基于SNP 芯片分析安慶六白豬群體遺傳結(jié)構(gòu)

時(shí)坤鵬，劉 瑩，張志勇，吳 睿，丁月云，張曉東，鄭先瑞，殷宗俊*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.望江縣現(xiàn)代良種養(yǎng)殖有限公司，安徽安慶 246000）

俗名為“六花豬”的安慶六白豬為肉脂兼用型地方豬種，六白指該品種四肢、額部及尾端為白色，其余部分均為黑色，這也是其區(qū)分于其他地方品種豬最顯著的一項(xiàng)外表特征。安慶六白豬原產(chǎn)于安徽省安慶市望江縣與宿松縣，主要分布于望江、太湖、宿松、懷寧等地。安徽省農(nóng)業(yè)委員會(huì)2001 年將安慶六白豬列入第一批安徽省畜禽品種保護(hù)名錄，它也是國家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種之一。由于其瘦肉與肥肉間比例良好，進(jìn)而具有清晰的大理石紋，安慶六白豬也是優(yōu)良的生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉豬的理想雜交母本候選之一。安慶六白豬具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、抗病性強(qiáng)、繁殖力高、母性好等優(yōu)點(diǎn)，它不僅是安徽地方特色優(yōu)良品種之一，也是優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)豬育種的重要素材。

雖然安慶六白豬具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病性強(qiáng)、繁殖力高等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也因其生長速度慢、瘦肉率低、養(yǎng)殖效益差，以及外來豬種的沖擊和養(yǎng)殖群體規(guī)模較小等，制約了其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)進(jìn)程。為了保護(hù)我國這一地方優(yōu)良品種，本研究對(duì)部分安慶六白豬進(jìn)行親緣關(guān)系與遺傳多樣性分析，避免群體內(nèi)過度近交造成嚴(yán)重的近交劣勢(shì)從而導(dǎo)致安慶六白豬的數(shù)量繼續(xù)下降。而對(duì)豬群進(jìn)行親緣關(guān)系分析，最普遍使用的方法就是SNP 分子標(biāo)記法。

SNP（Single-Nucleotide Polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性，作為第3 代分子標(biāo)記的SNP 具有覆蓋密度大、較高的遺傳穩(wěn)定性、富有代表性、可自動(dòng)化分析等優(yōu)點(diǎn)，不管是動(dòng)物還是植物領(lǐng)域，進(jìn)行相關(guān)遺傳結(jié)構(gòu)分析、分子標(biāo)記輔助育種、全基因組關(guān)聯(lián)分析時(shí)都有所應(yīng)用。劉晨龍采用高密度SNP芯片對(duì)杭豬保種群體遺傳多樣性、個(gè)體所屬家系結(jié)構(gòu)及相互間親緣關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)分析。任麗群研究宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬總產(chǎn)仔數(shù)等繁殖性狀時(shí)，在PRLR 基因外顯子10 上發(fā)現(xiàn)5 個(gè)SNP 位點(diǎn)對(duì)這些性狀具有顯著相關(guān)。近些年來伴隨SNP 芯片技術(shù)不斷成熟且該技術(shù)花費(fèi)也在逐漸降低，其愈加成為分析群體遺傳結(jié)構(gòu)的性價(jià)比最高的一項(xiàng)技術(shù)。本研究利用“中芯一號(hào)”芯片，對(duì)安慶六白豬群體多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在為安慶六白豬的保護(hù)、開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 供試的來源于望江縣現(xiàn)代良種養(yǎng)殖有限公司118 頭安慶六白豬，包括公豬18 頭，母豬100 頭。采集樣品均為耳組織，采集后裝存于含有500 μL 75%酒精的1.5 mL 離心管中，并置于-20℃冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 安慶六白豬群體DNA 提取與SNP 芯片分型 利用組織基因組DNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取DNA，后通過0.8% 瓊脂糖凝膠電泳與Nanodrop 方法對(duì)DNA 質(zhì)量與純度（D260 nm/D280 nm 比值）進(jìn)行定量檢測(cè)。質(zhì)檢合格的樣本采用“中芯一號(hào)”芯片對(duì)其進(jìn)行基因分型，分型后使用Plink（V1.90）軟件對(duì)基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下：去除性染色體上位點(diǎn)并保留常染色體上標(biāo)記，并且只保留SNP 檢出率（call rate）≥90%、個(gè)體檢出率≥90%、MAF（Minor Allele Frequency）≥0.01、哈迪-溫伯格值≥10的位點(diǎn)用于后續(xù)分析。

