煙葉中β-胡蘿卜素高效降解菌株的篩選鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

龍章德，王敏，薛云，孫建生，劉啟斌，劉鴻，毛多斌，魏濤

1.廣西中煙有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，廣西 南寧 530001；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

類胡蘿卜素是存在于植物和微生物中的親脂性異戊二烯類色素，已知有700多種，主要包括β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、葉黃素、番茄紅素等，其中β-胡蘿卜素分布最廣[1-3]。β-胡蘿卜素因含有3～15個(gè)共軛雙鍵而表現(xiàn)出高度不飽和性，通過(guò)酶或光氧化可降解產(chǎn)生C-13、C-11、C-10、C-9等衍生物，這些衍生物中包括α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等重要的香料物質(zhì)，因此β-胡蘿卜素及其降解產(chǎn)物在食品、化妝品、酒類風(fēng)味發(fā)酵、煙草加工等行業(yè)均具有廣泛應(yīng)用[4-5]。β-胡蘿卜素裂解產(chǎn)物β-紫羅蘭酮和β-大馬酮是西紅柿的主要風(fēng)味成分[6]；β-胡蘿卜素降解形成的類異戊二烯的 C-10化合物組分對(duì)柑橘果汁的香氣影響很大[7]；葡萄酒主要香氣成分異戊二烯衍生物(如β-突厥烯酮、β-紫羅蘭酮等)也是β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物[8]。新鮮煙葉中的類胡蘿卜素種類除上文提及的外，還具有新葉黃素、紫黃素、八氫番茄紅素等，類胡蘿卜素總含量不高，一般為0.1%～1.1%，將β-胡蘿卜素添加到煙絲中能有效提高卷煙香味品質(zhì)[9-10]。

目前β-胡蘿卜素的降解方式有物理降解、化學(xué)降解和生物降解[11-12]。物理降解需要進(jìn)行高溫處理，不便應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)；化學(xué)降解需要加入化學(xué)試劑催化裂解，化學(xué)試劑難以去除，且產(chǎn)生的廢液會(huì)污染環(huán)境[4-5]。生物降解是利用微生物及其所產(chǎn)生的酶催化降解β-胡蘿卜素，具有降解專一性強(qiáng)、效率高、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)，但是目前已報(bào)道的能降解β-胡蘿卜素的微生物還比較少，主要是酵母菌、芽孢桿菌和巴氏葡萄球菌等，能應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中的菌株更少[13-15]。

豫煙13是近年來(lái)培育的烤煙純系新品種，烤后原煙顏色均勻、結(jié)構(gòu)疏松、油分較足、化學(xué)成分協(xié)調(diào)，在我國(guó)黃淮煙區(qū)和東北部分煙區(qū)種植較為廣泛。本研究擬從豫煙13煙葉中篩選能夠降解β-胡蘿卜素的新型微生物菌種，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以提高菌株降解β-胡蘿卜素的能力，以期為工業(yè)化降解β-胡蘿卜素提供新的菌種資源和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：三門峽煙區(qū)種植的新鮮豫煙13煙葉，自行采集得到。

主要試劑：β-胡蘿卜素(純度96%)，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；蔗糖、酵母粉、磷酸氫二鉀、硝酸鈉，均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

富集培養(yǎng)基[14]：K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，硝酸鈉 3 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，蔗糖30 g/L，酵母粉3 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加質(zhì)量濃度為20 mg/L的β-胡蘿卜素。

主要儀器：SW-CJ-IF型單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)；LDZX-50KBS 型立體壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)；UV-1500紫外分光光度計(jì)，上海美析儀器有限公司產(chǎn)；5810R型離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)；7890C型GC-MS色譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選初篩：稱取10 g煙葉于100 mL無(wú)菌水中浸泡24 h，取2 mL加入到富集培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)得到菌源液。對(duì)菌源液進(jìn)行稀釋涂布，每個(gè)濃度梯度涂布3個(gè)平行平板，以添加β-胡蘿卜素空白平板為對(duì)照，置于30 ℃條件下培養(yǎng)，每隔12 h觀察平板褪色情況，挑選透明圈明顯的、形態(tài)較好的單菌落，反復(fù)劃線分離純化。

