基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的靈芝作用機制研究

徐靖 ,趙建霞 ,張國亮,4 ,王瑛 ,鄭化先 ,李明焱,4 ,李振皓,3?

(1.浙江壽仙谷醫(yī)藥股份有限公司,浙江 武義 321200;2.浙江壽仙谷植物藥研究院有限公司,浙江 杭州 310000;3.浙江省珍稀植物藥工程技術(shù)研究中心,浙江 武義 321200;4.壽仙谷珍稀藥材產(chǎn)品省級重點農(nóng)業(yè)企業(yè)研究院,浙江 武義 321200)

靈芝為多孔菌科真菌赤芝(Ganodermalucidum)或紫芝 (Ganodermasinense) 的干燥子實體,具有補氣安神、止咳平喘等功效[1]?，F(xiàn)代研究表明,靈芝具有良好的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖等生物活性[2-3],應(yīng)用前景廣闊。靈芝是天然真菌藥物的重要來源,目前從靈芝屬中分離鑒定出600 多種化合物,包括三萜、多糖、甾醇、生物堿、核苷酸、類固醇等類別。其中,多糖和三萜類被認(rèn)為是靈芝的主要活性成分[4]。通常認(rèn)為,靈芝多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用,能增強淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能[5-6],也可通過細(xì)胞毒性和抗血管生成特性抑制腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。三萜是靈芝主要的小分子活性成分,從靈芝屬中分離出的三萜類化合物已有300 多種[4]。研究表明,三萜類化合物不僅具有免疫調(diào)節(jié)活性[8],而且對不同階段腫瘤均有明顯抑制作用,其抗腫瘤機制包括阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬,以及抑制轉(zhuǎn)移和血管生成等[9]。目前已有較多靈芝藥效學(xué)及作用機制的相關(guān)研究,但許多研究以靈芝提取物或單體化合物為載體,不能較好地體現(xiàn)靈芝多成分-多靶點-多通路的作用特點,以及化合物間、作用途徑間的協(xié)同作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理念于2007 年由Hopkins 等[10]提出,該理念以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ),融合了藥理學(xué)、信息網(wǎng)絡(luò)學(xué)和計算機科學(xué),從藥物和疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā),通過虛擬篩選潛在藥效物質(zhì)、作用靶點及通路等,預(yù)測藥物的作用機制,并結(jié)合體內(nèi)體外研究,對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗證,其研究的整體性與中藥 “多成分-多靶點-多途徑” 的特點吻合,已被廣泛用于中藥活性成分的靶點預(yù)測及中藥作用機制的研究[11-12]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測靈芝中化合物的相應(yīng)靶點,預(yù)測核心靶點的作用疾病及途徑,構(gòu)建靈芝 “化合物-靶點-疾病-通路” 的多層次相互作用網(wǎng)絡(luò),并通過文獻(xiàn)進(jìn)行初步驗證,從系統(tǒng)和整體層面研究靈芝主要活性成分的作用機制,旨在為深入開展靈芝藥理藥效研究和產(chǎn)品開發(fā)提供潛在的方向。

1 材料與方法

1.1 靈芝化學(xué)成分選擇

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫[13],檢索到靈芝中的242個化合物,主要為小分子萜類及甾醇等,進(jìn)一步篩選口服利用度 (OB) ≥30%、類藥性 (DL) ≥0.14 的作為潛在優(yōu)效化合物。此外,在前期研究中,本團(tuán)隊通過高分辨質(zhì)譜、一標(biāo)多測等方法對靈芝的主要化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析,發(fā)現(xiàn)靈芝酸A 等17 個化合物的含量較高[8],再結(jié)合上述優(yōu)效化合物 (43 個),以這60 個化合物作為本試驗的研究對象。

1.2 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

首先通 過 TCMSP、TCMIP[14]、Swiss Target Prediction[15]、SuperPred[16]等數(shù)據(jù)庫預(yù)測化合物的潛在靶點。其中,從Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫篩選可能性>0.5 的靶點,從Target Hunter 數(shù)據(jù)庫篩選與待測化合物相似度>0.8 的化合物,將TCMSP 和TCMIP 的靶點直接并入,將化合物與靶點數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Cytoscape3.6.0 軟件[17]進(jìn)行化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,并進(jìn)行可視化分析。

