高效液相色譜法測定柴辛注射液中有效組分含量的研究

林靈超, 金 遷，陳卿卿，杜 強

(浙江福立分析儀器股份有限公司，浙江臺州 317500)

柴辛注射液，主要處方組成為柴胡和細辛，具有解表退熱、祛風散寒、鎮(zhèn)痛抗炎的藥效，在馬、牛、羊、豬、犬等的感冒發(fā)熱的治療上被廣泛使用[1-2]。柴辛注射液的現(xiàn)行質量控制標準收載于《獸藥質量標準(2017年版，中藥卷)》[3]中，為基于校正因子-氣相色譜法對甲基丁香酚進行含量測定與控制，但易出現(xiàn)準確度低、峰型差、可操作性不強等缺點[4-5]。同時僅將甲基丁香酚作為柴胡的有效成分進行含量測定，忽略對細辛藥效成分的分析，造成無法全面而準確地對柴辛注射液的質量控制做出評價，最終可能會導致因臨床療效的差異而產生對柴辛注射液價值的錯誤判斷。

本文參考《中國藥典》2020年版第一部細辛[6]及相關文獻方法[7-14]，確定了以甲基丁香酚、細辛脂素為研究對象，建立了高效液相色譜法同時測定柴辛注射液中甲基丁香酚、細辛脂素含量的方法，為柴辛注射液產品質量的控制和質量標準的完善提供基礎數(shù)據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 主要試劑有：甲基丁香酚標準品(批號：111642-200301)，細辛脂素標準品(批號：111889-201705)，均購自于中國食品藥品檢定研究所；純乙腈，色譜純，購自于美國TEADIA；水，Millipore超純水。

主要儀器有：LC5090型高效液相色譜系統(tǒng)，配置為自動進樣器、輸液泵、柱溫箱、紫外檢測器等，購自于浙江福立分析儀器股份有限公司；SQP型電子天平，購自于賽多利斯(上海)貿易有限公司產品；色譜分析柱Coreshell C18，5 μm，150 mm×4.6 mmID，購自于日本ChromaNik Technologies。

柴辛注射液，10 mL(相當于原生藥30 g)，批號為20200502，山東德信生物科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制 分別精確稱取甲基丁香酚和辛脂素標準品適量，用純乙腈-純水(5∶5, v/v)溶解配制成濃度為150 μg/mL的標準儲備液。

臨用前，用純乙腈-純水(5∶5, v/v)稀釋成濃度為0.15、1.5、7.5、15、75、150 μg/mL的系列混合標準工作溶液。

1.3 供試品溶液配制 精密移取柴辛注射液供試品2 mL，置于50 mL容量瓶中，加純乙腈-純水(5∶5, v/v)稀釋至刻度，過濾待進樣。

1.4 高效液相色譜方法 色譜柱為Coreshell C18，5 μm，150 mm×4.6 mmID，流動相為純乙腈-純水(5∶5, v/v)，流量為1.0 mL/min，柱箱溫度為40 ℃，紫外檢測器檢測波長為287 nm，進樣量為5 μL。

2 結果與分析

2.1 專屬性試驗 依次注入混合標準溶液、供試品溶液及空白溶液。結果顯示，混合標準溶液中甲基丁香酚和細辛脂素的保留時間分別為5.41 min、8.92 min；供試品溶液中甲基丁香酚和細辛脂素與混合對照品色譜峰的保留時間保持一致，分離度分別為5.5、1.6，理論塔板數(shù)分別為18123、26644，拖尾因子均為1.10，同時經光譜掃描得到峰純度較高；空白溶液中，在甲基丁香酚和細辛脂素的保留時間位置均未見有雜質峰的干擾。

2.2 方法學試驗

2.2.1 方法標準曲線、檢測限和定量限 將上述系列混合標準工作溶液進樣，測定各組分的峰面積。以混合標準系列工作溶液的濃度為橫坐標(X)，不同濃度下所得峰面積為縱坐標(Y)，得甲基丁香酚、細辛脂素的擬合曲線分別為為Y=7243X-258，R2=0.9999；Y=18853X-676，R2=0.9999。結果表明在0.15～150 μg/mL質量濃度范圍之內，甲基丁香酚、細辛脂素的溶液濃度與峰面積線性關系良好。

按照3倍噪音計算檢測限，10倍噪音計算定量限，得到甲基丁香酚、細辛脂素的檢測限為0.025 μg/mL、0.012 μg/mL，定量限為0.083 μg/mL、0.040 μg/mL。

2.2.2 精密度試驗 取20200502號柴辛注射液適量，以純乙腈-純水(5∶5, v/v)稀釋并定容得到供試品溶液，連續(xù)進樣7次，記錄甲基丁香酚、細辛脂素的峰面積值。結果得到甲基丁香酚、細辛脂素峰面積RSD分別為0.15%、0.20%，表明分析方法精密度良好。