1.2.2 種群親緣關(guān)系鑒定 利用Plink（V1.90）與R 語言軟件對(duì)118 頭安慶六白豬群體質(zhì)控后的基因型數(shù)據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）及可視化結(jié)果圖的制作，了解該群體的聚類情況及遺傳多樣性。使用Gmatrix（V2）軟件對(duì)安慶六白豬118 個(gè)樣本構(gòu)建G 矩陣，通過R 語言軟件繪制矩陣熱圖后進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

1.2.3 遺傳距離分析 本研究利用Plink（V1.90）計(jì)算該群體中個(gè)體之間的遺傳距離并構(gòu)建狀態(tài)同源（Identity by State,IBS）矩陣進(jìn)行IBS 遺傳距離分析。采用MEGA10.0 軟件與鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）對(duì)SNP 基因型分型數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹圖的構(gòu)建。

1.2.4 ROH 分析 通過Plink（V1.90）對(duì)群體中所有個(gè)體的ROH（Runs of Homozygosity）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并求出各個(gè)樣本長純和片段長度，后與常染色體基因組總長度進(jìn)行對(duì)比得到每個(gè)樣本基于ROH 的近交系數(shù)并計(jì)算整個(gè)群體的平均近交系數(shù)值。分析參數(shù)如下：以20 個(gè)SNP為一個(gè)滑動(dòng)窗口，每個(gè)窗口雜合子個(gè)數(shù)要≤1。

2 結(jié)果

2.1 種群親緣關(guān)系分析

2.1.1 PCA 分析 為了解安慶六白豬群體中個(gè)體間親緣關(guān)系，首先利用PCA 分析將個(gè)體間的聚類情況展示出來。PCA 結(jié)果如圖1 所示，通過PCA 分析結(jié)果大致了解該群體的遺傳結(jié)構(gòu)。由圖1 可知，100 個(gè)母豬樣本基本上屬于隨機(jī)分布，具有較高的遺傳多樣性，而18 個(gè)公畜樣本大致形成4 個(gè)群落，表明公豬個(gè)體間存在較近的親緣關(guān)系，上一代存在近交情況。

圖1 118 只安慶六白豬PCA 可視化結(jié)果

2.1.2 基于G 矩陣的親緣關(guān)系分析 本研究為了進(jìn)一步了解個(gè)體間親緣關(guān)系情況，進(jìn)行了G 矩陣分析。安慶六白豬群體G 矩陣分析結(jié)果如圖2 所示，由于對(duì)角線上是每個(gè)樣本與其本身兩者之間的親緣關(guān)系值，親緣關(guān)系值最高所以呈現(xiàn)為黑色，親緣關(guān)系較近的個(gè)體會(huì)優(yōu)先聚類到一起，且它們所在的單元格顏色更接近黑色。圍繞該G 矩陣分析結(jié)果圖的對(duì)角線，可以看到大致有10個(gè)淺灰色區(qū)域，這10 個(gè)區(qū)域證明屬于這些區(qū)域的樣本之間的親緣關(guān)系相對(duì)較近。

圖2 安慶六白豬G 矩陣分析結(jié)果

2.1.3 IBS 遺傳距離分析 本研究還將118 個(gè)安慶六白豬個(gè)體間IBS 遺傳距離進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)該群體中個(gè)體間IBS 遺傳距離在0.114 5～0.367 2 之間，平均值為0.276 9±0.041 7，證明該群體中個(gè)體間遺傳距離較大，存在少數(shù)個(gè)體遺傳距離較近。18 頭公豬間IBS 遺傳距離在0.147 8～0.336 0 之間，平均值為0.273 8±0.042 0，該遺傳距離數(shù)值表明公豬個(gè)體間的遺傳距離相對(duì)較近（中高等程度的親緣關(guān)系）且有較大差異，之后應(yīng)對(duì)公豬保種配種工作加以重視。

2.2 安慶六白豬基于ROH 的近交系數(shù)分析 實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了該群體中118 頭豬每個(gè)個(gè)體的ROH 數(shù)量與ROH 總長，通過計(jì)算得出了所有個(gè)體基于ROH 的近交系數(shù)。基于ROH 的近交系數(shù)可視化結(jié)果見圖3，該圖展示了全部樣本的近交系數(shù)的分布情況。本實(shí)驗(yàn)在118 頭安慶六白豬群體中共檢測(cè)出3 847 個(gè)ROH 片段，平均每個(gè)個(gè)體中約有33 個(gè)ROH 片段且個(gè)體ROH 總長度約為255.19 Mb。從圖中可以發(fā)現(xiàn)該群體F的上四分位數(shù)在0.15 以下，則說明群體中大多數(shù)個(gè)體近交系數(shù)值都在0.15 以下，該群體近交系數(shù)值中位數(shù)位于0.1 以下，少數(shù)個(gè)體近交系數(shù)值在0.15 之上，表明小部分個(gè)體間存在一定近交情況，親緣關(guān)系較近。