復(fù)篩：挑選出透明圈明顯的單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下發(fā)酵。通過(guò)對(duì)發(fā)酵液中β-胡蘿卜素降解率和降解產(chǎn)物的分析篩選出降解β-胡蘿卜素能力較強(qiáng)的菌株。

β-胡蘿卜素降解率的測(cè)定方法：β-胡蘿卜素降解率的測(cè)定采用分光光度法。以接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作為實(shí)驗(yàn)組，未接種的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照組，發(fā)酵12 h后分別以培養(yǎng)基作為空白測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的吸光度，降解率(R)計(jì)算公式[17]如下。

式中：C實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)組中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)；C對(duì)照為對(duì)照組中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)。

β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物檢測(cè)方法：用GC-MS對(duì)發(fā)酵液中的β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。GC檢測(cè)條件[16]為HP-5柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；高純氦氣作載氣，流速為1 mL/min；程序升溫：40 ℃，保持2.5 min，以2 ℃/min 的升溫速度升至280 ℃并保持5 min；進(jìn)樣量為1 μL；不分流；采用全掃描模式。MS檢測(cè)條件為溶劑延遲時(shí)間8 min；質(zhì)量掃描范圍30～500 amu；進(jìn)樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃；離子源EI溫度230 ℃，電離能70 eV；檢測(cè)器溫度280 ℃；全離子掃描(Scan)模式。

1.2.2 菌株鑒定將篩選出的菌株用結(jié)晶紫染色2分鐘，分別在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察菌株菌落特征與形態(tài)。然后利用16S rDNA鑒定方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。提取細(xì)菌核基因組DNA，并以提取的DNA為模板，進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，所用引物為27F(正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(反向引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增反應(yīng)體系為：1.0 μL基因組DNA(20 ng/μL)、39.0 μL ddH2O、5.0 μL 10×Buffer(含2.5 mmol/L Mg2+)，1.0 μL Taq 聚合酶(5 U/μL)，1.0 μL dNTP(10 mmol/L)，1.5 μL 27F引物(10 μmol/L)，1.5 μL 1492R引物(10 μmol/L)。測(cè)序由上海派森諾生物科技有限公司完成。用NCBI Blast程序?qū)⑵唇雍蟮男蛄形募cNCBI 16S數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到與待測(cè)菌株序列相似性最大的物種信息，以16S rDNA同源性為基礎(chǔ)，利用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析。

1.2.3 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)：在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以碳源(蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、葡萄糖)、碳源質(zhì)量濃度(10 g/L、30 g/L、50 g/L、70 g/L、90 g/L)、氮源(胰蛋白胨、硝酸鈉、(NH4)2SO4、尿素)、氮源質(zhì)量濃度(1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L)、酵母粉質(zhì)量濃度(1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L)、初始pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%)為考查因素，研究單因素試驗(yàn)條件下β-胡蘿卜素的降解率。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以β-胡蘿卜素降解率為考查指標(biāo)，利用發(fā)酵培養(yǎng)基中適宜碳源的質(zhì)量濃度(A)、適宜氮源的質(zhì)量濃度(B)、酵母粉質(zhì)量濃度(C)和初始pH值(D)4個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)。

數(shù)據(jù)處理：采用Excel 2016對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用SPSS 17.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

從煙葉中篩選到9株能降解β-胡蘿卜素的菌株，其中菌株YT-3降解能力最強(qiáng)，β-胡蘿卜素降解率為81.65%(如圖1所示)。用GC-MS檢測(cè)菌株YT-3發(fā)酵液，分析出發(fā)酵液中含有醛類、酮類、醇類、烯烴類、有機(jī)酸和酯類等多種化合物，β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物主要香味物質(zhì)如表1所示，其中β-環(huán)檸檬醛(3.21%)、β-紫羅蘭酮(5.35%)和二氫獼猴桃內(nèi)酯(12.26%)在改善煙葉品質(zhì)和制備食品香料方面具有重要作用。因此，進(jìn)一步對(duì)菌株YT-3的β-胡蘿卜素降解能力進(jìn)行研究。

