lncRNA LHX5-AS1通過(guò)靶向miR-532-5p調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制*

田希貴，首漢瓊，魏 鋼△，張 軍，杜 超，王安銀

1.重慶市梁平區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，重慶 405200；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶 400038

胃癌是一種危害人類消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，胃癌的高復(fù)發(fā)率和病死率嚴(yán)重危害人類生命健康[1]。針對(duì)癌癥的分子靶向治療具有特異性高、不良反應(yīng)小的特點(diǎn)[2]，尋找新的分子靶點(diǎn)對(duì)改善胃癌患者的預(yù)后具有重要臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種非編碼的單鏈RNA分子，其表現(xiàn)為抑癌基因或癌基因的功能，調(diào)控癌癥細(xì)胞的增殖和遷移行為[3-5]。LHX5-AS1是一種新型lncRNA，由522個(gè)核苷酸組成，其在癌癥細(xì)胞中的表達(dá)和機(jī)制并不清楚。lncRNA主要通過(guò)結(jié)合微小RNA(miRNA)，降低miRNA的表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為[6-7]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)LHX5-AS1可能靶向結(jié)合miR-532-5p，但LHX5-AS1與miR-532-5p在胃癌發(fā)生過(guò)程中的作用尚未闡明。本研究旨在分析LHX5-AS1在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況，探討LHX5-AS1與miR-532-5p在胃癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用及其分子機(jī)制，以期為靶向治療胃癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑 人正常胃黏膜GES-1細(xì)胞與人胃癌SGC7901、HS-746T、MGC803、BGC823細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生科院細(xì)胞庫(kù)。miR-532-5p、陰性對(duì)照pcDNA質(zhì)粒、miR-NC、pcDNA-LHX5-AS1質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Dharmacon公司。雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒及雙熒光素酶報(bào)告基因載體[野生型(WT)-LHX5-AS1和突變型(MUT)-LHX5-AS1]購(gòu)自美國(guó)Promega公司。Lipofectamine 2000、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。MTT試劑盒和Transwell小室購(gòu)自上海東仁化學(xué)科技公司。一抗β-Tubulin、Axin2、cyclin D1、c-Myc、β-catenin及山羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)技術(shù) 采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析LHX5-AS1在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。采用Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)分析LHX5-AS1與miR-532-5p之間的相互作用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC7901、HS-746T、GES-1細(xì)胞，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MGC803、BGC823細(xì)胞。消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC7901細(xì)胞，鋪于12孔板，SGC7901細(xì)胞匯合度為50%左右時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照pcDNA質(zhì)粒、pcDNA-LHX5-AS1質(zhì)粒至SGC7901細(xì)胞，分別為對(duì)照組和LHX5-AS1組。各組于轉(zhuǎn)染4 h后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)LHX5-AS1、miR-532-5p的表達(dá)水平 使用Trizol試劑提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在PCR儀進(jìn)行qRT-PCR，LHX5-AS1以GAPDH作為內(nèi)參基因，miR-532-5p以U6作為內(nèi)參基因。LHX5-AS1上游引物為5′-TTCTAGCTCCCCTTCGCTCT-3′，下游引物為5′-GCGCAGGTTCTAAGGTGAGT-3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-532-5p上游引物為5′-CGGCCATGCCTTGAGTGTA-3′，下游引物為5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；GAPDH上游引物為5′-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3′，下游引物為5′-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3′。以2-ΔΔCt法分析LHX5-AS1與miR-532-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC7901細(xì)胞增殖能力 重懸各組SGC7901細(xì)胞，以每孔100 μL的體積接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。繼續(xù)培養(yǎng)5 d，每天相同時(shí)刻進(jìn)行檢測(cè)。分別加入MTT試劑(每孔30 μL)，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，每孔加入130 μL二甲基亞砜，混勻搖床15 min。酶標(biāo)儀設(shè)定波長(zhǎng)490 nm，分別讀取各孔的吸光度(A490)值，代表細(xì)胞增殖能力變化。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SGC7901細(xì)胞遷移能力 采用不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸各組SGC7901細(xì)胞，以每孔200 μL的體積接種Transwell上室，以每孔500 μL的體積將含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基加入Transwell下室，培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)24 h。采用甲醇試劑固定上室，采用1%結(jié)晶紫試劑染色，棉簽小心擦去未穿過(guò)底膜的SGC7901細(xì)胞。在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇6個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證LHX5-AS1與miR-532-5p之間的相互作用 將WT-LHX5-AS1和MUT-LHX5-AS1分別與miR-NC、miR-532-5p共轉(zhuǎn)染至SGC7901細(xì)胞，在培養(yǎng)箱中孵育48 h。消化收集SGC7901細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，分析各組SGC7901細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平 采用蛋白裂解液提取各組SGC7901細(xì)胞總蛋白，檢測(cè)總蛋白水平后，SDS-PAGE凝膠電泳140 min，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，10%的脫脂牛奶封閉130 min。采用一抗稀釋液按比例稀釋一抗，加入兔抗人Axin2(1∶2 000)、cyclin D1(1∶3 000)、c-Myc(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)、β-Tubulin(1∶3 000)，4 ℃孵育15 h。采用二抗稀釋液按比例稀釋二抗，加入羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育4 h。滴加電化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像儀中顯影和定影。

