因單倍型對(duì)IMF 性狀的影響 利用Haploview 軟件分析了基因的5 個(gè)SNP 位點(diǎn)的連鎖關(guān)系（圖5），發(fā)現(xiàn)它們存在不同程度的連鎖，其中g(shù).123907 A>G、g.124024 A>G 和g.124050 G>A 緊密連鎖，處于同一個(gè)連鎖不平衡模塊。在硒都黑豬群體中，這3 個(gè)位點(diǎn)共檢測(cè)到7 種組合基因型，且不同單倍型組合基因型顯著影響IMF 性狀（表3）。GGGGAA 基因型個(gè)體的IMF 含量最高，極顯著高于AAAAGG 基因型個(gè)體，且顯著高于AGAAGG、AGAGGA、AGAGAA基因型個(gè)體。

圖5 豬EEPD1 基因5 個(gè)SNP 位點(diǎn)的連鎖不平衡（r2）分析結(jié)果

表3 EEPD1 基因單倍型與IMF 關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.5 豬mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用RNAfold WebServer 在線程序?qū)ωimRNA 及5 個(gè)SNP 位點(diǎn)突變后的mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小自由能（MFE）與質(zhì)心二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6 所示。各SNP 位點(diǎn)造成其mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能產(chǎn)生不同程度的改變，且g.123907 A>G、g.124050 G>A 和g.124222 A>G 突變明顯改變了其mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，它們的質(zhì)心二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能高于野生型。

圖6 豬EEPD1 基因各SNP 突變后mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)圖對(duì)比

3 討 論

EEPD1 蛋白是核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、磷酸酶家族成員，主要在人類DNA 損傷期間修復(fù)受壓復(fù)制叉中發(fā)揮作用，與癌癥發(fā)生相關(guān)。有關(guān)基因參與脂類代謝及脂質(zhì)調(diào)控的研究報(bào)道較少。路曉梅發(fā)現(xiàn)基因參與調(diào)控人和鼠血脂代謝，及肝臟脂肪酸的合成及脂質(zhì)沉積。有關(guān)雞脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析發(fā)現(xiàn)，禁食會(huì)顯著影響脂肪形成相關(guān)通路中的基因表達(dá)，且雞基因?qū)χ舅岷铣删哂胸?fù)調(diào)控作用，但具體機(jī)制尚不明確。Li 等發(fā)現(xiàn)公牛閹割后會(huì)導(dǎo)致等7 個(gè)基因顯著差異表達(dá)，并影響牛腰最長肌肌內(nèi)脂肪含量，表明?；蚺c肌內(nèi)脂肪沉積緊密相關(guān)。而有關(guān)豬基因的研究尚未見報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)豬基因在高、低IMF背肌組織中顯著差異表達(dá)，結(jié)合其他物種功能研究報(bào)道，推測(cè)基因是影響豬肉質(zhì)性狀的候選基因。因此，進(jìn)一步篩選了該基因的遺傳變異，共發(fā)現(xiàn)了位于基因第8 外顯子的5 個(gè)SNP 位點(diǎn)，即g.123857 C>G、g.123907 A>G、g.124024 A>G、g.124050 G>A和g.124222 A>G。通過與豬肌IMF 性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)這5 個(gè)SNP 位點(diǎn)均顯著影響IMF 性狀，證實(shí)基因是影響豬IMF 性狀的一個(gè)功能基因。

為了分析這5 個(gè)SNP 位點(diǎn)的關(guān)系，開展了單倍型分析。結(jié)果表明，g.123907 A>G、g.124024 A>G 和g.124050 G>A 緊密連鎖，處于同一連鎖不平衡模塊中，且其組成的單倍型基因型也與IMF 性狀顯著相關(guān)。所檢測(cè)硒都黑豬群體中存在7 種組合基因型，GGGGAA 基因型個(gè)體IMF 最高，極顯著高于AAAAGG 基因型個(gè)體IMF。因此，在育種中應(yīng)予以優(yōu)先保留攜帶GGGGAA基因型的個(gè)體，以提高群體的肉質(zhì)性能水平。

為了進(jìn)一步分析這5 個(gè)SNP 的功能，分析了這5個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)EEPD1 蛋白氨基酸編碼的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)g.123907 A>G 位點(diǎn)導(dǎo)致EEPD1 蛋白第554 個(gè)氨基酸由絲氨酸到甘氨酸（Ser>Gly）的改變。然而通過對(duì)EEPD1 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸突變對(duì)蛋白-螺旋、-轉(zhuǎn)角、-折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)均沒有較大影響，因此推測(cè)該位點(diǎn)并不是通過影響蛋白結(jié)構(gòu)而發(fā)揮功能作用。翻譯是基因表達(dá)的關(guān)鍵過程之一，其效率對(duì)于生命活動(dòng)十分重要。mRNA 作為翻譯體系的重要組成部分，在編碼蛋白質(zhì)的同時(shí)，對(duì)翻譯速率起一定程度的調(diào)控作用，mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)就是調(diào)控翻譯速率的一種方式?；诖耍M(jìn)一步分析了這5 個(gè)SNP 位點(diǎn)對(duì)mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各SNP 位點(diǎn)均造成其mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能產(chǎn)生不同程度的改變。g.123907 A>G、g.124050 G>A 和g.124222 A>G 突 變導(dǎo)致其mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，g.123857C>G和g.124024 A>G 突變位點(diǎn)雖然其mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不明顯，但是最小自由能降低，穩(wěn)定性有所提高。mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)在各種生命過程中發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)翻譯速率并直接影響mRNA 自身的穩(wěn)定性等。較多研究表明，mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性通過影響翻譯起始階段核糖體與mRNA 的結(jié)合以及核糖體在mRNA 上的移動(dòng)速率，進(jìn)而對(duì)翻譯蛋白質(zhì)的效率有很大影響。同時(shí)，mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也與蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著相關(guān)，且對(duì)基因功能也具有調(diào)控作用。因此，推測(cè)本研究發(fā)現(xiàn)的5 個(gè)SNP 位點(diǎn)主要是通過影響EEPD1 蛋白的翻譯效率進(jìn)而影響其生物學(xué)功能，但是其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，本研究鑒定的5 個(gè)影響IMF 性狀的分子標(biāo)記今后還需在多個(gè)品種豬群中進(jìn)行驗(yàn)證，并利用細(xì)胞模型進(jìn)一步明確其主效功能位點(diǎn)。

4 結(jié) 論

本研究在硒都黑豬群體中鑒定獲得了位于豬基因第8 外顯子上的5 個(gè)顯著影響豬IMF 性狀的SNP 位點(diǎn)，為豬IMF 性狀的選育提供了新的分子育種標(biāo)記。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這5 個(gè)SNP 位點(diǎn)導(dǎo)致其mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性發(fā)生變化，推測(cè)它們主要通過影響EEPD1 蛋白翻譯效率進(jìn)而影響IMF 性狀。今后將進(jìn)一步擴(kuò)大群體驗(yàn)證其遺傳效應(yīng)，并在細(xì)胞水平明晰其調(diào)控IMF 性狀的具體分子機(jī)制。