表1 菌株YT-3降解產(chǎn)物主要香味物質(zhì)

圖1 9株降解β-胡蘿卜素菌株降解率比較

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株YT-3的菌落特征與形態(tài)在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)菌株YT-3，其形態(tài)特征為菌落較小，色白，表面光滑，濕潤(rùn)，邊緣整齊，不易挑起。經(jīng)革蘭氏染色在顯微鏡下觀察，菌體形態(tài)為短桿狀，菌體呈紅色，是革蘭氏陰性(G-)菌(如圖2所示)。

圖2 菌株YT-3的菌落和細(xì)胞形態(tài)

2.2.2 菌株YT-3分子進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果由分子鑒定結(jié)果可知，菌株YT-3的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1421 bp(如圖3所示,圖中1—3為16S rDNA,Maker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))。將該16S rDNA序列在NCBI Blast同源序列檢索，結(jié)果表明，該菌株與霍氏腸桿菌亞種16S rDNA基因序列同源性較高。菌株YT-3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4所示。由圖4可知，菌株YT-3與Enterobacterhormaecheisubsp.xiangfangensisstrain 10-17遺傳距離較近，結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果,將YT-3菌株鑒定為霍氏腸桿菌亞種。目前，霍氏腸桿菌EnterobacterhormaecheiA20已被發(fā)現(xiàn)可以有效將葉黃素降解為8-甲基-α-紫羅酮、3-羥基-α-紫羅酮、3-氧代-α-紫羅蘭酮等[18-19]。菌株YT-3是發(fā)現(xiàn)的另一株能夠類降解胡蘿卜素物質(zhì)(β-胡蘿卜素)的霍氏腸桿菌亞種。

圖3 菌株YT-3 PCR擴(kuò)增電泳圖

圖4 菌株YT-3系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果碳源種類和質(zhì)量濃度對(duì)菌株YT-3的β-胡蘿卜素降解率和細(xì)胞干重的影響如圖5所示。由圖5可知，菌株YT-3在不同碳源下降解β-胡蘿卜素的活性為蔗糖>麥芽糖>葡萄糖>乳糖>果糖，以蔗糖為碳源β-胡蘿卜素降解率最高，達(dá)到82.5%，菌株的細(xì)胞干重為1.18 g/L。蔗糖是一種非還原性的雙糖，既能為菌株的生長(zhǎng)提供足夠碳源和能源物質(zhì)，又能保證菌株YT-3高效降解β-胡蘿卜素底物。當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L時(shí)，β-胡蘿卜素降解率達(dá)到82.90%，菌株能正常繁殖生長(zhǎng)且完全降解底物。因此，初步選擇30 g/L蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。

圖5 碳源對(duì)菌株YT-3的β-胡蘿卜素降解率和細(xì)胞干重的影響

氮源種類和質(zhì)量濃度對(duì)菌株YT-3的β-胡蘿卜素降解率和細(xì)胞干重的影響如圖6所示。由圖6可知，以硝酸鈉為氮源時(shí)，菌株YT-3對(duì)β-胡蘿卜素的降解能力最大，降解率為84.9%。硝酸鈉質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，降解率最高為87.7%，菌株的細(xì)胞干重為1.66 g/L。氮源質(zhì)量濃度過(guò)高，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，pH值偏高，不利于代謝相關(guān)酶的產(chǎn)生和活力保持。因此，初步選擇3 g/L硝酸鈉作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖6 氮源對(duì)菌株YT-3的β-胡蘿卜素降解率和細(xì)胞干重的影響