2 結(jié) 果

2.1LHX5-AS1在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，與癌旁組織相比，LHX5-AS1在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯下降(P<0.01)，見(jiàn)圖1。qRT-PCR檢測(cè)顯示，LHX5-AS1在人胃癌SGC7901、HS-746T、MGC803、BGC823細(xì)胞和人正常胃黏膜GES-1細(xì)胞中的表達(dá)水平分別為0.27±0.06、0.72±0.03、0.50±0.05、0.57±0.11和1.04±0.08。與GES-1細(xì)胞比較，人胃癌細(xì)胞中LHX5-AS1表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，其中LHX5-AS1表達(dá)水平降低最明顯的是SGC7901細(xì)胞(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

注：與癌旁組織比較，**P<0.01。

注：與GES-1細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2轉(zhuǎn)染pcDNA-LHX5-AS1質(zhì)粒對(duì)SGC7901細(xì)胞中LHX5-AS1表達(dá)水平的影響 qRT-PCR檢測(cè)顯示，LHX5-AS1組SGC7901細(xì)胞中LHX5-AS1表達(dá)水平為11.89±1.29，明顯高于對(duì)照組SGC7901細(xì)胞的1.23±0.40(P<0.01)，提示轉(zhuǎn)染成功。

2.3上調(diào)LHX5-AS1表達(dá)水平對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖能力的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，LHX5-AS1組SGC7901細(xì)胞A490在第2、3、4、5天均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

注：與相同時(shí)間點(diǎn)LHX5-AS1比較，*P<0.05。

2.4上調(diào)LHX5-AS1表達(dá)水平對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移能力的影響 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LHX5-AS1組和對(duì)照組SGC7901細(xì)胞遷移數(shù)分別為(52.30±14.12)個(gè)和(161.90±13.93)個(gè)，LHX5-AS1組明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)圖4。

注：A為T(mén)ranswell遷移實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果，與對(duì)照組比較，**P<0.01；B為T(mén)ranswell遷移實(shí)驗(yàn)穿膠細(xì)胞圖(100×，結(jié)晶紫染色)。

2.5生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)LHX5-AS1與miR-532-5p之間的相互作用 Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，WT-LHX5-AS1可能與miR-532-5p存在結(jié)合位點(diǎn)序列，見(jiàn)圖5。

圖5 LHX5-AS1含有與miR-532-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)驗(yàn)證LHX5-AS1與miR-532-5p之間的相互作用 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了WT-LHX5-AS1和miR-532-5p 的SGC7901細(xì)胞熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染了WT-LHX5-AS1和miR-NC的SGC7901細(xì)胞明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)圖6。

注：與miR-NC組比較，**P<0.01。

2.7上調(diào)LHX5-AS1表達(dá)水平對(duì)miR-532-5p表達(dá)水平的調(diào)控作用 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LHX5-AS1組、對(duì)照組SGC7901細(xì)胞中miR-532-5p表達(dá)水平分別為1.16±0.20、5.09±0.72，LHX5-AS1組明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.8上調(diào)LHX5-AS1表達(dá)水平對(duì)SGC7901細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，LHX5-AS1組Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白Axin2、cyclin D1、c-Myc、β-catenin表達(dá)水平較對(duì)照組均降低(P<0.01)。見(jiàn)圖7。