1.3 核心蛋白互作 (PPI) 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將預(yù)測到的靶點導(dǎo)入STRING 網(wǎng)站,限定物種選擇 “Homo sapiens”,將Combined score≥0.9 的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件,構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),通過Cytoscape 軟件中工具欄中 “Analysis Network”功能對整個PPI 網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行計算,以度的2 倍中位數(shù)、緊密度和介數(shù)的中位數(shù)為卡值,篩選核心靶點,并在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖查看核心靶點與其他靶點的相互作用關(guān)系。

1.4 通過核心靶點預(yù)測疾病

將候選靶點導(dǎo)入Enrichr 數(shù)據(jù)庫[18],預(yù)測其對應(yīng)的OMIM、DisGeNET 疾病。

1.5 核心靶點生物學(xué)功能富集分析

使用Cytoscape 的ClueGo[19]模塊對核心靶點進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析,設(shè)定物種為 “Homosapiens”。GO 功能富集分析包括生物過程、分子功能、細(xì)胞組分、細(xì)胞免疫過程等四部分,限定只展示P<0.01 的 GO 分析結(jié)果;KEGG 通路富集分析只展示P<0.05 的KEGG 富集結(jié)果。

1.6 化合物-核心靶點-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)

為闡明靈芝化合物與核心靶點、疾病、通路間的相互作用關(guān)系,通過 Cytoscape 軟件中的“merge” 功能,將化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)、核心靶點-疾病 (選取前20 種疾病)、核心靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整合,建立化合物-核心靶點-疾病-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物選擇

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共收集到242 種化合物,經(jīng)篩選得到43 種優(yōu)效化合物,以及含量較高的17種化合物,共得到60 個化合物作為本研究的候選化合物 (表1)。

表1 靈芝候選化合物

表1(續(xù))

2.2 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

通過TCMSP、TCMIP、Swiss Target Prediction、Super Pred 數(shù)據(jù)庫,從60 個化合物中共預(yù)測到289個靶點,靈芝 “化合物-靶點” 網(wǎng)絡(luò)圖 (圖1) 顯示,有349 個節(jié)點、1 388 個邊。三角形節(jié)點表示化合物,圓形節(jié)點表示靶點,每條邊表示化合物與靶點的相互作用關(guān)系,形狀的大小與度值成正比,線條的粗細(xì)與介數(shù)成正比。每個化合物對應(yīng)的平均靶點為23.5 個,每個靶點平均與4.8 個化合物發(fā)生相互作用,初步說明靈芝也具有多成分、多靶點的作用特點。

圖1 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 核心靶點互作網(wǎng)絡(luò) (PPI) 構(gòu)建

表2 列出了度值最高的化合物及靶點節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)。其中,ACHE 和BCHE 靶點的主要功能為神經(jīng)調(diào)節(jié),且與其連接的化合物均超過30 個,提示這些化合物可能通過靶點ACHE 或BCHE 影響神經(jīng)調(diào)節(jié)作用;AR、NR3C1、NR3C2、ESR1 作為激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控特定基因的表達(dá),說明這些化合物可通過調(diào)節(jié)激素相關(guān)基因的表達(dá)而影響細(xì)胞的增殖和分化;TNF 可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死性細(xì)胞死亡,其效應(yīng)化合物有22 個,說明這些化合物可能具有較好的抗腫瘤活性。

表2 度值最高的化合物及靶點

在圖2 的核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖中,共有216 個節(jié)點、898 條邊,說明在預(yù)測到的289 個靶點中,共有216 個靶點能與其他靶點發(fā)生顯著的相互作用,六邊形代表符合核心靶點篩選標(biāo)準(zhǔn)的22 個核心靶點 (表3),圓形代表其他靶點,形狀的大小與度值成正比,線條的粗細(xì)與相關(guān)強度 (combinescore) 成正比。由圖2 可知,22 個核心靶點不僅與眾多靶點相連,且處于PPI 網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵位置,發(fā)揮了連接2 個模塊的橋梁作用,也表明靈芝中的化合物可通過調(diào)控這些核心靶點間接影響更多的靶點。