酵母粉質(zhì)量濃度、初始pH值、培養(yǎng)溫度和接種量對(duì)β-胡蘿卜素降解率和菌株細(xì)胞干重的影響如圖7所示。由圖7a)可知，酵母粉質(zhì)量濃度對(duì)β-胡蘿卜素降解率影響較大。當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，既能保證菌株YT-3快速生長(zhǎng)，又能提高β-胡蘿卜素降解率，降解率最大達(dá)到88.3%；當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度為9 g/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)狀況最好，但是對(duì)β-胡蘿卜素的降解能力最低。因此，初步選擇酵母粉濃度為3 g/L。由圖7b)可知，在初始pH值<7.0時(shí)，隨著pH值增大，β-胡蘿卜素降解率隨之增大；pH值>7.0時(shí)，降解率逐漸降低；pH值為7.0時(shí)，降解率達(dá)到最高，為89.1%，菌株的細(xì)胞干重也最高，為1.33 g/L。因此，初步選擇發(fā)酵初始pH值為7.0。由圖7c)可知，培養(yǎng)溫度小于30 ℃時(shí)，隨著溫度升高，菌株新陳代謝加快，降解率提高；溫度為30 ℃時(shí)，降解率最大，為89.6%，菌株的細(xì)胞干重較高，為1.20 g/L；溫度大于30 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)繁殖受到一定影響，降解率呈下降趨勢(shì)，但在30～40 ℃時(shí)，降解率增大，可能是因?yàn)棣?胡蘿卜素受高溫影響發(fā)生熱裂解[5-6]。因此，溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于β-胡蘿卜素降解?？梢?jiàn)，選擇最適培養(yǎng)溫度為30 ℃。由圖7 d)可知，接種量小于5%時(shí)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到有效利用，菌株能夠良好生長(zhǎng)，降解率隨接種量增加而提高；接種量為5%時(shí)，降解率達(dá)到最大為89.9%，菌株的細(xì)胞干重亦達(dá)到較高值，為1.39 g/L；接種量大于5%時(shí)，降解率降低，可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)大導(dǎo)致發(fā)酵液供氧不足，造成菌株產(chǎn)酶下降[20]。因此，選擇最適接種量為5%。

圖7 酵母粉質(zhì)量濃度、初始pH值、培養(yǎng)溫度和接種量對(duì)菌株YT-3的β-胡蘿卜素降解率和細(xì)胞干重的影響

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度(A)、硝酸鈉質(zhì)量濃度(B)、酵母粉質(zhì)量濃度(C)和初始pH值(D)4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表2。菌株YT-3降解β-胡蘿卜素發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。由表3可知，極差R的大小依次為A>B>D>C，這說(shuō)明各因素對(duì)降解的影響順序是蔗糖質(zhì)量濃度>硝酸鈉質(zhì)量濃度>初始pH值>酵母粉質(zhì)量濃度。由表4可知，蔗糖質(zhì)量濃度、硝酸鈉質(zhì)量濃度、初始pH值對(duì)β-胡蘿卜素降解率均有極顯著影響。由所得數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C2D2，即蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L，硝酸鈉質(zhì)量濃度為4 g/L，酵母粉質(zhì)量濃度為3 g/L，初始pH值為7.0。在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，β-胡蘿卜素降解率為97.05%。

表2 β-胡蘿卜素降解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表

表3 β-胡蘿卜素降解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

3 結(jié)論

本文從豫煙13煙葉中分離到一株能高效降解β-胡蘿卜素的菌株YT-3，將該菌株在含有β-胡蘿卜素(20 mg/L)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，β-胡蘿卜素可被有效降解為β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯和β-環(huán)檸檬醛等香味物質(zhì)。根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學(xué)和16 S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，鑒定該菌株為霍氏腸桿菌亞種(Enterobacterhormaniisubsp.YT-3)。經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到菌株YT-3降解β-胡蘿卜素最佳發(fā)酵條件為：硝酸鈉質(zhì)量濃度4 g/L、蔗糖質(zhì)量濃度30 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度3 g/L、初始pH值7.0，在該發(fā)酵條件下β-胡蘿卜素降解率達(dá)到97.05%。本研究可為β-胡蘿卜素降解菌株的開(kāi)發(fā)利用提供參考，也可為β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物在食品、化學(xué)領(lǐng)域和香精香料行業(yè)中的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。