大蔥AfUFGT2 基因的克隆及干旱脅迫下的表達分析

張宇辰 ，徐歡歡 ，王永勤

（1.北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，北京 100097；2.長江大學 園藝學院，湖北 荊州 434025）

植物遭受各種非生物脅迫時會積累大量活性氧，從而會導致酶抑制、DNA 損傷，甚至會造成植物細胞死亡[1-2]。黃酮類化合物是植物中主要的次生代謝物，在植物細胞清除活性氧中起到重要作用[3-4]。前人研究表明，黃酮類化合物在植物細胞抵抗非生物脅迫中起到重要作用[5-6]，干旱脅迫下小麥和棗樹的關(guān)鍵類黃酮基因的表達水平顯著上調(diào)，同時類黃酮化合物含量也顯著增加[7-8]。在擬南芥中過表達AtMYB12能夠?qū)е骂慄S酮積累，從而提高植物的抗旱性[9-11]。此前的研究已經(jīng)表明，隨著類黃酮的積累，植物對干旱脅迫的耐受性也不斷增強[12-14]。研究還表明，具有強清除活性氧的黃酮類化合物有助于減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，防止植物組織因干旱脅迫而失水[14-16]。

糖基化修飾是黃酮類化合物生物合成途徑中的最后一步，同時黃酮和花青素的穩(wěn)定性和生物活性是通過調(diào)節(jié)黃酮糖基化來控制的[17]。到目前為止，擬南芥中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因已經(jīng)得到了充分的研究[18]。擬南芥中至少有8 種UDP基因被鑒定，盡管這些UDPs基因都編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，但在擬南芥中的功能存在著顯著差異[19-21]。例如，AtUGT78D1特異以UDP 鼠李糖作為糖供體，而AtUGT78D3只能接收對羥基苯甲酸二酯，而不是UDP 葡 萄 糖[19-21]。此 外，作 用 于UGT78D1 和UGT78D2 下游的UGT89C1 參與黃酮醇的二次糖基化。這些研究表明，UGT 與黃酮類化合物的糖基化密切相關(guān)[20]。然而，有關(guān)參與大蔥（Allium fistulosumL.）中類黃酮糖基化修飾的基因鮮有報道。

本研究從大蔥中分離編碼類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶的基因AfUFGT2，并利用生物信息學對該基因的結(jié)構(gòu)、編碼蛋白的理化性質(zhì)進行預(yù)測分析；同時對大蔥進行干旱脅迫處理，利用干旱脅迫處理后的植物與對照組AfUFGT2基因的差異表達，預(yù)測大蔥類黃酮化合物合成調(diào)控研究，旨在為深入研究類黃酮糖基化修飾的分子機制奠定基礎(chǔ)，也為大蔥抗旱品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究中心鞭桿大蔥作為試驗材料。

1.2 大蔥總RNA 的提取和cDNA 合成

總RNA 的提取步驟參照RNAiso Plus（諾唯贊，中國）說明書，提取大蔥的總RNA，稀釋成相同濃度后按照cDNA Amplification（諾唯贊，中國）試劑盒說明書步驟反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，作為實時熒光定量PCR 的模板。

1.3 大蔥UFGT 基因的克隆

根據(jù)大蔥RNA-seq 數(shù)據(jù)庫（NCBI 登錄號：PRJNA827977.）獲 得AfUFGT2基 因 序 列，利 用Primer 6.0 軟件設(shè)計引物（表1）擴增AfUFGT2的編碼區(qū)序列。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

PCR 反應(yīng)體系為樣品cDNA 1 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、2×TransStart?FastPfu Fly PCR Mix10 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR 擴增程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共設(shè)置35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，使用pEASY-Blune-Zero 載體將經(jīng)過純化回收后的電泳產(chǎn)物連接，篩選陽性克隆后送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。通過NCBI 對測序得到的AfUFGT2基因編碼區(qū)序列進行比對。

1.4 AfUFGT2 基因的生物信息學分析

使用Blast p（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）將AfUFGT2基因進行序列結(jié)果分析，使用在線分析工具（https://www.expasy.org/）對AfUFGT2基因編碼蛋白質(zhì)進行特性預(yù)測分析；使用PSORT（https://wolf psort.hgc.jp/）預(yù)測AfUFGT2基因編碼蛋白的亞細胞定位；使用DNAMAN 8.0 進行AfUFGT2基因序列的同源性分析；使用MEGA 6.0 軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建；使用在線分析工具ExPASy 對AfUFGT2基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析；使用在線分析工具SWISS-MODEL對其三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析并建立同源模型。