表3 PPI 的核心靶點及其拓?fù)鋮?shù)

圖2 核心靶點在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中的分布

2.4 通過核心靶點預(yù)測疾病

利用Enrichr 數(shù)據(jù)庫中的OMIM、DisGeNET 模塊,預(yù)測核心靶點相關(guān)疾病。表4 顯示,OMIM 預(yù)測疾病189 個,依據(jù)相關(guān)強度 (combined score)對top20 進(jìn)行排序,主要疾病為HIV (艾滋病)、pancreatic cancer (胰腺癌)、hepatocellular carcinoma(肝癌)、breast cancer (乳腺癌)、colorectal cancer(結(jié)直腸癌)、dystonia (肌張力障礙) 等,可見核心靶點相關(guān)疾病主要集中在癌癥和自身免疫性疾病。DisGeNET 模塊預(yù)測疾病2 588 個,依據(jù)相關(guān)強度排序?qū)op20 進(jìn)行排序,主要為alcohol or other drugs use (酗酒或使用其他藥物)、hemiballismus(單側(cè)抽搐)、intracortical osteosarcoma (皮層骨肉瘤)、asterixis (撲翼樣震顫)、ballismus (投 擲癥)、skin appendage adenoma (皮膚附屬器腺瘤),可見核心靶點相關(guān)疾病主要集中在藥物成癮性疾病和不自主運動疾病等。

表4 靈芝核心靶點相關(guān)的疾病 (top20)

2.5 核心靶點生物學(xué)功能富集分析

通過ClueGo 對核心靶點進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 富集結(jié)果如圖3 中A。選取P<0.01 的通路進(jìn)行作圖,圓形節(jié)點代表生物過程,圓形的顏色代表生物過程類別,邊則表示生物過程間的相互作用關(guān)系,粗細(xì)與Kappa Score 成正比,圓形的大小與P值成正比。各GO條目間存在相互作用關(guān)系,主要分為8 個類別。其中,G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路 (G protein-coupled receptor signaling pathway) 類別占比40.79%,細(xì)胞分泌的負(fù)調(diào)控類別 (negative regulation of secretion by cell) 占比21.05%,中性粒細(xì)胞清除類別 (neutrophil clearance) 占比19.74%,單羧酸轉(zhuǎn)運 (monocarboxylic acid transport) 類別占比10.53%,RNA 聚合酶Ⅱ?qū)ri-miRNA 轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控 (positive regulation of pri-miRNA transcription by RNA polymerase Ⅱ) 類別占比3.95%。

KEGG 通路富集分析結(jié)果如圖3 中B。選取P<0.05 的通路進(jìn)行作圖,共有15 個核心靶點成功富集,其主要參與了5 個代謝通路,包括神經(jīng)活動受體-配體相互作用通路 (neuroactive ligand-receptor interaction)、環(huán)磷酸鳥苷酸-環(huán)磷酸鳥苷酸依賴性蛋白激酶信號通路 (cGMP-PKGsignaling pathway)、雌激素 信號通 路 (estrogen signaling pathway)、甲狀腺激素信號通路 (thyroid hormone signaling pathway)、非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer)。

圖3 核心靶點富集分析結(jié)果網(wǎng)絡(luò)

2.6 化合物-核心靶點-疾病-生物功能網(wǎng)絡(luò)

圖4 顯示,度值最高的核心靶點有DRD2、STAT3、NR3C1、ADRA2A,其值分別為53、37、27、26。

圖4 化合物-核心靶點-疾病-信號通路網(wǎng)絡(luò)

