法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室剪刀清洗和防污染探析

蔡鴻勇，高林林，謝 煒

（1.杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，杭州 310006；2. 杭州市公安局蕭山區(qū)分局，杭州 311200）

近年來，隨著法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的靈敏度不斷提高，由脫落細(xì)胞二次轉(zhuǎn)移引起的DNA實(shí)驗(yàn)室污染事件屢有報(bào)道[1-4]，其中脫落細(xì)胞類檢材被污染的情況尤為嚴(yán)重，有人專門統(tǒng)計(jì)了DNA實(shí)驗(yàn)樣本污染的情況，發(fā)現(xiàn)微量生物檢材被污染所占比重最大[5]。本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)發(fā)生的多起樣本被污染的情況經(jīng)追溯分析主因在于剪刀清洗不徹底，而多數(shù)法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室由于引進(jìn)全自動(dòng)清洗儀器后就對(duì)該項(xiàng)工作重視度下降甚或不足，因此本文嘗試探究一種簡(jiǎn)便有效的剪刀清洗方法以解決交叉污染的問題。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑耗材

Q1型清洗消毒機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），（博坤）全自動(dòng)24道微量DNA提取工作站（寧波博坤生物科技有限公司），4N6FLOQSwabs植絨拭子（意大利Copan公司），汰可分專業(yè)清洗中和劑（北京瑞德邁普技術(shù)開發(fā)有限公司），84消毒液（江蘇愛特福84股份有限公司），Quantifiler?Trio DNA定量試劑盒、VerifilerPlus擴(kuò)增試劑盒、QuantStudio5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Veriti PCR擴(kuò)增儀以及ABI 3500XL型遺傳分析儀（美國(guó)ThermoFisher公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣本制備及分組

1）重度污染模擬組：用潔凈棉簽蘸取新鮮抗凝人血，均勻涂抹于20把潔凈剪刀的2片刀刃內(nèi)側(cè)面，將刀刃分開，懸掛于剪刀架上，室溫放置7 d后均分成A、B兩組。A組用Q1型清洗消毒機(jī)采用標(biāo)準(zhǔn)程序清洗；B組先用1∶100的84消毒液浸泡1 h，再用Q1型清洗消毒機(jī)采用相同的程序清洗，其中9把刀刃完全打開浸泡，1把刀刃因意外未完全打開浸泡。

2）輕度污染模擬組：取潔凈剪刀30把，每把剪刀分別剪取血紗布，將刀刃分開，懸掛于剪刀架上，均分成C、D、E三組。C組用裝有去離子水的噴壺噴洗刀刃；D組用酒精棉擦拭刀刃；E組未清洗。

1.2.2 DNA提取

用植絨拭子擦拭A～E組所有剪刀的刀刃，使用（博坤）全自動(dòng)24道微量DNA提取工作站參照使用說明書提取所有拭子DNA，洗脫體積為35 μL。

1.2.3 DNA定量

采用Quantifiler?Trio DNA定量試劑盒在QuantStudio5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行DNA定量，擴(kuò)增體系20 μL，其中模板 DNA 為 2 μL。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及電泳

采用VerifilerPlus試劑盒在Veriti基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系10 μL，樣本模板量7 μL，循環(huán)數(shù)29。所有PCR產(chǎn)物均以3500XL基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，所得數(shù)據(jù)采用GeneMapper ID-X v1.5軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 定量結(jié)果

2.1.1 重度污染模擬組結(jié)果

A組樣本的定量均值為1.015 7 ng/μL，最大值1.448 ng/μL，最小值 0.448 ng/μL，標(biāo)準(zhǔn)差 SD 值為0.389 8。B組樣本的定量均值遠(yuǎn)低于A組，除1把刀刃未完全打開的剪刀樣本（定量值為0.356 ng/μL）外，其余9份樣本中有1份樣本的定量值為0.001 ng/μL，另外8份樣本均未得到定量數(shù)據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)差SD值為0.000 3（未統(tǒng)計(jì)刀刃未完全打開樣本）。

2.1.2 輕度污染模擬組結(jié)果

C組樣本的定量均值為0.007 8 ng/μL，最大值0.022 ng/μL，最小值 0.001 ng/μL，標(biāo)準(zhǔn)差 SD 值為0.005 8。D組樣本的定量均值為0.001 4 ng/μL，最大值 0.002 ng/μL，最小值 0.000 ng/μL，標(biāo)準(zhǔn)差 SD值為0.000 7。E組樣本的定量均值為0.018 6 ng/μL，最大值0.048 ng/μL，最小值0.002 ng/μL，標(biāo)準(zhǔn)差SD值為0.015 6。

2.2 STR分型結(jié)果

參考行標(biāo)GA/T 1163-2014《人類DNA熒光標(biāo)記STR分型結(jié)果的分析及應(yīng)用》，分型結(jié)果應(yīng)樣本圖譜清晰，峰高大于100 RFU；行標(biāo)GB/T 37226-2018《法庭科學(xué)人類熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑質(zhì)量基本要求》，等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物及內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)判別規(guī)則要求每個(gè)等位基因分型的峰高均需大于200 RFU。因二次轉(zhuǎn)移造成的污染DNA含量一般是比較少的，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)儀器試劑靈敏度等多方面綜合考慮，故在本文中筆者將STR分型結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)定義為3類：