1.5 干旱脅迫下的AfUFGT2 基因差異表達分析

選取花蕾期前長勢一致且無病蟲害的30 株大蔥移栽至日光溫室中培養(yǎng)，處理前進行15 d 的預(yù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為白天30 ℃，夜晚18 ℃，每天定時進行人工澆水。把試驗材料分為對照組與干旱組，每組15 株，每5 株作為一個生物學重復(fù)。對照組與干旱組均在同一環(huán)境下，維持正常的光照以及通風條件，其中干旱組通過停止人工澆水來進行自然消耗，對照組正常進行人工澆水，處理10 d 完成干旱脅迫處理。干旱脅迫處理完成后，分別取假莖和葉放入液氮速凍，提取RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

以大蔥AfTUBA作為內(nèi)參基因[22]，按照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊，中國）說明書步驟在LightCycler480 熒光定量PCR儀（Bio-Rad 公司，美國）上完成反應(yīng)，實時熒光定量PCR 總反應(yīng)體系為：10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL、TaqPro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、cDNA 模板1 μL 和ddH2O 7.4 μL。反應(yīng)條件為95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃50 s，共40 個循環(huán)。用2-ΔΔCt計算AfUFGT2基因相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蔥AfUFGT2 基因的克隆與序列分析

以從大蔥葉片中取得的cDNA為模板，通過PCR擴增并進行亞克隆后測序，結(jié)果顯示，AfUFGT2基因完整的開放閱讀框長度為1 353 bp，編碼450 個氨基酸（圖1），與數(shù)據(jù)庫序列對比一致。

圖1 大蔥AfUFGT2 基因序列與氨基酸序列Fig.1 AfUFGT2 gene sequence and amino acid sequence of Welsh onion

2.2 大蔥AfUFGT2 基因的生物信息學分析

使用ProtParam 對AfUFGT2的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示，大蔥AfUFGT2基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C2159H3399N579O631S16,分子質(zhì)量為48.08 ku，理論等電點pI 為6.01，不穩(wěn)定指數(shù)為29.03。AfUFGT2編碼蛋白含有48 個帶負電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）和41 個帶正電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu），表明AfUFGT2 蛋白穩(wěn)定性較高。

使用DNAMAN 對大蔥AfUFGT2基因編碼蛋白進行親疏水分析，結(jié)果顯示，大部分肽鏈為負值，推斷其為親水蛋白（圖2-A），其中第14 位疏水性最強，預(yù)測值為2.156；親水性最強的位點為第156 位，預(yù)測值為-2.656。采用NetPhos 對大蔥AfUFGT2基因編碼蛋白進行磷酸化分析，結(jié)果表明，其含有7 個Thr 磷 酸 化位點、1 個Tyr 磷酸化位點 和29 個Ser 位 點（圖2-B）。使用Concserved Domain Search 分析AfUFGT2編碼蛋白的蛋白家族歸屬，結(jié)果表明，其屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GTB 型蛋白質(zhì)超家族（圖2-C）。

使用PSORT 對AfUFGT2的亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其對應(yīng)的編碼蛋白位于細胞質(zhì)中。通過SignalP 3.1 和TMHMM 2.0 在線軟件對其進行跨膜區(qū)域和信號肽預(yù)測分析，結(jié)果顯示，AfUFGT2編碼蛋白沒有跨膜區(qū)域和信號肽。采用SOPMA 軟件對AfUFGT2基因編碼蛋白進行二級結(jié)構(gòu)構(gòu)建，結(jié)果顯示，AfUFGT2基因的二級結(jié)構(gòu)主要由不規(guī)則卷曲（40.87%）、α-螺旋（36.78%）、β-轉(zhuǎn)角（4.09%）和延伸鏈構(gòu)成（圖2-D）。三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，AfUFGT2基因編碼蛋白含有3 個正對的β/α/β類Rossmann 折疊區(qū)域（圖2-E）。

圖2 AfUFGT2 基因的生物信息學分析Fig.2 Bioinformatic analysis of AfUFGT2 gene

AfUFGT2 的氨基酸序列與洋蔥（AGN33443）、擬南芥（NP_197207）、矮牽牛（BAA89008）、紫蘇（BAA19659）、秦 艽 三 花（Q96493）、九 眼 獨 活（BAD06514）和三枝九葉草（AID50188）進行多重序列比較結(jié)果顯示，大蔥AfUFGT2 氨基酸序列與這些植物的UFGT 蛋白質(zhì)序列較為相似，保守性數(shù)值都較低且具有完整的糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；AfUFGT2 蛋白序列含有PSPG 結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域的第22、23、44 位氨基酸分別為色氨酸、天冬酰胺和組氨酸（圖3）。

圖3 大蔥AfUFGT2 基因序列的多重對比Fig.3 Multiple comparison of AfUFGT2 gene sequences in Welsh onion