4 個度值最大的核心靶點與相應(yīng)化合物、生物功能、疾病的相互作用關(guān)系見圖5。圖中顯示,靈芝化合物可能通過靶點DRD2、STAT3、NR3C1、ADRA2A,進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)的生物功能,從而改善對應(yīng)的疾病。DRD2 與2 個化合物、22 個生物功能、30 個疾病相連,提示靈芝中2 個化合物可能通過調(diào)控DRD2 及相應(yīng)的22 個生物功能對30 種疾病發(fā)揮作用;NR3C1 與22 個化合物、3 個生物功能、2個疾病相連,提示靈芝中22 個化合物可能通過調(diào)控NR3C1 及相應(yīng)的3 個生物功能,從而對2 種疾病發(fā)揮作用。

圖5 部分核心靶點-化合物-疾病-信號通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究了靈芝藥理作用機制,共選擇60 個靈芝化合物,預(yù)測到289 個靶點,通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出核心靶點共22 個,核心靶點涉及88 個GO 條目、5 個KEGG 通路及2 706 個疾病。本研究還以核心靶點為橋梁,建立了 “化合物-核心靶點-疾病-生物功能” 網(wǎng)絡(luò)圖,以期發(fā)現(xiàn)靈芝中活性成分的作用機制,為靈芝的藥效學(xué)研究以及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)與新思路。

在 “化合物-靶點” 網(wǎng)絡(luò)中,度值的大小代表目標(biāo)化合物 (靶點) 與其他靶點 (化合物) 發(fā)生相互作用的個數(shù),度值越大的化合物,表明其在人體中相應(yīng)的靶點越多,其藥效也就能更充分的發(fā)揮,具有潛在的研究價值。

Lucialdehyde C 是靈芝中的重要化合物,其潛在靶點有119 個。研究表明,Lucialdehyde C 對Lewis 肺癌細(xì)胞、人乳腺管癌細(xì)胞T-47D、腹水癌細(xì)胞S180、小鼠肉瘤細(xì)胞Meth-A 均有明顯的細(xì)胞毒性,ED50值分別為10.7、4.7、7.1 和3.8 μg·mL-1[20]。Lucidone A 潛在靶點有89 個,在最大無毒濃度 (MNTC) 范圍內(nèi),Lucidone A 能顯著抑制H2O2誘導(dǎo)的谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST) 水平升高[21],還可通過誘導(dǎo)組蛋白H3、MYT、DNMT3A 和DNMT3B 甲基化,延緩阿爾茲海默癥的發(fā)病進(jìn)程[22]。Lucidenic acid A具有顯著的抗氧化、抗炎和降血糖活性[23],還可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖,將細(xì)胞周期阻滯在G1期,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[24-25],其潛在靶點有84個。Ganoderenic acid D 對Hep G2、Hela 和Caco-2細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性,IC50值分別為 (0.14±0.01)、(0.18±0.02) 和 (0.26±0.03) mg·mL-1[26]。Ganodermanondiol (靈芝酮二醇) 為主要的三萜類化合物之一,可顯著抑制Lewis 肺癌細(xì)胞、人乳腺管癌細(xì)胞T-47D、腹水癌細(xì)胞S180、小鼠肉瘤細(xì)胞Meth-A 增殖[20],還可抑制Epstein-Barr病毒感染并預(yù)防鼻咽癌的形成[27]。Kim 等[28-29]發(fā)現(xiàn),Ganodermanondiol 通過抑制胞內(nèi)酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 (MITF)及MAPK/cAMP 信號通路的表達(dá),抑制黑色素瘤細(xì)胞B16F10 增殖。Min 等[30]發(fā)現(xiàn),Ganodermanondiol對經(jīng)典補體通路表現(xiàn)出較強的抗補體活性,這可能與靈芝加強機體體液免疫的活性有關(guān)[29]。Lucidumol A 對醛糖還原酶、葡萄糖苷酶有較好的抑制作用;beta-sitosterol、Ganoderic aldehyde A、ganoderal B 潛在靶點較多,但相關(guān)的藥效研究報道較少,可能與其在靈芝中含量較低、不易純化制備有關(guān),具體有待進(jìn)一步驗證。