1）完整STR分型，所有基因座RFU值≥150，且未出現(xiàn)等位基因缺失。

2）未檢出STR分型，所有基因座的平均RFU值≤150，絕大部分基因座出現(xiàn)等位基因缺失（如圖1，該樣本定量值為0.001 ng/μL）。

3）不完整STR分型，所有基因座的平均RFU值≥150，有個(gè)別基因座出現(xiàn)等位基因缺失（如圖2，該樣本定量值為0.008 ng/μL）。

重度污染模擬組中A組所有樣本均獲得完整STR分型。B組中刀刃未完全打開浸泡的樣本獲得完整STR分型，其余9例刀刃打開接受84消毒液浸泡的樣本均未檢出STR分型。

輕度污染模擬組中C組2例獲得完整STR分型，8例獲得不完整STR分型。D組8例未檢出STR分型，2例獲得不完整STR分型。E組9例獲得完整STR分型，1例獲得不完整STR分型。

3 討論

剪刀上殘存的生物細(xì)胞的消殺手段可分為物理和化學(xué)兩類。有學(xué)者認(rèn)為環(huán)氧乙烷能通過化學(xué)反應(yīng)使DNA分子中的氨基和羥基發(fā)生烷基化，其產(chǎn)物能阻礙PCR擴(kuò)增，從而可有效阻止人源性DNA污染[6-7]。此種方法消殺效果可觀，但是處理時(shí)間長(zhǎng)且環(huán)氧乙烷等化學(xué)物質(zhì)具有一定毒性，對(duì)環(huán)境要求高，并不適用于大部分DNA實(shí)驗(yàn)室。利用高能量的UV類電磁輻射消殺會(huì)引起嘧啶二聚體等DNA損傷甚至DNA分子鏈的斷裂[8]；利用高能γ射線等電離輻射[9]消殺則是經(jīng)產(chǎn)生的游離自由基，進(jìn)攻DNA分子而引起DNA分子鏈的斷裂。利用射線消殺的方法雖操作簡(jiǎn)便但要將片段“切割”至小于STR試劑盒檢測(cè)閾值，其所需能量和時(shí)間難以估測(cè)。傳統(tǒng)的物理消殺方式分為機(jī)器和/或人工洗滌，人工洗滌效果好但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此大部分實(shí)驗(yàn)室采用機(jī)洗，機(jī)洗消殺效果是否會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染尚無定論。

本文中重度污染模擬組中A組10把剪刀刀刃上均檢出了完整DNA分型。這一結(jié)果表明對(duì)于重度污染的剪刀，僅使用消毒清洗機(jī)清洗并不足以清除剪刀上遺留的DNA。分析其原因可能與消毒清洗機(jī)的工作原理有關(guān)。消毒清洗機(jī)大部分采用高壓動(dòng)態(tài)噴淋的方式，在相應(yīng)洗滌消毒劑的作用下對(duì)器械進(jìn)行沖洗，該洗滌消毒劑不具有破壞DNA鏈的作用[10]，且沖洗過程中沖洗液與剪刀也未能長(zhǎng)時(shí)間充分接觸。B組10把剪刀中只有1把其刀刃因意外未完全打開導(dǎo)致有完整的STR分型檢出，其余9把基本未殘留人源DNA，此種方法處理后的剪刀符合微量物證檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。其原因一方面可能因?yàn)?4消毒液的主要成分是次氯酸鈉，次氯酸鈉遇水稀釋后會(huì)電離生成次氯酸根（CLO-），水解生成次氯酸，進(jìn)一步分解就生成新生態(tài)氧[O]，這些產(chǎn)物都有極強(qiáng)的氧化性，不僅會(huì)造成DNA分子自身的氧化損傷，而且使細(xì)胞的各種膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)變性，滲透壓發(fā)生改變。另一方面剪刀刀刃上殘留的人源性DNA由于長(zhǎng)時(shí)間的浸泡與刀刃的結(jié)合變得松散，易被清洗機(jī)徹底從刀刃上沖洗掉。刀刃未完全打開的剪刀在本實(shí)驗(yàn)中屬意外情況，概因刀刃未能與含有84消毒液的液體充分接觸，導(dǎo)致消毒失敗。此結(jié)果雖然由于樣本量過少不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但卻具備一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

輕度污染模擬組中，E組有9把剪刀檢出了完整分型，此結(jié)果表明重復(fù)使用未經(jīng)清洗的剪刀存在檢材間二次轉(zhuǎn)移污染的風(fēng)險(xiǎn)。D組利用酒精棉擦拭與C組利用去離子水沖洗使用過的剪刀都不能較徹底清除剪刀刀刃上殘留的DNA。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，重復(fù)使用剪刀必然存在污染風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，法醫(yī)DNA實(shí)驗(yàn)室中使用最多的剪刀、鑷子等實(shí)驗(yàn)器械，使用稀釋后的84消毒液浸泡加清洗機(jī)清洗可有效去除刀刃上殘留的DNA，從而達(dá)到較為徹底的消殺效果。在浸泡過程中要特別留心注意剪刀刀刃應(yīng)呈充分打開狀態(tài)。此外，在生物檢材樣本剪取過程中要杜絕剪刀的重復(fù)使用，因?yàn)槎无D(zhuǎn)移污染的DNA雖量微，但在檢案中若檢出了即便不完整的分型其也提示污染很可能已發(fā)生了。