Cardiobacterium valvarum臨床分離株的生物學(xué)特性研究及16S rRNA鑒定

徐曉涵，孫銘艷，劉言霞，王 楠，陶元勇

心桿菌屬(Cardiobacterium)是兩端圓形，具有多形性的革蘭陰性桿菌，屬于HACEK(心桿菌屬、嗜血桿菌屬、艾肯菌屬、金桿菌屬、放線桿菌屬)組中的一員，作為人類正常的上呼吸道菌群，在其他粘膜表面少見[1-4]。正常情況下，該菌并不致病，但在免疫力低或者細(xì)菌定植部位發(fā)生改變時(shí)可能致病，其感染的危險(xiǎn)因素包括：牙列不良、牙周炎、感染性心內(nèi)膜炎(infective endocarditis，IE)、心臟解剖異常、內(nèi)窺鏡檢查、心臟植入電子設(shè)備和人工心臟瓣膜等[5-6]，感染的死亡率約為10%。

1962年，心桿菌屬首次報(bào)道在IE的病原菌中，該菌經(jīng)美國(guó)衛(wèi)生署傳染病中心鑒定命名為類巴斯德CDCgroup-Ⅱ-D桿菌[7]，1964年，Slotnick等[8]對(duì)該菌進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其生化特征不同于巴斯德桿菌、嗜血桿菌等菌，因而命名為人心桿菌(Cardiobacteriumhominis，C.hominis)。在2004年之前，C.hominis一直是心桿菌屬中的唯一物種，直到2004年，Han等人[9]從動(dòng)脈瘤破裂而導(dǎo)致心內(nèi)膜炎的病人中分離出一種不同于C.hominis的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為C.valvarum。該菌大部分情況下會(huì)導(dǎo)致心臟發(fā)生感染[3-4,10-11]，但偶爾也會(huì)造成關(guān)節(jié)、骨髓等的感染[12-13]。目前對(duì)于C.valvarum的臨床特點(diǎn)尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)C.hominis和C.valvarum的表型圖譜非常相似，利用其表型特征很難區(qū)分兩種細(xì)菌，而且該菌容易被誤診為多殺性巴氏桿菌[5]。雖然MALDI-TOF-MS鑒定該菌屬的成功病例已被報(bào)道過[14-15]，但目前認(rèn)為該方法只能提供推測(cè)的鑒定依據(jù)，不能作為決定性的鑒定依據(jù)，要想準(zhǔn)確鑒定C.valvarum，分子診斷的方法是必不可少的[16]，本文通過16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定，對(duì)疾病的診斷具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料 男，69歲，因2個(gè)月無明確原因的胸悶和憋氣，活動(dòng)后加劇，到本院就診。病人曾有“腦梗死”病史6月余，沒有留下后遺癥，病情好轉(zhuǎn)后出院。初次入院時(shí)體格檢查：體溫36.4 ℃，心率107次/min，脈搏18次/min，血壓120/75 mmHg，二尖瓣聽診區(qū)可聞及3/6雜音，心臟超聲：二尖瓣后葉脫垂并返流，多發(fā)贅生物，左房增大，嚴(yán)重的三尖瓣、肺動(dòng)脈瓣返流，提示IE。實(shí)驗(yàn)室輔助檢查：血沉101 mm/h，CRP 82 mg/g，血紅蛋白88 g/L，免疫球蛋白G 25.4 g/L，補(bǔ)體C 30.77 g/L。根據(jù)血培養(yǎng)和影像學(xué)檢查結(jié)果，診斷為IE、心臟瓣膜病、二尖瓣關(guān)閉不全(重度)、三尖瓣關(guān)閉不全(中-重度)、肺動(dòng)脈高壓等。入院后采血培養(yǎng),在BacT/AERT 3D120全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)中，需氧血培養(yǎng)瓶在孵育74～80 h后呈陽性。進(jìn)行手術(shù)后，病理報(bào)告顯示二尖瓣中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死，給與舒普深藥物抗感染治療。術(shù)后20 d，感染得到控制，停用舒普深藥物，給予三代頭孢藥物抗感染治療，術(shù)后23 d，復(fù)查炎性因子基本正常，改用頭孢他啶藥物繼續(xù)抗感染治療。自抗感染治療后血培養(yǎng)均為陰性，病人沒有發(fā)燒、干咳、呼吸困難、胸痛等病癥，病情穩(wěn)定。

1.2 主要儀器及試劑 法國(guó)梅里埃公司的VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀，美國(guó)Applied Biosystems公司的3730XL測(cè)序儀、2720 thermal cycler PCR 儀，北京六一儀器廠的DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩(wěn)壓電泳儀，上海復(fù)日科技儀器有限公司的FR980凝膠成像儀，上海生工生物工程有限公司的SK8255 Ezup 柱式細(xì)菌基因組 DNA 抽提試劑盒和SK8131 SanPrep柱式DNA 膠回收試劑盒等。