圖7 上調(diào)LHX5-AS1表達(dá)水平對(duì)SGC7901細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

lncRNA是RNA聚合酶Ⅱ在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其能夠在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[8-9]。有研究報(bào)道，lncRNA在癌癥組織中異常表達(dá)，與癌癥的惡性程度和患者的預(yù)后密切相關(guān)，可能成為癌癥的分子治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物[10-12]。lncRNA在胃癌中的作用成為研究熱點(diǎn)，如ADAMTS9-AS2在胃癌組織和順鉑抗性的胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，ADAMTS9-AS2過(guò)表達(dá)通過(guò)靶向miR-223-3p抑制胃癌細(xì)胞的活力和運(yùn)動(dòng)性，觸發(fā)順鉑處理后的細(xì)胞焦亡[13]；如FAM230B在胃癌細(xì)胞系中高表達(dá)且定位于細(xì)胞質(zhì)，F(xiàn)AM230B過(guò)表達(dá)能夠下調(diào)miR-27a-5p表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲并抑制細(xì)胞凋亡[14]；如LINC00659在胃癌組織中表達(dá)水平上調(diào)，與胃癌分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與患者年齡、性別和組織分化無(wú)關(guān)，LINC00659低表達(dá)患者的總生存期較高[15]。目前LHX5-AS1在胃癌中表達(dá)及對(duì)胃癌進(jìn)展的作用機(jī)制并不清楚。

本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，LHX5-AS1在胃癌組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(P<0.01)，且qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LHX5-AS1在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于人正常胃黏膜細(xì)胞(P<0.05)，提示LHX5-AS1可能在胃癌的發(fā)生過(guò)程中起到抑癌基因作用。本研究進(jìn)一步顯示，MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，LHX5-AS1組SGC7901細(xì)胞A490在第2、3、4、5天均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LHX5-AS1組SGC7901細(xì)胞遷移數(shù)明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，表明上調(diào)LHX5-AS1表達(dá)水平可降低胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖和遷移能力，進(jìn)而抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過(guò)Starbase v2.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，LHX5-AS1可能互補(bǔ)結(jié)合miR-532-5p。miR-532-5p在乳腺癌、結(jié)直腸癌等組織及細(xì)胞中高表達(dá)，相關(guān)研究表明抑制miR-532-5p表達(dá)后可降低癌癥細(xì)胞的增殖及遷移能力[16-17]。研究報(bào)道，miR-532-5p表達(dá)水平降低能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞周期，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡，miR-532-5p在胃癌發(fā)生過(guò)程中起到癌基因的作用[18-19]。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了WT-LHX5-AS1和miR-532-5p的SGC7901細(xì)胞熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染了WT-LHX5-AS1和miR-NC的SGC7901細(xì)胞明顯降低(P<0.01)，證實(shí)WT-LHX5-AS1可靶向結(jié)合miR-532-5p，且qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，上調(diào)LHX5-AS1表達(dá)水平后，胃癌SGC7901細(xì)胞中miR-532-5p表達(dá)水平明顯下下降，說(shuō)明LHX5-AS1能夠直接負(fù)性調(diào)控miR-532-5p的表達(dá)水平。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胃癌發(fā)展過(guò)程中被異常激活，并促進(jìn)胃癌的生長(zhǎng)和惡性轉(zhuǎn)化[20]。本研究顯示，LHX5-AS1負(fù)性調(diào)控miR-532-5p表達(dá)水平后，Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白Axin2、cyclin D1、c-Myc、β-catenin表達(dá)水平降低，說(shuō)明Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活受到抑制。

綜上所述，LHX5-AS1在胃癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，其能夠抑制胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖及遷移，其分子機(jī)制可能與靶向負(fù)調(diào)控miR-532-5p表達(dá)有關(guān)，LHX5-AS1可能為胃癌的防治提供新的分子靶點(diǎn)。