進化分析結(jié)果表明（圖4），UFGT 同源基因編碼蛋白所構(gòu)建的進化關(guān)系分成兩大分支，其中，大 蔥AfUFGT2與水稻（XP_015635040）、青稞（KAE8797650）等植物所屬類黃酮7-O-糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列親緣關(guān)系相對較遠，與洋蔥AcUFGT1 親緣關(guān)系最近，說明AfUFGT2 屬于類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶，參與大蔥黃酮類化合物3-O 位置糖基化修飾。

圖4 AfUFGT2 與其他植物UFGT 蛋白的系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AfUFGT2 and other plant UFGT proteins

2.3 大蔥AfUFGT2 基因在干旱脅迫下的表達分析

為了了解AfUFGT2基因在干旱脅迫下的表達情況，使用大蔥AfTUBA作內(nèi)參基因，通過qRT-PCR 對大蔥葉片與假莖中AfUFGT2基因的表達進行分析，結(jié)果顯示（圖5），AfUFGT2基因具有明顯的表達特異性，在葉片中的表達高于假莖，在干旱脅迫下大蔥的葉片與假莖中AfUFGT2的表達均顯著高于對照（P<0.05），表明干旱脅迫能夠誘導AfUFGT2基因的表達。

圖5 大蔥AfUFGT2 基因特異性表達分析Fig.5 Analysis of specific expression of AfUFGT2 gene in Welsh onion

3 結(jié)論與討論

近年來，類黃酮化合物的生理功能受到了廣泛的關(guān)注，這需要大量的UGTs 來修飾類黃酮分子使其發(fā)揮作用[23]。盡管這些UGTs 在擬南芥中得到一些研究，但仍有眾多生物學作用等待分析。之前的研究發(fā)現(xiàn)，大蔥中的類黃酮化合物含量較高[23]，因此大蔥中的UGTs 對類黃酮含量的調(diào)控研究意義重大。次生代謝物——黃酮類化合物在植物抵抗非生物脅迫中起到重要作用，糖基化修飾是黃酮類化合物代謝過程中的重要步驟。糖基轉(zhuǎn)移酶在植物正常生長過程中起到了重要的作用[24-26]。目前，對糖基轉(zhuǎn)移酶的研究主要針對植物的脅迫應(yīng)答。蘋果MdZOG1、大豆GmA02G03420和甜菜BvUGT90A1均受到干旱脅迫的誘導，在干旱條件下顯著上調(diào)[27-30]。在玉米的研究中，UFGT2 突變體更容易受到環(huán)境脅迫帶來的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達隨著ZmUFGT2表達量的增加其對干旱和鹽脅迫的耐受性也在不斷增強[17]。在青稞的研究中，一個糖基轉(zhuǎn)移酶基因HVUL7H11410被鑒定為具有廣譜葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并介導黃酮糖基化增強抗旱性[30]。有研究表明，PSPG 結(jié)構(gòu)域與酶蛋白的底物識別有關(guān)[31-33]。這些研究都表明，糖基轉(zhuǎn)移酶在植物抵抗干旱脅迫具有重要的作用，能夠通過上調(diào)表達，積累類黃酮化合物等生物活性物質(zhì)，從而緩解干旱脅迫帶來的負面影響。本研究通過大蔥AfUFGT2基因的克隆、生物信息學及實時熒光定量PCR 分析，結(jié)果表明，AfUFGT2蛋白序列含有PSPG 結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域的第22、23、44 位氨基酸分別為色氨酸、天冬酰胺和組氨酸，推測AfUFGT2 以UDP-葡萄糖為主要糖基供體，且具有葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性。干旱脅迫后AfUFGT2基因的表達量明顯增多，推測可能是因為大蔥為應(yīng)對干旱脅迫而大量表達AfUFGT2基因，促進黃酮類化合物的3-O-糖基化修飾，從而增加類黃酮基因的表達水平，緩解干旱脅迫。

本研究從大蔥葉片中克隆AfUFGT2基因，生物信息分析表明，AfUFGT2基因編碼一個酸性的親水蛋白，屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GTB 型蛋白質(zhì)超家族；進化分析表明，AfUFGT2 與洋蔥AcUFGT1 親緣關(guān)系最近，屬于類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶，參與大蔥黃酮類化合物3-O 位置糖基化修飾。差異表達分析顯示，干旱脅迫下大蔥會通過大量表達AfUFGT2基因來促進類黃酮化合物的生物合成，進而增強植株抵御干旱的能力。這可能是大蔥應(yīng)對干旱不利環(huán)境的一種保護機制。研究結(jié)果為深入探究大蔥AfUFGT2基因的生物學功能及抗旱作用機制提供了參考。