1.3 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 取病人報(bào)陽性的血培養(yǎng)標(biāo)本接種于哥倫比亞血平板，35 ℃培養(yǎng)74～96 h后觀察菌落形態(tài)。選取單個(gè)菌落涂片進(jìn)行革蘭染色后鏡檢；使用GN卡、VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀進(jìn)行鑒定，按照說明書進(jìn)行操作。采用E-test法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.4 生化反應(yīng) 上機(jī)鑒定該菌的生化反應(yīng)特征，并與已發(fā)表的C.valvarum進(jìn)行比較。

1.5 16S rRNA基因測(cè)序

1.5.1 細(xì)菌基因組DNA的提取 挑取哥倫比亞血平板上培養(yǎng)的單個(gè)菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，將細(xì)菌菌液過夜培養(yǎng)，第2 d取1 mL加入1.5 mL的離心管中，室溫8 000 r/min離心1 min，棄上清，收集菌體。按照SK8255 Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取。

1.5.2 細(xì)菌16S rRNA的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：0.5 μL模板(基因組DNA20～50 ng/μL),2.5 μL 10×Buffer(含Mg2+)，1 μL dNTP(各2.5 mmol/L)，0.2 μL TaqDNA聚合酶，細(xì)菌的16S rRNA基因擴(kuò)增采用兩個(gè)通用細(xì)菌引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖經(jīng)電泳進(jìn)行觀察(設(shè)置為150 V，100 mA，20 min)，在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定解析。

1.5.3 PCR產(chǎn)物回收及測(cè)序 從PCR產(chǎn)物電泳條帶上切割所需要DNA目的條帶，使用SK8131 SanPrep柱式DNA 膠回收試劑盒說明書上的提純方法進(jìn)行回收，所得產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌的鑒定及藥敏試驗(yàn) 35 ℃ 5% CO2條件下在哥倫比亞血平板培養(yǎng)96 h，見到大小為0.5 mm，圓形、凸起、光滑、不透明、灰色、弱α-溶血的菌落(圖1)。延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后，菌落大小幾乎也達(dá)不到1 mm。機(jī)器顯示unidentified Organism，上機(jī)鑒定未能鑒定該分離菌。取單個(gè)菌落涂片經(jīng)革蘭染色，鏡下可見到小、兩端圓形、革蘭氏陰性的多形性桿菌，有時(shí)呈簇狀排列，無鞭毛、無芽胞、無莢膜(圖2)。藥敏試驗(yàn)顯示，該分離菌對(duì)青霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南、左旋氧氟沙星均敏感。

圖1 培養(yǎng)96 h后菌落形態(tài)Fig.1 Bacterial colony after culturing for 96 h

圖2 分離菌鏡下形態(tài)(革蘭染色，10×100)Fig.2 Morphology of isolated strains under microscope(Gram staining，10×100)

2.2 分離菌的生化反應(yīng) 生化反應(yīng)結(jié)果如下：L-吡咯烷酮芳胺酶、L-阿拉伯醇、D-纖維二糖、β-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-丙氨酸芳胺酶pNA、脂肪酶、古老糖、D-塔格糖、D-海藻糖、丙二酸鹽、5-酮基-D-葡糖糖酸鹽、L-乳酸鹽堿化、α-葡糖苷酶、琥珀酸鹽堿化、β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、甘氨酸芳胺酶、賴氨酸脫羧酶、L-組氨酸同化、香豆酸、β-葡萄糖醛酸酶、L-蘋果酸鹽同化、L-乳酸鹽同化、檸檬酸鹽均為陰性，谷氨酰芳氨酶pNA、谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶為陽性。分離菌與已發(fā)表的C.valvarum部分生化反應(yīng)結(jié)果比較見表1。

表1 分離菌與已發(fā)表的C. valvarum部分生化反應(yīng)結(jié)果比較Tab.1 Comparison of partial biochemical reaction results between isolates strain and published by C. valvarum

2.3 16S rRNA基因測(cè)序分析 對(duì)分離菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，得到大小約為1 450 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，在NCBI的BLAST網(wǎng)站進(jìn)行測(cè)序分析后，發(fā)現(xiàn)該分離菌與已發(fā)表的C.valvarum菌株F0432(GenBank登錄號(hào)：HM596295.1)的16S rDNA的同源性為99.59%，選擇與之同源序列相似度高的菌株，使用MAGA 7.0.26軟件，準(zhǔn)備分離株、與分離株同源序列相似度高的菌株的序列文件(保存為fasta格式)。選擇Align DNA，彈出的窗口中設(shè)置比對(duì)參數(shù)(一般采用默認(rèn)參數(shù))，進(jìn)行多序列比對(duì)(保存為masx格式)。進(jìn)入MEGA 5主界面，點(diǎn)擊Phylogeny，選擇Construct/Test Neighbor-Joining Tree…彈出的對(duì)話框詢問：彈出建樹參數(shù)設(shè)置對(duì)話框，更改No. of Bootstrap Replications為1 000，其他參數(shù)默認(rèn)即可，構(gòu)建進(jìn)化樹，如圖3所示，鑒定為C.valvarum。