圖1 混合標準溶液(a)、供試品溶液(b)、空白溶液(c)

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取20200502號柴辛注射液適量，以純乙腈-純水(5∶5, v/v)稀釋并定容得到供試品溶液，分別在0、2、6、12、24、48 h各進行測定，記錄甲基丁香酚、細辛脂素的峰面積，其RSD分別為0.51%、0.42%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.4 加標回收率 取柴辛注射液適量，依次添加3個濃度水平的甲基丁香酚、細辛脂素混合標準溶液，后以純乙腈-純水稀釋定容。每個濃度水平平行測定3份，計算平均回收率。結果顯示，甲基丁香酚的平均回收率為97.47%～100.53%，RSD為0.92%～2.17%；細辛脂素的回收率為88.47%～92.23%，RSD為1.48%～3.55%，表明方法回收率良好。

2.2.5 樣品檢測 取平行配制的6份不同批次的柴辛注射液供試品溶液進樣，依據線性擬合曲線，計算含量。結果每1 mL供試品中甲基丁香酚、細辛脂素的平均含量為43.37 μg、1.21 μg，RSD分別為0.52%、1.65%。

3 討 論

目前對柴辛注射液中有效成分的檢測，主要為校正因子-氣相色譜法對甲基丁香酚進行含量測定，極易出現(xiàn)準確度低、峰型差、可操作性不強等缺點[3-6]，未見其他檢測方法的報道。本研究選擇甲基丁香酚、細辛脂素分別代表柴辛注射液的兩劑處方柴胡、細辛的有效物質，通過高效液相色譜法同時進行其含量測定，以全面評價柴辛注射液的質量。

研究對甲基丁香酚、細辛脂素在210～370 nm的波長范圍內進行波長掃描，雖然兩者在230 nm也有較大吸收峰，但根據主成分的含量最終確定檢測波長為287 nm。其次通過對比相同規(guī)格的Coreshell C18和其他全多孔型色譜柱，如Sunniest C18、Xtimate C18、Eclipse Plus C18、Wondasil C18等的效果，以保留時間、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)等參數(shù)做為評價指標，得到當使用Coreshell C18色譜柱時甲基丁香酚峰、細辛脂素的理論塔板數(shù)最高、分離度最大、最低檢出限最低、分析速度最短，因此確定Coreshell C18為本研究的色譜柱，此時分析方法具有更好的分離、更高的靈敏度和更快的分析速度的優(yōu)點，可以有效節(jié)省洗脫溶劑、降低分析成本。最后根據甲基丁香酚、細辛脂素的性質，分別對比了甲醇-純水、乙腈-純水等洗脫體系作流動相時的分離效果。使用純甲醇作有機溶劑時，隨著純甲醇的組成比例的增加，流動相洗脫強度增加，甲基丁香酚峰會與溶劑峰共洗脫，同時細辛脂素與雜質干擾物的分離度下降；當純甲醇的組成比例逐漸降低，溶劑峰拖尾會增大，將甲基丁香酚峰包覆在溶劑峰中；所以純甲醇-純水作洗脫體系時，無法實現(xiàn)甲基丁香酚、細辛脂素的有效分離和準確定量；當使用純乙腈作有機溶劑時，溶劑峰的峰寬明顯縮小。當純乙腈的組成比例小于50%時，細辛脂素的保留時間過長、甚至無法被洗脫；當純乙腈的組成比例大于50%時，流動相的洗脫強度較大，導致甲基丁香酚峰與溶劑峰共洗脫，細辛脂素與雜質干擾物的分離度下降，方法的定量準確度受到影響；只有在純乙腈的組成比例為50%時，甲基丁香酚與溶劑峰、細辛脂素與雜質干擾物的分離度均達到基線分離，且分析時間較短，兩者的峰形對稱。因此最終確定“純乙腈-純水(5∶5, v/v)”為研究的流動相。

研究建立了高效液相色譜方法同時測定柴辛注射液中甲基丁香酚、細辛脂素含量的方法，方法的準確度RSD小于1%、精密度RSD值小于0.3%，平均回收率在88%以上，被測樣品溶液放置48 h后含量RSD仍小于0.6%，準確度高、峰形佳、色譜方法簡單、操作性極強。上述表明本方法適應于檢測柴辛注射液中的有效組分的含量。

試驗已經對3～5家的柴辛注射液產品進行了分析檢測，但仍需收集更多的同類產品，用于擴大方法的適用范圍，以最優(yōu)化現(xiàn)有方法。

4 結 論

研究選擇甲基丁香酚、細辛脂素作為研究對象，建立了高效液相色譜法同時測定柴辛注射液中兩種有效成分的方法，方法操作簡單，準確性、精密度高，可以適用于其質量控制，可為后續(xù)標準的完善和產品療效的研究提供科學依據。