核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖展現(xiàn)了靈芝靶點間的相互作用關(guān)系,其中依據(jù)度值、緊密度、介數(shù)3 個參數(shù)篩選出核心靶點 22 個,包 括 ANXA1、BDKRB2、NCOA1、RXRA、CCR5、JUN、TP53、CYP3A4、DRD2、ADRA2A、OPRM1、CCR2、GNAT3、ADRA2B、ADRA2C、CHRM2、NCOA2、NR3C1、STAT3、CYP2E1、MT-CO2、CHRM1。核心靶點與“化合物-靶點” 網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)鍵靶點僅存在1 個共同靶點NR3C1,說明最重要的靶點并不一定是效應(yīng)化合物最多的靶點,也有可能是在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的重要靶點,這些靶點可通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用。核心靶點相關(guān)的疾病主要集中在癌癥、自身免疫性疾病、藥物成癮性疾病、不自主運動疾病等方面。富集到的GO 條目較多,大致分為8 個類別。其中,G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路類別占比顯著高于其他類別,代表了人類基因組編碼的最豐富的受體家族,并且是許多藥物的靶標(biāo)[31],表明靈芝活性成分藥效的發(fā)揮與該通路類別密切相關(guān)。相應(yīng)KEGG 通路有5 個,其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路是細(xì)胞膜內(nèi)外信號通路相關(guān)受體和配體的結(jié)合體,其與9 個核心靶點相連,提示靈芝活性成分可通過該通路治療疾病。

由各化合物-靶點-疾病-生物功能網(wǎng)絡(luò)可知,DRD2、STAT3、NR3C1、ADRA2A 度值最 高,說明其在化合物-靶點-疾病-生物功能網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了重要作用。研究表明,DRD2 基因的變異與酒精及藥物依賴性、創(chuàng)傷后壓力心理障礙癥 (PTSD)、情感障礙、精神分裂癥相關(guān)的某些癥狀有關(guān)[32]。研究表明,靈芝可通過抑制STAT3 的易位而達(dá)到抗前列腺癌的作用[33]。Rios-Fuller 等[34]發(fā)現(xiàn),靈芝提取物通過抑制STAT3 信號傳導(dǎo)來降低三陰性乳腺癌的細(xì)胞活力,并顯著降低了乳腺癌模型小鼠腫瘤的體積和質(zhì)量。ZHAO 等[35]研究表明,NR3C1 為靈芝主要的效應(yīng)靶點,可能是評估靈芝提取物抗腫瘤功效的潛在標(biāo)志物。以上研究結(jié)果與DRD2、STAT3、NR3C1 靶點網(wǎng)絡(luò)圖展示結(jié)果一致,不僅展示了已有研究中靈芝相關(guān)靶點、疾病的關(guān)系,也提示了靈芝具體化合物與靶點、生物功能、疾病之間的聯(lián)系,以及靈芝中藥效物質(zhì)的作用靶點及通路,如靈芝 中化合 物 Lucialdehyde C、Ganoderic aldehyde A 通過DRD2 靶點及22 個相關(guān)生物功能對30 種疾病發(fā)揮作用,化合物ergosta-7,22Edien-3beta-ol、campesta-7,22E-dien-3beta-ol 通 過STAT3 靶點及11 個生物功能對22 種疾病發(fā)揮作用;靈芝中22 種化合物通過NR3C1 靶點及3 條生物功能對暴力傾向及乳腺癌發(fā)揮作用。靈芝化合物可能通過靶點DRD2、STAT3、NR3C1、ADRA2A,進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)的生物功能,從而改善對應(yīng)的疾病,這為靈芝藥效物質(zhì)及作用機制的進(jìn)一步研究提供參考和方向。

本研究結(jié)果充分說明了靈芝多成分、多靶點、多通路的作用特點,也揭示了化合物可能的作用疾病與途徑。上述結(jié)果的理論基礎(chǔ)為化合物對靶點預(yù)測、靶點對疾病與通路的預(yù)測,由于預(yù)測方法、原理、數(shù)據(jù)庫的差異,結(jié)果有待進(jìn)一步的實驗驗證。