圖3 118 只安慶六白豬基于ROH 的近交系數(shù)FROH 的分布

2.3 群體家系結(jié)構(gòu)分析 為了直觀判斷出公豬個(gè)體間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，本實(shí)驗(yàn)通過MEGA10.0 軟件繪制公豬聚類分析NJ 樹來進(jìn)行評(píng)估。圖4 為18 頭公豬個(gè)體聚類情況，圖5 為安慶六白豬群體聚類分析結(jié)果。由圖4、圖5 可以看出18 頭公豬個(gè)體之間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度以及家系分屬，也能直觀了解群體內(nèi)每個(gè)個(gè)體所屬家系分布情況，本實(shí)驗(yàn)以公畜相互間親緣關(guān)系≥0.1 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類。18 頭公豬個(gè)體各自被劃分入家系A(chǔ)、家系B、家系C、家系D、家系E 當(dāng)中且存在交叉現(xiàn)象，分別含有4、3、8、4、7 個(gè)個(gè)體。之后依據(jù)親緣關(guān)系值≥0.1 劃分整個(gè)保種群體，家系A(chǔ) 中公豬、母豬個(gè)數(shù)分別為4、70 頭，家系B 中有公豬3 頭，母豬67 頭，家系C 有8 頭公豬，73 頭母豬，家系D 的公、母豬個(gè)數(shù)為4、32 頭，家系E 中有7 頭公豬，33 頭母豬，其中100 頭母豬相互間也存在交叉現(xiàn)象，被同時(shí)劃分入不同家系當(dāng)中，證明本次實(shí)驗(yàn)群體內(nèi)存在近交情況，與PCA 分析、G 矩陣分析結(jié)果保持一致。

圖4 18 頭公豬聚類分析結(jié)果

圖5 安慶六白豬群體聚類分析結(jié)果

3 討 論

我國許多地方豬種都存在一個(gè)共性問題，就是在各個(gè)豬種的系譜記錄上都沒有嚴(yán)格記錄，在對(duì)其進(jìn)行保種工作時(shí)大部分豬種系譜資料都是以詢問當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶的方式獲取，豬的系譜記錄對(duì)豬群體保種育種工作是十分重要的。二代或者三代以內(nèi)豬的親緣關(guān)系通過SNP 標(biāo)記進(jìn)行鑒定能夠與系譜記錄匹配一致。在已報(bào)道的對(duì)親緣關(guān)系鑒定和遺傳多樣性分析的研究中，常見的是微衛(wèi)星標(biāo)記分析和SNP 標(biāo)記。但是SNP 標(biāo)記與微衛(wèi)星2 種方法對(duì)野生紅鮭種群的親緣關(guān)系與遺傳多樣性鑒定中發(fā)現(xiàn)，SNP 標(biāo)記估計(jì)群體親緣關(guān)系的準(zhǔn)確性要高于微衛(wèi)星標(biāo)記。因此本研究采用“中芯一號(hào)”（Illumina CAUPorince 50K SNP）芯片對(duì)安慶六白豬群體進(jìn)行親緣關(guān)系分析，個(gè)體基因型檢出率平均高達(dá)98.86%，藍(lán)塘豬與淳安花豬個(gè)體平均基因型檢出率分別為98.24%和98.49%。研究表明“中芯一號(hào)”芯片與我國地方豬種SNP 檢測(cè)具有極高匹配度，同時(shí)也說明了SNP 分型結(jié)果的可靠性，可進(jìn)行下一步分析。

本次研究首先基于芯片基因型數(shù)據(jù)，之后依次通過PCA、G 矩陣、NJ 聚類、近交系數(shù)對(duì)該安慶六白豬群體中共118 個(gè)個(gè)體間的親緣關(guān)系進(jìn)行了遺傳分析，本實(shí)驗(yàn)與束婷婷等人在關(guān)于2 個(gè)瑤雞群體親緣關(guān)系分析時(shí)采用的分析思路一致。PCA 分析以降維思想將千萬數(shù)據(jù)進(jìn)行刪減，僅保留較為重要的幾個(gè)指標(biāo)。本研究通過PCA 分析，18 頭安慶六白豬公豬被劃分成4 個(gè)群落，證明公豬群體內(nèi)存在較近的親緣關(guān)系，而100 頭母豬基本上呈現(xiàn)隨機(jī)分布，表明母豬群體內(nèi)遺傳多樣性較高。蘭蓉等在研究37 只波爾山羊公羊相互間的親緣關(guān)系情況時(shí)利用PCA 分析得到了7 個(gè)群落，相比本次研究中18 頭安慶六白豬公豬而言，群落數(shù)量更為豐富，即使波爾山羊公羊群體個(gè)數(shù)高于安慶六白豬公豬群體個(gè)數(shù)，但也可以看出安慶六白豬家系規(guī)模的確較小，之后應(yīng)該注意對(duì)安慶六白豬的保種工作加以重視。雖然該P(yáng)CA 分析得到的4 個(gè)群落與最終的NJ 聚類分析所得到的5 個(gè)家系分類結(jié)果略微有所差異，但是通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)2 個(gè)分析結(jié)果具有一致性。