圖3 分離菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the isolated strain

3 討 論

近年來，C.valvarum引起的IE臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜，常常缺乏典型的癥狀，特別是老年患者，由于細(xì)菌C.valvarum生長(zhǎng)緩慢,潛伏周期較長(zhǎng)，因而會(huì)使病情逐步加劇,容易延誤診斷。C.valvarum的革蘭染色有時(shí)不均勻，是一種具有多形性的革蘭陰性桿菌，在血瓊脂平板上有輕微的α溶血[6]。研究發(fā)現(xiàn)，C.valvarum與C.hominis臨床表現(xiàn)不同可能與C.valvarum生長(zhǎng)緩慢有關(guān)[12]，C.valvarum培養(yǎng)3～4 d后才可見到小菌落(0.5 mm),在延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后也達(dá)不到1.0 mm。而C.hominis在96 h后菌落直徑可達(dá)2.2 mm。C.valvarum形態(tài)隨培養(yǎng)基的不同而變化，當(dāng)在血瓊脂平板上生長(zhǎng)時(shí)，它是一個(gè)相當(dāng)大的常規(guī)桿菌；在巧克力瓊脂平板上生長(zhǎng)時(shí)，則變成了短小的桿菌[9]。在生化反應(yīng)中，C.valvarum具有氧化酶的活性，可以發(fā)酵果糖、甘露糖和山梨醇，這些特點(diǎn)與C.hominis相似[18]。但C.valvarum可以產(chǎn)生細(xì)胞色素氧化酶，不產(chǎn)生過氧化氫酶，尿素水解、七葉苷水解和硝酸鹽還原試驗(yàn)為陰性，可以利用果糖、山梨糖醇和甘露糖，但不利用麥芽糖、蔗糖或甘露醇，從而區(qū)別于C.hominis[9,17,19-20]。然而，目前對(duì)這些特性的描述并沒有達(dá)成共識(shí)，不同的表型方法可能會(huì)給出不同的結(jié)果。

由于C.valvarum生長(zhǎng)緩慢、營(yíng)養(yǎng)要求較高，缺乏選擇性培養(yǎng)基，在普通的瓊脂平板上生長(zhǎng)不良，因而進(jìn)行藥敏試驗(yàn)比較困難[21]。據(jù)報(bào)道，C.valvarum對(duì)各種抗菌藥物都敏感[9,16-17,19,22-23]，但目前已有對(duì)磺胺甲惡唑/甲氧芐啶類藥物耐藥菌株的相關(guān)報(bào)道[20]，因而需要進(jìn)一步積累藥敏資料來驗(yàn)證相關(guān)藥敏試驗(yàn)。目前的數(shù)據(jù)表明心桿菌屬對(duì)常用的β-內(nèi)酰胺類藥物敏感，以前的病例大多使用β-內(nèi)酰胺類藥物治療，預(yù)后良好[17,24]。根據(jù)IE預(yù)防、診斷和治療指南(2009年版)[25]治療非-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生的HACEKIE的IE病例，靜脈注射氨芐青霉素/青霉素加慶大霉素4周是一種選擇。本例患者接受了舒普深藥物抗感染治療治療1周后，給予第三代頭孢菌素類藥物治療約3周，感染得到控制。

截止到目前為止，僅報(bào)道過為數(shù)不多的C.valvarum病例，由于該菌具有菌落形態(tài)、生化反應(yīng)的不典型、不易分離和培養(yǎng)等的特點(diǎn)，加上各型儀器的數(shù)據(jù)庫不完善，給該菌帶來的疾病診斷造成了一定的難度。本次實(shí)驗(yàn)的分離株不能通過VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀、MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定，這可能與病原菌的基因文庫不完善有關(guān)，提示可以通過完善細(xì)菌的基因文庫獲得更多的細(xì)菌鑒定方法。16S rRNA測(cè)序可以得到C.valvarum明確的診斷，但僅僅依靠該技術(shù)對(duì)稀有菌進(jìn)行鑒定是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因此，對(duì)于一些罕見菌的鑒定我們可以首先考慮16S rRNA測(cè)序的方法，同時(shí)聯(lián)合其他的分子診斷技術(shù)如多重PCR等方法對(duì)罕見菌進(jìn)行綜合分析，結(jié)合多種方法使罕見菌的鑒定更加精確可信，以便臨床醫(yī)生盡早對(duì)疾病做出準(zhǔn)確判斷。

利益沖突：無

引用本文格式：徐曉涵，孫銘艷，劉言霞，等.Cardiobacteriumvalvarum臨床分離株的生物學(xué)特性研究及16S rRNA鑒定[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：614-618. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.083