聚類分析是一種依據(jù)個(gè)體相互間存在不同程度相似性對(duì)群體進(jìn)行分類的方法，使用該方法可以將群體內(nèi)不同個(gè)體間的親疏關(guān)系以系譜圖的方式展現(xiàn)出來。本實(shí)驗(yàn)通過NJ 聚類分析法對(duì)該群體進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)18個(gè)公畜樣本被劃分為5 個(gè)家系，由于此次NJ 聚類是以公畜相互間分子親緣關(guān)系≥0.1 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類，計(jì)算發(fā)現(xiàn)存在一些個(gè)體與不同家系里面的某些個(gè)體間的親緣關(guān)系都≥0.1，所以個(gè)體間存在交叉現(xiàn)象導(dǎo)致5 個(gè)家系中存在相同公畜。蔡春波等分析馬身豬公豬群體時(shí)也出現(xiàn)交叉現(xiàn)象，這種交叉現(xiàn)象是由于個(gè)體間具有近交情況所造成，地方豬種之后應(yīng)盡可能去杜絕這種現(xiàn)象。最初PCA 分析的結(jié)果也可以看出公畜個(gè)體與其他種群中的個(gè)體間的距離也比較近，也就進(jìn)一步證明PCA 分析與NJ 聚類分析2 種分析間結(jié)果的一致性。所以當(dāng)以該家系構(gòu)建分析結(jié)果去進(jìn)行指導(dǎo)育種時(shí)，建議嚴(yán)格按照親緣關(guān)系系數(shù)大小進(jìn)行育種工作，避免因過多近交造成不良后果。

ROH 即長純和片段廣泛存在于所有群體當(dāng)中，群體遺傳歷史與ROH 片段的長度及頻率存在相關(guān)性。本次研究所得近交系數(shù)是基于ROH 片段計(jì)算出來的，相對(duì)基于系譜所得出的近交系數(shù)更為可靠，Purfiled 等的研究結(jié)果也證實(shí)了基于ROH 的近交系數(shù)值可信度更高。通過計(jì)算群體的近交系數(shù)可以進(jìn)一步了解該群體的近交史。此次研究中安慶六白豬群體的平均近交系數(shù)值為0.107。戴麗荷等在利用SNP 標(biāo)記研究淳安花豬群體遺傳多樣性時(shí)，計(jì)算其群體平均近交系數(shù)值為0.199，蔡春波等運(yùn)用SNP 芯片分析馬身豬保種群體遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)測(cè)得平均近交系數(shù)值為0.237，高于本次研究群體。劉彬等研究青裕豬群體遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)測(cè)得平均近交系數(shù)值為0.075，于國升研究深縣豬時(shí)近交系數(shù)值為0.009 3。雖然本次安慶六白豬群體近交系數(shù)值處于中等水平，但這個(gè)數(shù)值實(shí)際來自公母畜的共同作用，從上述PCA 分析以及NJ 聚類分析可以看出，母畜個(gè)體間親緣程度較低，證明18 頭公畜個(gè)體間近交情況大于總體平均值。即使他們研究群體總量可能大小有所不同，但從總體上來講本次研究群體的遺傳多樣性相對(duì)較低，之后在進(jìn)行育種與保種工作時(shí)要加以重視。

4 結(jié) 論

本項(xiàng)目使用“中芯一號(hào)”芯片對(duì)118 個(gè)安慶六白豬樣本進(jìn)行基因分型，首先利用PCA 分析大致了解該群體的遺傳結(jié)構(gòu)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)18 頭公畜樣本被劃分成4 個(gè)群體；IBS 遺傳距離分析以及基于G 矩陣的親緣關(guān)系分析結(jié)果展示發(fā)現(xiàn)存在一些親緣關(guān)系較近的群體，表明有些個(gè)體間存在一定的近交情況；本次實(shí)驗(yàn)群體平均近交系數(shù)值為0.107，該數(shù)值相對(duì)較高；NJ 聚類分析將18 頭公畜被劃分為5 個(gè)家系，且家系之間存在重復(fù)出現(xiàn)的個(gè)體；由上述多個(gè)分析結(jié)果來看，該群體的遺傳多樣性相對(duì)較低，之后在針對(duì)該群體的育種過程中應(yīng)當(dāng)科學(xué)選配，避免群體內(nèi)過度近交導(dǎo)致嚴(yán)重的近交劣勢(shì)。